Die Entwicklung der Chloroquinresistenz bei Plasmodium falciparum wird durch den mutmaßlichen Aminosäuretransporter AAT1 vermittelt

Nature Microbiology (2023)Diesen Artikel zitieren

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Malariaparasiten zerlegen das Hämoglobin des Wirts in der Verdauungsvakuole in Peptide und Aminosäuren, um es zum Wachstum in das Zytoplasma des Parasiten zu transportieren: Die Unterbrechung dieses Prozesses ist für die Wirkungsweise mehrerer Antimalariamedikamente von zentraler Bedeutung. Mutationen im Chloroquin (CQ)-Resistenztransporter pfcrt, der sich in der Verdauungsvakuolenmembran befindet, verleihen Plasmodium falciparum eine CQ-Resistenz und beeinträchtigen typischerweise auch die Fitness des Parasiten. Die Rolle anderer Parasitenstandorte bei der Entwicklung der CQ-Resistenz ist jedoch unklar. Hier verwenden wir eine Kombination aus Populationsgenomik, genetischen Kreuzungen und Genbearbeitung, um zu zeigen, dass ein zweiter vakuolärer Transporter sowohl bei der Resistenz als auch bei der kompensatorischen Evolution eine Schlüsselrolle spielt. Genomische Längsschnittanalysen der gambischen Parasiten ergaben zeitliche Signaturen der Selektion auf einer mutmaßlichen Aminosäuretransporter-Variante (pfaat1) S258L, deren Häufigkeit zwischen 1984 und 2014 parallel zur pfcrt1-K76T-Variante von 0 % auf 97 % anstieg. Durch genetische Kreuzungen von Parasiten wurde dann ein quantitativer Merkmalslocus auf Chromosom 6 identifiziert, der pfaat1 enthält und durch CQ-Behandlung selektiert wird. Die Genbearbeitung zeigte, dass pfaat1 S258L die CQ-Resistenz verstärkt, allerdings auf Kosten einer verminderten Fitness, während pfaat1 F313S, ein häufiger südostasiatischer Polymorphismus, die CQ-Resistenz reduziert und gleichzeitig die Fitness wiederherstellt. Unsere Analysen offenbaren eine verborgene Komplexität in der CQ-Resistenzentwicklung, was darauf hindeutet, dass pfaat1 regionalen Unterschieden in der Dynamik der Resistenzentwicklung zugrunde liegen und die Parasitenresistenz oder -fitness modulieren kann, indem es das Gleichgewicht zwischen Aminosäure- und Arzneimitteltransport manipuliert.

Arzneimittelresistenzen bei mikrobiellen Krankheitserregern erschweren die Kontrollbemühungen. Daher ist das Verständnis der genetischen Architektur und der Komplexität der Resistenzentwicklung von entscheidender Bedeutung für die Resistenzüberwachung und die Entwicklung verbesserter Behandlungsstrategien. Im Fall von Malariaparasiten hat der Einsatz von fünf Klassen von Antimalariamedikamenten im letzten halben Jahrhundert zu gut charakterisierten harten und weichen selektiven Sweeps im Zusammenhang mit Arzneimittelresistenzen geführt, wobei sowohl die weltweite Verbreitung als auch die lokalen Resistenzursprünge Arzneimittelresistenzallee in der gesamten Welt bestimmen Verbreitungsgebiet von Plasmodium falciparum1,2,3. Die Monotherapie mit Chloroquin (CQ) spielte im letzten Jahrhundert eine zentrale Rolle in einem ehrgeizigen Plan zur Ausrottung der Malaria. Resistenzen gegen CQ wurden erstmals 1957 in Südostasien (SEA) beobachtet und verbreiteten sich ab Ende der 1970er Jahre in ganz Afrika, was zum Ende dieser ehrgeizigen weltweiten Ausrottungsbemühungen beitrug4.

Die Resistenz gegen CQ wurde intensiv untersucht. Das CQ-Resistenztransportergen (pfcrt, Chromosom (chr.) 7) wurde ursprünglich mithilfe einer genetischen Kreuzung von P. falciparum identifiziert, die zwischen einem CQ-resistenten SEA-Parasiten und einem CQ-empfindlichen südamerikanischen Parasiten durchgeführt wurde, der in einem Schimpansenwirt erzeugt wurde5,6. Zwanzig Jahre intensiver Forschung enthüllten die mechanistische Rolle des Chloroquin-Resistenztransporters (pfCRT) bei der Arzneimittelresistenz7,8, seine Lage in der Verdauungsvakuolenmembran und seine natürliche Funktion, kurze Peptide aus der Verdauungsvakuole in das Zytoplasma zu transportieren9. CQ tötet Parasiten ab, indem es die Hämoglobinverdauung in der Verdauungsvakuole stört und so die Umwandlung von Häm, einem toxischen Nebenprodukt der Hämoglobinverdauung, in inerte Hämozoinkristalle verhindert. Parasiten, die CQ-Resistenzmutationen an der pfCRT tragen, transportieren CQ aus der Nahrungsvakuole, weg vom Ort der Arzneimittelwirkung7,8. Der pfcrt-K76T-Einzelnukleotid-Polymorphismus (SNP) wird häufig als molekularer Marker für CQ-Resistenz10 verwendet, während zusätzliche Varianten innerhalb von pfcrt den Grad der Resistenz gegen CQ11 und andere Chinolin-Medikamente12 modulieren und die damit verbundenen Fitnesskosten bestimmen13. Während gezeigt wurde, dass Mutationen in einem zweiten Transporter in der Nahrungsvakuolenmembran, dem Multidrug-Resistenztransporter (pfmdr1), die CQ-Resistenz in einigen genetischen Hintergründen modulieren14, bleibt die Rolle anderer Gene bei der Entwicklung der CQ-Resistenz unklar. In diesem Artikel haben wir versucht, den Beitrag zusätzlicher Parasitenloci zur Entwicklung der CQ-Resistenz zu verstehen, indem wir eine Kombination aus Populationsgenomik, experimentellen genetischen Kreuzungen und Geneditierung eingesetzt haben.

Populationsgenomdaten in Längsrichtung können überzeugende Beweise für die Entwicklung von Arzneimittelresistenzorten liefern15. Wir führten eine Längsschnittanalyse der gesamten Genomsequenz von 600 P. falciparum-Genomen durch, die zwischen 1984 und 2014 in Gambia gesammelt wurden, um die Selektionssignaturen unter Drogendruck zu untersuchen (Ergänzungstabelle 1). Nach der Filterung unter Verwendung fehlender Genotypen (<10 %) und geringfügiger Allelhäufigkeit (> 2 %) behielten wir 16.385 biallelische SNP-Loci aus 321 Isolaten (1984 (134), 1990 (13), 2001 (34), 2008 (75) und …). 2014 (65)). Die mit der CQ-Resistenz verbundene pfcrt-K76T-Mutation stieg von 0 % im Jahr 1984 auf 88 % im Jahr 2014. Bemerkenswerterweise kam es auch bei chr zu einer schnellen Änderung der Allelfrequenz. 6: Die stärkste Differenzierung wird bei einer S258L-Mutation in einem mutmaßlichen Aminosäuretransporter, pfaat1 (PF3D7_0629500, Chr. 6), beobachtet, die im gleichen Zeitraum von 0 % auf 97 % anstieg (Abb. 1a). Unter der Annahme einer Generationszeit (Mücke zu Mücke) von 6 Monaten für Malariaparasiten wurden diese Veränderungen durch Selektionskoeffizienten von 0,18 für pfaat1 S258L und 0,11 für pfcrt K76T bestimmt (Extended Data Abb. 1). Sowohl die pfaat1-S258L- als auch die pfcrt-K76T-Mutation fehlten in den Proben von 1984, waren aber 1990 vorhanden, was darauf hindeutet, dass sie in einem kurzen Zeitfenster entstanden und sich verbreiteten. Sowohl pfaat1 als auch pfcrt zeigten in Gambia ähnliche zeitliche Haplotypstrukturen (Extended Data Abb. 2). Diese waren zwischen 1984 und 2014 durch einen fast vollständigen Ersatz gut differenzierter Haplotypen an beiden Loci gekennzeichnet. In diesem Zeitraum beobachteten wir auch große zeitliche Veränderungen in einem anderen bekannten Arzneimittelresistenz-Locus (pfdhfr) (Chr. 4)16 (Abb. 1b). . Dass diese schnellen Änderungen der Allelfrequenz bei pfcrt, pfaat1 und pfdhfr, jedoch nicht anderswo im Genom auftreten (Abb. 1b), liefert eindeutige Beweise für eine starke Richtungsselektion.

a: Zeitliche Änderung der Allelfrequenz bei SNPs, die für pfaat1 S258L und pfcrt K76T kodieren, zwischen 1984 und 2014. Die Karte und die erweiterte westafrikanische Region zeigen die Lage von Gambia. b, Bedeutung der Haplotyp-Differenzierung über zeitliche Populationen von P. falciparum-Parasiten, bestimmt mit hapFLK. Die P-Werte wurden für mehrere Tests mit der BH-Methode korrigiert. Signifikanzschwellenwerte bei −log10 (FDR-korrigierter P-Wert (False Discovery Rate)) von 5 werden durch rot gepunktete horizontale Linien angezeigt. Regionen innerhalb der oberen 1 % der FDR-korrigierten P-Werte sind mit Gensymbolen markiert. Die stärksten genomweit gesehenen Signale liegen um pfcrt, pfaat1 und pfdhfr (das an der Pyrimethaminresistenz beteiligt ist). c, IBD, quantifiziert mit der isoRelate (iR)-Statistik, für zeitliche Populationen aus Gambia. Die P-Werte wurden für mehrere Tests mit der BH-Methode korrigiert. Signifikanzschwellen bei −log10 (FDR-korrigierter P-Wert) von 5 werden durch rot gepunktete horizontale Linien angezeigt. Regionen innerhalb der oberen 1 % der FDR-korrigierten P-Werte sind mit Gensymbolen markiert. In allen Probenahmejahren wurden für Parasitenpopulationen konstant hohe IBD-Spitzen um pfcrt und pfaat1 beobachtet. Die Stichprobe von 1990 (n = 13) ist in c nicht dargestellt.

Quelldaten

Weitere Hinweise auf eine starke Selektion auf pfaat1 und pfcrt ergaben sich aus der Analyse der Identität nach Abstammung (Identity-by-Descent, IBD) in gambischen Parasitengenomen. Wir sahen die stärksten IBD-Signale im Genom um pfaat1 und pfcrt (Abb. 1c). Diese Signale sind dramatisch, da es an anderer Stelle im Genom nur minimale IBD gibt, mit Ausnahme eines starken Signals, das sich nach 2008 auf pfdhfr konzentriert. Interessanterweise wird die starke IBD in allen vier untersuchten zeitlichen Proben, einschließlich 1984, vor der Ausbreitung von pfaat1 beobachtet S258L oder pfcrt K76T. Zu diesem Zeitpunkt waren jedoch nur eine einzige synonyme Variante bei pfaat1 (I552I) und keine der CQ-resistenten assoziierten Mutantenvarianten bei pfcrt vorhanden. CQ war seit den 1950er Jahren in ganz Afrika die Erstbehandlung. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit der Möglichkeit, dass CQ-gesteuerte selektive Sweeps vor 1984 eine CQ-Resistenz auf niedrigem Niveau verliehen und möglicherweise auf Promotorregionen von Resistenz-assoziierten Genen abzielten. pfaat1 wurde auch an anderen Standorten weltweit selektiert: Dies geht aus früheren Populationsgenomanalysen aus Afrika17, Südostasien18 und Südamerika (SM)19 hervor. Diagramme, die IBD in diesen Regionen zusammenfassen, finden Sie in der erweiterten Datenabbildung 3.

Muster des Bindungsungleichgewichts (LD) liefern weitere Beweise für die funktionelle Verknüpfung zwischen pfcrt und pfaat1. Das stärkste genomweite Signal der interchromosomalen LD wurde zwischen diesen beiden Loci sowohl in unseren gambischen Daten (ergänzende Abbildung 1) als auch in Proben aus ganz Afrika gefunden. Die LD zwischen pfaat1 und pfcrt war 2001 am stärksten und nahm dann 2008 und 2014 ab (ergänzende Abbildungen 1 und 2), was mit der Aufrechterhaltung der LD während intensiver CQ-Nutzung und dem anschließenden LD-Abfall nach Ersetzen der CQ-Monotherapie durch Sulfadoxin-Pyrimethamin + übereinstimmt CQ-Kombinationen im Jahr 2004 und dann mit Artemisinin-Kombinationen im Jahr 2008 (Lit. 16).

Korrelationen in den Allelfrequenzen werden zwischen pfcrt und pfaat1 erwartet, wenn diese Loci interagieren oder gemeinsam ausgewählt werden. Die Häufigkeiten des CVIET-Haplotyps für die Aminosäuren 72–76 in pfCRT korrelieren signifikant mit den Allelhäufigkeiten von pfaat1 S258L in Westafrika (WAF) (R2 = 0,65, P = 0,0017) und in allen afrikanischen Populationen (R2 = 0,44, P = 0,0021). ) (Erweiterte Daten Abb. 4). Diese Analyse untermauert das Argument für eine Koevolution oder Epistase zwischen diesen beiden Genen weiter.

Wir untersuchten die Haplotypstruktur von pfaat1 aus P. falciparum-Genomen (MalariaGEN-Version 6 (Lit. 21)) (Abb. 2 und Ergänzungstabelle 2). Der SNP pfaat1 S258L kommt in SEA häufig vor (58 %), wird jedoch auf divergierenden flankierenden Haplotypen gefunden, was auf einen unabhängigen Ursprung vom pfaat1 S258L in Gambia und anderswo in Afrika hindeutet (Abb. 2c, d und erweiterte Daten Abb. 5). Hendon et al.18 kamen für den Chr. zum gleichen Schluss. 6-Region mithilfe einer IBD-Analyse von Parasiten aus globalen Standorten. Die konvergente Evolution von pfaat1 S258L liefert weitere Beweise für die Selektion und steht im Gegensatz zu pfcrt und pfdhfr, wo Resistenzallele, die sich in Afrika ausbreiteten, einen asiatischen Ursprung hatten1,2. Die Entwicklung von pfaat1 ist in SEA komplexer als anderswo auf der Welt. Es gibt drei weitere häufig abgeleitete Aminosäureveränderungen in SEA. pfaat1 F313S hat sich in SEA nahe der Fixierung ausgebreitet (insgesamt 96 %, FST = 0,91 im Vergleich zu afrikanischen Proben), gepaart mit pfaat1 S258L (55 %), Q454E (15 %) oder K541N (22 %). Die Paarung von F313S mit drei verschiedenen Mutationen legt nahe, dass F313S zuerst entstand. Wir spekulieren, dass diese geografisch lokalisierten pfaat1-Haplotypen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der CQ-Resistenz in SEA gespielt haben und auch geografische Unterschiede in der historischen Verwendung anderer Chinolin-Medikamente (Mefloquin, Chinin, Piperaquin und Lumefantrin) in dieser Region widerspiegeln könnten22.

a, Globale Verteilung von pfaat1-Allelen. b, Vergleichbare Karten, die Prozentsätze der pfcrt-Haplotypen für die Aminosäuren 72–76 zeigen. Die farbigen Segmente zeigen die wichtigsten pfcrt-Haplotypen, die bei der K76T-Mutation variieren. Wir haben den Datensatz aus MalariaGEN Release 6 für die Analyse der pfaat1- und pfcrt-Allelhäufigkeit verwendet. Die für die Abbildung verwendeten Daten sind in der Ergänzungstabelle 2 enthalten. Es wurden nur Proben mit monoklonalen Infektionen (N = 4.051) einbezogen (1.233 aus Westafrika (WAF), 415 aus Ostafrika (EAF), 170 aus Zentralafrika (CAF), 994 aus Ost-Südostasien (ESEA), 998 aus West-Südostasien (WSEA), 37 aus Südasien (SA), 37 aus Südamerika (SM) und 167 aus der Pazifischen Ozeanregion (PO)). c, d, MSNs von Haplotypen, gefärbt durch pfaat1-Allel (c) bzw. geografische Lage (d). Netzwerke wurden aus 50-kb-Genomregionen konstruiert, die durch pfaat1 (25 kb stromaufwärts und stromabwärts) zentriert sind. Dies erstreckt sich über die Genomregionen, die LD um pfaat1 zeigen (ergänzende Abbildung 2). Insgesamt wurden 581 Genome mit der höchsten Sequenzabdeckung zur Generierung verwendet Netzwerk. Die Netzwerke wurden auf der Grundlage von 1.847 SNPs (mindestens eine Mutante im vollständigen Datensatz – MalariaGEN Release 6) erstellt. Die Kreisgröße gibt die Anzahl der dargestellten Proben an (kleinste 1; größte 87). Haplotypen aus derselben Region ( Asien oder Afrika) wurden geclustert, was auf einen unabhängigen Ursprung der pfaat1-Allele hinweist.

Genetische Kreuzungen von P. falciparum können mit chimären Mäusen aus menschlicher Leber erreicht werden, wodurch dieses leistungsstarke Werkzeug für die Malariagenetik wiederbelebt und verbessert wird23,24, nachdem die Verwendung von Menschenaffen für Forschungszwecke verboten wurde. Wir verwendeten zwei unabhängige biologische Replikate einer Kreuzung zwischen dem CQ-empfindlichen afrikanischen Parasiten 3D7 und einem kürzlich isolierten CQ-resistenten Parasiten von der Grenze zwischen Thailand und Myanmar, NHP4026 (Ergänzungstabelle 3). Anschließend verglichen wir die genomweiten Allelhäufigkeiten in CQ-behandelten und kontrollbehandelten Nachkommenpools, um quantitative Trait-Loci (QTL) zu identifizieren (Ergänzungstabelle 4). Diese Bulk-Segregant-Analyse (BSA)25 von Nachkommenparasiten identifizierte den Chr. zuverlässig. 7-Locus, der wie erwartet pfcrt enthält, was unseren Ansatz bestätigt (Abb. 3a und ergänzende Abb. 3 und 4). Wir waren auch fasziniert, einen signifikanten QTL auf chr zu sehen. 6 in jeder der Replikatkreuzungen (Abb. 3, ergänzende Abb. 3 und 4 und erweiterte Daten Abb. 6). Wir priorisierten Gene innerhalb des 95 %-Konfidenzintervalls jedes QTL (Ergänzungstabelle 5), indem wir die SNPs und Indels untersuchten, die die beiden Eltern unterschieden (Ergänzungstabelle 6). Der Chr. 6 QTL erstreckten sich von 1.013 kb bis 1.283 kb (270 kb) und enthielten 60 Gene. Davon werden 54 in Blutstadien exprimiert und 27 weisen nicht-synonyme Mutationen auf, die 3D7 von NHP4026 unterscheiden. pfaat1 befand sich auf dem Höhepunkt des Chr. 6 QTL (Abb. 3c). NHP4026 trug zwei abgeleitete nicht-synonyme Mutationen in pfaat1 (S258L und F313S) im Vergleich zu 3D7, das das angestammte Allel trägt. Wir stellten daher die Hypothese auf, dass einer oder beide dieser pfaat1-SNPs den Chr-Antrieb steuern könnten. 6 QTL.

a: Allelfrequenzdiagramme im gesamten Genom vor und nach der CQ-Behandlung. Linien mit derselben Farbe zeigen Ergebnisse aus technischen Replikaten an. b, QTLs, identifiziert mit dem G′-Ansatz. Linien mit derselben Farbe zeigen Ergebnisse aus technischen Replikaten an. a und b umfassen Ergebnisse von BSA mit 48-stündiger CQ-Behandlung mit Proben, die am Tag 4 entnommen wurden. Für die vollständige BSA zu verschiedenen Zeitpunkten der Sammlung und Dauer der medikamentösen Behandlung unter verschiedenen CQ-Konzentrationen siehe ergänzende Abbildungen. 3 und 4. c, Feinkartierung des Chr. 6 QTL. Die 95 %-Konfidenzintervalle (CIs) wurden aus den mit 250 nM CQ behandelten Proben berechnet, einschließlich Daten aus verschiedenen Sammelzeitpunkten (Tag 4 für 48-stündige CQ-Behandlung und Tag 5 für 96-stündige CQ-Behandlung), Pools (Pool 1 und Pool 2). ) und Dauer der medikamentösen Behandlung (48 h und 96 h). Ein heller Cyan-Schatten zeigt die Grenzen der zusammengeführten CIs aller QTLs. Jede Zeile gibt einen QTL an; Die schwarze gestrichelte Linie zeigt den Schwellenwert für die QTL-Erkennung an (G′ = 20). Die vertikale rote gestrichelte Linie zeigt den Standort von pfaat1 an.

Wir haben einzelne Klone aus der Masse der 3D7 × NHP4026 F1-Nachkommen isoliert, um Klone mit allen Kombinationen von Elternallelen am Chr. zu gewinnen. 6 und Chr. 7 QTL-Loci. Wir haben Parasiten sowohl aus einer CQ-selektionierten Massennachkommenkultur (96 h bei 250 nM CQ) als auch aus einer Kontrollkultur geklont. Dadurch entstanden 155 klonale Nachkommen: 100 aus der CQ-selektierten Kultur, von denen 62 genetisch einzigartig waren, und 55 aus der unbehandelten Kontrollkultur, von denen 47 einzigartig waren (Abb. 4a). Wir verglichen die Allelhäufigkeiten zwischen diesen beiden Nachkommenpopulationen (Abb. 4b) und zeigten signifikante Unterschiede bei beiden Chr. 6 und Chr. 7 QTL-Regionen, parallel zu den BSA-Ergebnissen. Wir beobachteten eine dramatische Erschöpfung des CQ-resistenten Allels NHP4026 am Chr. 7 QTL in kontrollbehandelten Kulturen, was mit einer starken Selektion gegen CQ-resistente pfcrt-Allele ohne CQ-Selektion vereinbar ist. Umgekehrt trugen alle nach der CQ-Behandlung isolierten Nachkommen das CQ-resistente pfcrt-Allel NHP4026. Die Vererbung des pfcrt-Locus (Chr. 7) und des pfaat1-Locus (Chr. 6) war in den isolierten Klonen eng miteinander verknüpft (Abb. 4c). Um weiter zu untersuchen, ob die Kreuzdaten mit Epistase oder Co-Selektion übereinstimmten, untersuchten wir eine größere Stichprobe rekombinanter Klone, die aus fünf unabhängigen Iterationen dieser genetischen Kreuzung ohne CQ-Selektion isoliert wurden. Dies zeigte eine signifikante Unterrepräsentation von Klonen mit den Genotypen pfcrt 76T und pfaat1 258S/313F (WT) (Ergänzungstabelle 7, χ2 = 12,295, P = 0,0005). Diese Ergebnisse stimmen mit der in der Natur beobachteten starken LD zwischen diesen Loci überein (Extended Data Abb. 4 und Supplementary Abb. 1)20 und legen eine funktionelle Beziehung zwischen den beiden Loci nahe. Eine mögliche Erklärung für die beobachteten Ergebnisse ist die Rolle von pfaat1 S258L/F313S beim Ausgleich der verminderten Fitness von Parasiten, die pfcrt K76T tragen.

a, Allelvererbung von 109 einzigartigen rekombinanten Nachkommen. Schwarze und rote Blöcke zeigen getrennt Allele von 3D7 und NHP4026 an. Vertikale graue Linien zeigen Nicht-Kernregionen, in denen keine SNPs genotypisiert wurden. Links: Aus rekombinanten Nachkommenpools mit oder ohne CQ-Behandlung isolierte Klone sind markiert. Rechts: pfaat1- und pfcrt-Allele sind beschriftet. WT zeigt pfaat1- und pfcrt-Allele von 3D7 an und MUT zeigt Allele von NHP4026 an. Die Position von pfaat1 und pfcrt ist mit schwarzen Dreiecken oben auf dem Bedienfeld markiert. b: Genomweites 3D7-Allelfrequenzdiagramm einzigartiger Nachkommen, die aus Pools nach 96-stündiger CQ-Behandlung (250 nM) (blau) oder aus Kontrollpools (gold) geklont wurden. c, Verknüpfung zwischen Loci auf verschiedenen Chromosomen, gemessen mit dem exakten Fisher-Test. Die gepunktete vertikale Linie markiert die Bonferroni-korrigierte Signifikanzschwelle (einseitig), während die rot dargestellten Punkte Vergleiche zwischen SNPs sind, die pfaat1 und pfcrt flankieren. Ergänzende Tabelle 7 zeigt nicht zufällige Assoziationen zwischen Genotypen in Parasitenklonen, die aus unbehandelten Kulturen gewonnen wurden.

Als nächstes haben wir in vitro die Werte der halbmaximalen Hemmkonzentration (IC50) von CQ für 18 Parasiten (eine Gruppe von 16 Nachkommen und beide Elternteile) gemessen, die alle Kombinationen des chr tragen. 6 und Chr. 7 QTL-Allele (Ergänzungsabbildung 5 und Ergänzungstabelle 8). Der NHP4026-Elternteil war der getestete Parasit mit der höchsten CQ-Resistenz. Alle Nachkommen, die NHP4026 pfcrt geerbt hatten, zeigten einen CQ-resistenten Phänotyp, während alle Nachkommen, die 3D7 pfcrt geerbt hatten, CQ-sensitiv waren, was mit früheren Berichten übereinstimmt. Die Wirkung von pfcrt-Allelen auf die CQ-Resistenz des Parasiten war auf der Grundlage einer Zwei-Wege-Varianzanalyse signifikant (P = 7,52 × 10−11). Wir sahen keinen Einfluss der pfaat1-Genotypen auf die IC50-Werte in Klonen, die pfcrt 76T (P = 0,06) oder pfcrt 76K (P = 0,19) trugen. Diese Analyse hat eine begrenzte Aussagekraft, da nur zwei Nachkommenparasiten mit pfaat1 258S/313F (WT) in Kombination mit pfcrt 76T gewonnen wurden (Abb. 4a und ergänzende Abb. 5), stimmt jedoch damit überein, dass der pfaat1-QTL in unserem Fall von der Parasitenfitness abhängt genetische Kreuzungen. Wir haben uns daher auf die Genmanipulation isogener Parasiten zur Funktionsanalyse konzentriert.

Wir nutzten die CRISPR-Cas9-Modifikation des CQ-resistenten Elternteils NHP4026, um die Auswirkungen von Mutationen in pfaat1 auf die CQ-IC50-Arzneimittelreaktion und die Parasitenfitness zu untersuchen (Abb. 5). NHP4026 pfaat1 trägt im Vergleich zum empfindlichen 3D7-Elternteil die beiden häufigsten nicht-synonymen SEA-Änderungen (S258L und F313S) (Abb. 2). Wir haben diese Positionen sowohl einzeln als auch in Kombination wieder in den angestammten Zustand zurückversetzt und die Modifikationen in drei bis fünf Klonen bestätigt, die aus unabhängigen Bearbeitungen für jede Alleländerung isoliert wurden (Abb. 5a). Anschließend ermittelten wir die CQ-IC50-Werte und maßen die Fitness mithilfe paarweiser Konkurrenzexperimente für das elterliche NHP4026258L/313S, die Einzelmutationen NHP4026258L/313F, NHP4026258S/313S und das angestammte Allel NHP4026258S/313F. Dies zeigte einen hochsignifikanten Einfluss der S258L-Mutation, die die CQ-IC50-Werte um das 1,5-fache erhöhte, und einen moderateren, aber signifikanten Einfluss von F313S und der Doppelmutation (S258L/F313S) im Vergleich zum angestammten Allel (258S/313F) ( Abb. 5b). Die Beobachtung, dass 258L in Kombination mit der F313S-Mutation reduzierte IC50-Werte aufweist, zeigt eine epistatische Interaktion zwischen diesen Aminosäurevarianten (Abb. 5b).

a, CRISPR-Cas9-Genbearbeitung. Beginnend mit dem NHP4026-Elternteil haben wir alle Kombinationen der SNP-Zustände bei pfaat1 generiert. b, Arzneimittelreaktion. Jeder Punkt zeigt eine wiederholte IC50-Messung an: Wir verwendeten zwei bis vier unabhängige CRISPR-bearbeitete Klone für jeden untersuchten Haplotyp. Die Anzahl der biologischen Replikate wird über der x-Achse angezeigt. Wir führten paarweise t-Tests (zweiseitig) durch, um die IC50-Werte zwischen Parasitenlinien zu vergleichen, ohne Anpassung für mehrere Vergleiche. Haplotypen werden auf der x-Achse angezeigt, wobei abgeleitete Aminosäuren rot dargestellt sind. Balken zeigen Mittelwerte ± Standardabweichung, während signifikante Unterschiede zwischen Haplotypen markiert sind. c, Fitness. Die Balken zeigen die mittlere relative Fitness (±1 Sem), gemessen in wiederholten Wettkampfexperimenten, und Punkte stellen die Fitness aus einzelnen Messungen dar. Wir führten drei unabhängige Konkurrenzexperimente für jede editierte Parasitengruppe in Abwesenheit von CQ durch. Die F-Statistik wurde verwendet, um die Fitness zwischen Parasitenlinien zu vergleichen. Die Ergebnisse der Tests für jede bearbeitete Gruppe wurden mithilfe von Metaanalysen mit zufälligen Effekten kombiniert. Informationen zu Allelfrequenzänderungen für jedes Konkurrenzexperiment finden Sie in der erweiterten Datenabbildung 10. NS, nicht signifikant.

Quelldaten

Wir untersuchten auch die Wirkung der S258L- und F313S-Substitutionen auf die Reaktionen auf andere Chinolin-Medikamente. Die Ergebnisse zeigten signifikante Auswirkungen von pfaat1-Substitutionen auf die IC50-Reaktionen von Chinin, Amodiaquin und Lumefantrin und keine Auswirkungen auf die IC50 von Mefloquin (Erweiterte Daten, Abb. 7). Bemerkenswert ist, dass diese IC50-Wertverschiebungen deutlich unter dem mit klinischer Resistenz verbundenen Schwellenwert lagen. Obwohl Mutationen in pfaat1 subtile Auswirkungen auf eine Reihe von Verbindungen haben können, stimmen diese Ergebnisse damit überein, dass die CQ-Behandlung die primäre selektive Kraft war, die die pfaat1-S258L- und F313S-Mutationen zusammen mit denen in pfcrt hervorrief.

Mutationen, die eine Arzneimittelresistenz hervorrufen, verursachen ohne medikamentöse Behandlung häufig Fitnesskosten. Daher untersuchten wir die Parasitenfitness, indem wir paarweise Konkurrenzexperimente mit dem Elternparasiten NHP4026 gegen die gleichen mutierten pfaat1-Parasiten durchführten, die oben erstellt wurden. Dabei zeigten sich deutliche Unterschiede in der Fitness (Abb. 5c). Das 258L/313F-Allel, das in Gambia einen selektiven Sweep zeigte, war von allen Genotypen am wenigsten fit, das angestammte Allel (258S/313F), das vom 3D7-Elternteil getragen wurde, war am besten fit, während die 258S/313S-Mutation eine ähnliche Fitness wie das 258L/313F-Allel zeigte NHP4026-Elternteil (258L/313S). Diese Ergebnisse zeigten auch starke epistatische Wechselwirkungen bei der Fitness. Während das 258L/313F-Allel, das hohe CQ-IC50-Werte verlieh (Abb. 5b), einen starken Fitnessverlust aufwies (Abb. 5c), wurde die Fitness teilweise durch die 313S-Mutation im 258L/313S-Allel, das in SEA vorherrscht, wiederhergestellt. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die pfaat1-S258L-Substitution einen 1,5-fachen Anstieg der CQ-Resistenz untermauert, der wahrscheinlich zu ihrer selektiven Ausbreitung in Gambia geführt hat. Allerdings ist S258L mit hohen Fitnesskosten verbunden, die bei SEA-Parasiten wahrscheinlich durch die Substitution F313S gemildert wurden. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse einen großen Effekt von pfaat1-Mutationen auf die Fitness von Parasiten, die pfcrt-K76T-Resistenzallele tragen.

Die Editierungsexperimente zeigen, dass Klone, die das angestammte pfaat1-Allel in Kombination mit pfcrt K76T tragen, die höchste Fitness aufweisen. Im Gegensatz dazu zeigte die enge Assoziation von pfaat1 S258L/F313S mit pfcrt K76T in Nachkommen aus den genetischen Kreuzungen die gegenteilige Beziehung. Wir spekulieren, dass diese gegensätzlichen Ergebnisse den unterschiedlichen Selektionsdruck bei Parasiten im Blutstadium im Fall von CRISPR-Experimenten oder im Mücken- und Leberstadium des Lebenszyklus im Fall von genetischen Kreuzungen widerspiegeln könnten. Die Geneditierungsstudien wurden mit einem einzelnen SEA-Parasiten-Genotyp (NHP4026) durchgeführt. Während afrikanische pfcrt-CQR-Allele aus SEA stammen und einen gemeinsamen Vorfahren und eine gemeinsame Identität bei den Aminosäuren 72–76 haben, tragen die meisten SEA-Parasiten (einschließlich NHP4026) eine oder zwei zusätzliche Mutationen in pfcrt (N326S und I356T), die mit höheren CQ-IC50-Werten verbunden und reduziert sind Fitness13,26. Der vorherrschende pfcrt-Haplotyp in Gambia unterscheidet sich von NHP4026 in einer Aminosäure und trägt die angestammte 326S-Mutation, während NHP4026 die 326N-Mutation trägt13. In zukünftigen Arbeiten wird es wichtig sein, die Auswirkung von pfaat1-Mutationen auf den genetischen Hintergrund Afrikas zu untersuchen.

Um besser zu verstehen, wie pfaat1 S258L den Phänotyp des Parasiten beeinflusst, verwendeten wir ein heterologes Hefe-Expressionssystem. WT pfaat1 wird in der Plasmamembran der Hefe exprimiert27, wo es die Chinin- und CQ-Aufnahme erhöht, was zu einer Empfindlichkeit gegenüber Chinolin-Arzneimitteln führt, was zu einem verringerten Wachstum führt. Zuvor wurde gezeigt, dass die Aufnahme von CQ durch die aromatische Aminosäure Tryptophan kompetitiv gehemmt wird, was auf eine Rolle von pfaat1 beim Arzneimittel- und Aminosäuretransport schließen lässt27. Wir exprimierten daher pfaat1 S258L in Hefe, was das Hefewachstum in Gegenwart hoher CQ-Spiegel wiederherstellte (Extended Data Abb. 8). Interessanterweise verhindert die Expression einer anderen Aminosäurevariante (T162E), die für die CQ-Resistenz bei Nagetier-Malariaparasiten (Plasmodium chabaudi)28 verantwortlich ist, auch die Akkumulation von Chinolin-Arzneimitteln in Hefezellen und stellt das Zellwachstum in Gegenwart von 1 mM CQ27 wieder her. Zusammengenommen legen diese neuen und veröffentlichten Ergebnisse nahe, dass die Hefeexpression von pfaat1-Mutationen die Widerstandskraft und Fitness beeinflusst, indem sie die Geschwindigkeit des Aminosäure- und Chinolintransports verändert.

Wir haben dreidimensionale Strukturmodelle basierend auf der 3D7 PfAAT1-Aminosäuresequenz mit AlphaFold29 und I-TASSER30 ausgewertet (Extended Data Abb. 9). Während pfCRT 10 membrandurchspannende Helices31 hat, hat pfAAT1 11; Dies wurde mit dem sequenzbasierten Membrantopologie-Vorhersagetool TOPCONS32 bestätigt. Die häufigen pfAAT1-Mutationen S258L, F313S und Q454E befinden sich in membrandurchspannenden Domänen, während sich K541L in einer Schleife befindet, die die Domänen 9 und 10 verbindet. Der Ort dieser hochfrequenten nicht-synonymen Veränderungen in membrandurchspannenden Domänen weist starke Parallelen zu pfCRT auf Evolution31 und steht im Einklang mit einer funktionellen Rolle dieser Aminosäuren bei der Transporterfunktion.

Die Identifizierung von pfcrt als Hauptdeterminante der CQ-Resistenz war ein Durchbruch, der die Forschungslandschaft zur Resistenz gegen Malaria veränderte, aber der Beitrag zusätzlicher genetischer Faktoren zur Entwicklung und Aufrechterhaltung der CQ-Resistenz blieb unklar26,33. Durch die Kombination einer längsschnittlichen Analyse des Populationsgenoms, die sich über die Entstehung der CQ-Resistenz in Gambia erstreckt, der Analyse von Massenpopulationen und Nachkommen aus kontrollierten genetischen Kreuzungen sowie der funktionellen Validierung unter Verwendung von P. falciparum und Hefe finden wir überzeugende Beweise dafür, dass es einen zweiten Locus, pfaat1, gegeben hat eine wichtige Rolle bei der Entwicklung der CQ-Resistenz. Diese leistungsstarke Kombination von Ansätzen ermöglichte es uns, kritische pfaat1-Varianten zu untersuchen, die zur Architektur der CQ-Resistenz und den Wechselwirkungen zwischen pfcrt und pfaat1 beitragen.

Unsere Ergebnisse liefern überzeugende Beweise, die unterschiedliche Beobachtungen aus mehreren Systemen konsolidieren und auf eine Rolle von pfaat1 bei der Entwicklung von Arzneimittelresistenzen schließen lassen. Beim Nagetier-Malariaparasiten P. chabaudi wurde festgestellt, dass eine Mutation (T162E) im orthologen Gen (pcaat1) eine Determinante für eine niedrige CQ-Resistenz bei im Labor entwickelter Resistenz ist28. In genomweiten Assoziationsstudien von P. falciparum war die S258L-Mutation von pfaat1 mit einer CQ-Resistenz in Feldisolaten verbunden, die entlang der Grenze zwischen China und Myanmar gesammelt wurden34, während pfcrt K76T und pfaat1 S258L die stärkste LD zwischen physikalisch nicht verknüpften Chromosomen im gesamten Genom aufweisen20. Darüber hinaus wurden Mutationen in pfaat1 mit der In-vitro-Resistenzentwicklung von P. falciparum gegen drei verschiedene Arzneimittelgerüste in Verbindung gebracht35. Frühere Arbeiten identifizierten starke Signaturen der jüngsten Selektion bei Parasiten in Afrika in Regionen rund um pfcrt, pfaat1 und andere Arzneimittelresistenzorte16,17,36; Ähnliche Selektionssignaturen sind in Asien und SM zu beobachten18,19, während pfaat1 in einer Liste von P. falciparum-Genen hervorgehoben wurde, die eine extreme geografische Differenzierung aufweisen21.

Die unterschiedlichen pfaat1-Haplotypen in Afrika und Asien könnten teilweise für die gegensätzliche Entwicklung der CQ-Resistenz auf diesen beiden Kontinenten verantwortlich sein. CQ-resistente Parasiten, die sowohl pfcrt K76T als auch pfaat1 S258L tragen, verbreiteten sich in ganz Afrika, doch nach der Abschaffung von CQ als Mittel der ersten Wahl ging die Prävalenz CQ-resistenter Parasiten in vielen Ländern zurück37,38,39. Dies steht im Einklang mit der geringen Fitness von Parasiten, die pfcrt K76T und pfaat1 S258L tragen, ohne Medikamentendruck und mit der intensiven Konkurrenz innerhalb der Malariaparasiteninfektion in Afrika40.

Im Gegensatz dazu blieb pfcrt K76T in vielen SEA-Ländern bei oder nahe der Fixierung21,41 (Abb. 2). An der Grenze zwischen Thailand und Myanmar ist die CQ-Resistenz seit 1995 stabil geblieben, als CQ als Erstbehandlung gegen P. falciparum-Malaria entfernt wurde41. Unsere pfaat1-Mutageneseergebnisse zeigen, dass Parasiten, die pfaat1 258L/313S tragen, im Vergleich zu pfaat1 258L/313F verringerte IC50-Werte, aber eine erhöhte Fitness aufweisen. Wir spekulieren, dass die Wiederherstellung der Fitness durch F313S dazu beitragen könnte, die Beibehaltung von CQ-resistenten pfcrt-K76T-Allelen in SEA zu erklären. Die alternative Hypothese – dass hohe Häufigkeiten von F313S-Mutationen durch den weit verbreiteten Einsatz anderer Chinolin-Partnermedikamente in SEA42 verursacht werden – wird nicht unterstützt, da wir nur geringe Auswirkungen dieser Substitution auf die Reaktion auf Lumefantrin, Chinin, Mefloquin und Amodiaquin sehen (Extended Data Abb . 7).

Mutationen in pfcrt verleihen CQ-Resistenz, indem sie den Ausfluss von CQ durch die Verdauungsvakuolenmembran weg von seinem Wirkort ermöglichen8. pfAAT1 befindet sich auch in der Verdauungsvakuolenmembran35, wo es wahrscheinlich als bidirektionaler Transporter aromatischer Aminosäuren fungiert9,43. Angesichts der strukturellen Ähnlichkeit von Chinolin-Arzneimitteln und aromatischen Aminosäuren können pfaat1-Mutationen die Fähigkeit von pfAAT1 zum Transport von CQ und/oder Aminosäuren modulieren27,43. Die pfaat1-S258L-Mutation könnte die Resistenz verstärken, indem sie entweder den Ausfluss von CQ aus der Verdauungsvakuole erhöht oder die Eintrittsrate in die Vakuole verringert. Angesichts der Tatsache, dass diese pfaat1-Mutation den Eintritt von Chinolin-Arzneimitteln in Hefezellen blockiert, wenn sie heterolog in der Hefezellmembran exprimiert werden27, nehmen wir an, dass die pfaat1-S258L-Mutation die CQ-Aufnahme in die Nahrungsvakuole verringert (Abb. 6). Unsere Mutageneseanalysen zeigen, dass das S258L-Allel einen hohen Fitnessaufwand verursacht, möglicherweise aufgrund einer verringerten Kapazität für den Aminosäuretransport aus der Vakuole. Interessanterweise ergab der Vergleich des in unserer genetischen Kreuzung segregierenden pfaat1-S258L/F313S-Haplotyps mit dem durch Genbearbeitung erzeugten WT-pfaat1-Allel nur geringfügige Erhöhungen der IC50-Werte und begrenzte Verringerungen der Fitness. Dies steht im Einklang mit der F313S-Mutation, die die natürliche pfaat1-Funktion des Aminosäuretransports wiederherstellt, wodurch osmotischer Stress und Hunger reduziert und gleichzeitig teilweise auch die CQ-Resistenz reduziert wird (Abb. 6). Dass dieser Haplotyp in SEA eine hohe Häufigkeit erreicht hat, könnte zur Aufrechterhaltung der pfcrt-K76T-Allele lange nach der Entfernung von CQ als Erstlinienmedikament beitragen. Dieses Modell (Abb. 6) liefert eine Arbeitshypothese, die in zukünftigen Arbeiten zur Untersuchung der Rolle von pfAAT1 und pfCRT getestet werden kann.

pfCRT (rot) und pfAAT1 (blau) befinden sich beide in der Membran der Verdauungsvakuole (DV). a, WT pfCRT und pfAAT1 transportieren Peptide bzw. aromatische Aminosäuren sowie CQ. b: pfCRT K76T exportiert CQ aus dem DV weg von seinem Wirkungsort, was zu einer erhöhten Resistenz führt, transportiert jedoch Peptide ineffizient, was zu einem Fitnessverlust führt. c: pfAAT1 S258L verringert den Eintritt von CQ in das DV, was zu einer erhöhten Resistenz führt, der Aminosäurefluss wird jedoch beeinträchtigt, was zu einem Fitnessverlust führt. d: Die Doppelmutation pfAAT1 S258L/F313S erhöht den CQ-Zustrom im Vergleich zu S258L allein, aber die Aminosäuretransportfunktion wird wiederhergestellt, was zu verringerten IC50-Werten und erhöhter Fitness ohne medikamentöse Behandlung führt.

Unsere Ergebnisse offenbaren eine verborgene Komplexität in der Entwicklung der CQ-Resistenz: Die medikamentöse Behandlung hat globale selektive Bewegungen vorangetrieben, die auf Mutationen in einem zusätzlichen Transporter (pfAAT1) in der Verdauungsvakuolenmembran von P. falciparum wirken, die das Gleichgewicht zwischen Nährstoff- und Arzneimitteltransport feinabstimmen und Beweise liefern für Epistase und Kompensation und wirkt sich sowohl auf die Arzneimittelresistenz als auch auf die Fitness aus.

Die Studie wurde in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der US-amerikanischen National Institutes of Health (NIH) durchgeführt. Das Seattle Children's Research Institute (SCRI) verfügt über eine Zusicherung des Public Health Service durch das Office of Laboratory Animal Welfare für die von seinem Institutional Animal Care and Use Committee genehmigten Arbeiten. Alle in dieser Studie durchgeführten Arbeiten wurden vom SCRI Institutional Animal Care and Use Committee speziell geprüft und genehmigt.

Das Projektdesign ist in der ergänzenden Abbildung 6 zusammengefasst. Kurz gesagt verwenden wir (1) Populationsgenomanalysen, (2) genetische Kreuzungen und quantitative Genetikanalysen, gefolgt von (3) Funktionsanalysen, um die Rolle zusätzlicher Loci bei der CQ-Resistenz zu untersuchen.

Mit P. falciparum infizierte Blutproben, die 1984 und 2001 in Zentral- (Farafenni) und Küstengambia (Serrekunda) gesammelt wurden, wurden im Wellcome Trust Sanger Institute auf Vollblut-DNA und P. falciparum-Genome untersucht und einer Tiefensequenzierung unterzogen. Daten von Isolaten, die 2008 und 2014 an der Küste Gambias gesammelt wurden, wurden bereits zuvor veröffentlicht44,45 (Ergänzungstabelle 1). Vor der Sequenzierung wurden die P. falciparum-Genome aus der Vollblut-DNA jeder Probe aus den Jahren 1984 und 2001 mithilfe der selektiven Gesamtgenom-Amplifikation (WGA) amplifiziert und dann auf der Illumina HiSeq-Plattform sequenziert (Paired-End-Reads)46. Die Lesevorgänge wurden mithilfe von bwa mem (http://bio-bwa.sourceforge.net/) auf das Referenzgenom von P. falciparum 3D7 abgebildet. Zuordnungsdateien (Binary Alignment Map) wurden mit Picard Tools v2.0.1 (http://broadinstitute.github.io/picard/) sortiert und dedupliziert, und SNP und Indel wurden mit GATK HaplotypeCaller (https://software.broadinstitute) aufgerufen. org/gatk/) nach Best Practices (https://www.malariagen.net/data/pf3K-5). Dateien im Variant Call Format (VCF) wurden nach Chromosom generiert, mit bcftools (https://samtools.github.io/bcftools/bcftools.html) zusammengeführt und mit vcftools (https://vcftools.sourceforge.net/) gefiltert. Nach der Filterung wurden nur biallelische SNP-Varianten mit einem VQSLOD-Score von ≥2, einer Kartenqualität >30 und unterstützten ≥5 Lesevorgängen pro Allelvariante beibehalten. SNPs mit einer geringen Allelhäufigkeit <2 % wurden aus unserer Analyse entfernt. Wir haben auch Proben entfernt, bei denen mehr als 10 % der Genotypen fehlten. Im endgültigen Datensatz gab es insgesamt 16.385 biallelische SNP-Loci und 321 Isolate (1984 (134), 1990 (13), 2001 (34), 2008 (75) und 2014 (65)). Die Komplexität der Infektion (monogenomisch oder polygenomisch) wurde als Inzuchtkoeffizient Fws aus der zusammengeführten VCF-Datei unter Verwendung des R-Pakets Biomix geschätzt. Die analysierten Short-Read-Sequenzdaten sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt.

Für jede Probe mit einer Infektionskomplexität von mehr als 1 wurde das Allel mit den meisten Lesevorgängen für gemischte Allel-Genotypen beibehalten, um einen virtuellen haploiden Genomvariationsdatensatz zu erstellen. Allelhäufigkeiten wurden in plink berechnet und paarweise Unterschiede zwischen zeitlichen Populationen und genetischen Clustern wurden von Fst unter Verwendung der Methode von Weir und Cockerham geschätzt, die im Hierfstat-Paket in R angewendet wurde. Der Likelihood-Ratio-Test für Allelhäufigkeitsunterschiede pFST wurde weiter mit vcflib berechnet. Für einen kombinierten pFST-P-Wert wurde die Fisher-Methode im R-metaseq-Paket durchgeführt. Die zusammenfassenden P-Werte wurden für mehrere Tests mit der Benjamini-Hochberg-Methode (BH) korrigiert. Um die gemeinsame Nutzung von Haplotypen bei pfaat1 (Pf3D7_06_v3:1,213,102-1,217,313) und pfcrt (Pf3D7_07_v3:403222-406317) zwischen Isolaten aus den verschiedenen Probenahmejahren in Gambia zu untersuchen, haben wir die IBD-Matrix mit isoRelate R package18 für alle Isolatpaare für Genregionen extrahiert überspannt weitere 25 kb auf jeder Flanke. Wir haben Beziehungsnetzwerke mit dem R-Paket igraph generiert und dabei den Skripten im isoRelate R-Paket gefolgt18. Isolate sind verbunden, wenn sie >90 % IBD aufweisen.

Wir betrachteten im selben Jahr gesammelte Proben als eine einzelne Population, unabhängig vom Ort der Sammlung. Wir haben den hapFLK-Ansatz verwendet, um Signaturen positiver Selektion durch Haplotyp-Differenzierung nach hierarchischer Gruppierung gambischer zeitlicher Bevölkerungsgruppen im Vergleich zu einer Außengruppe aus Tansania zu erkennen, wie zuvor beschrieben47. P-Werte wurden für jeden SNP-spezifischen Wert mithilfe des mit dem hapFLK-Programm bereitgestellten Python-Skripts berechnet und die Werte wurden für mehrere Tests mithilfe der BH-Methode korrigiert. Zweitens verwendeten wir paarweise Verwandtschaft basierend auf Identität durch Abstammung, um eine iR-Statistik für jeden SNP abzuleiten, wie durch das IsoRelate18-Paket in R implementiert. Regionen mit überlappenden iR- und hapFLK −log10 P-Werten > 5 wurden als Regionen von Interesse betrachtet.

Wir haben zwei Datensätze in diese Studie einbezogen: (1) Genotypen von 7.000 weltweiten P. falciparum-Proben aus dem MalariaGEN Pf-Gemeinschaftsprojekt (Version 6.0) (Ref. 21). Dieser Datensatz umfasst Proben aus Südamerika (SM), Westafrika (WAF), Zentralafrika (CAF), Ostafrika (EAF), Südasien (SA), dem westlichen Teil Südostasiens (WSEA) und dem östlichen Teil Südostasiens Asien (ESEA) und die Region Pazifik-Ozeanien (PO). (2) Wir haben außerdem 194 Thailand-Proben mit Daten zur Sequenzierung des gesamten Genoms von Cerqueira et al.15 einbezogen und sie in die WSEA-Population eingefügt. Doppelte Sequenzen wurden entsprechend der ursprünglichen ID (Hypercode) der Probe entfernt. Für die weitere Analyse wurden nur Proben mit Einzelparasiteninfektionen (FWS innerhalb der Wirtsdiversität > 0,90) und > 50 % der genotypisierten SNP-Loci einbezogen. Nach der Filtration blieben insgesamt 4.051 Proben übrig (Ergänzungstabelle 2). Nicht-biallelische SNPs und heterozygote Variantenaufrufe wurden weiter aus dem Datensatz entfernt. Anschließend extrahierten wir Genotypdaten in den Genregionen pfaat1 und pfcrt und berechneten die Allelfrequenzen (Abb. 2a).

Um den Effekt der Rekombination zu minimieren, haben wir 1.847 SNPs extrahiert, die innerhalb von 25 kb stromaufwärts und 25 kb stromabwärts des pfaat1-Gens verteilt sind. Für die Evolutionsanalyse wurden nur Proben verwendet, bei denen alle 1.847 SNPs genotypisiert waren (581/4.051). Um die Populationsstruktur zu visualisieren, haben wir den paarweisen genetischen Abstand zwischen Proben berechnet und mithilfe des R-Pakets poppr ein Minimum Spanning Network (MSN; Abb. 2b und Extended Data Abb. 5) generiert. Wir verglichen Genomsequenzen (PlasmoDB, Version 46) zwischen P. falciparum und Plasmodium reichenowi und extrahierten Genotypen an 1.803/1.847 gemeinsamen Loci. Anschließend haben wir eine ungewichtete Paargruppenmethode mit arithmetischem Mittelwert (UPGMA) erstellt, der von P. reichenowi unter Verwendung der 581 Haplotypen und 1.803 SNPs (Extended Data Abb. 5) unter Verwendung der R-Pakete ape und phangorn unter Standardparametern verwurzelt wurde. Das MSN-Netzwerk und die ungewichtete Paargruppenmethode mit arithmetischem Mittelbaum wurden mit ggplot2 dargestellt.

Wir haben genetische Kreuzungen zwischen dem Parasiten 3D7 und NHP4026 (Lit. 48) erzeugt, indem wir BRD-NOD-huHep-Mäuse mit menschlichen chimären Lebern und Anopheles-stephensi-Mücken wie zuvor beschrieben 23, 24, 25, 49, 50 verwendet haben. 3D7 ist ein Parasit afrikanischen Ursprungs51, der seit Jahrzehnten im Labor gehalten wird und CQ-empfindlich ist, während NHP4026 von einem Patienten geklont wurde, der die Klinik der Shoklo Malaria Research Unit an der Grenze zwischen Thailand und Myanmar besuchte (2007), und CQ-resistent ist (Ergänzung). Tisch 3). Wir haben drei Rekombinantenpools mithilfe unabhängiger Käfige infizierter Mücken erzeugt: Dies sind unabhängige Rekombinantenpools48. Die geschätzte Anzahl rekombinanter Genotypen in jedem Pool betrug etwa 2.800 (Lit. 48). Für diese Studie verwendeten wir zwei Pools (Pool 1 und Pool 2), die in einem AlbuMAX-basierten Kulturmedium gehalten wurden.

Für jeden rekombinanten Pool wurde die Parasitenkultur unter Standardkulturbedingungen expandiert25. Kurz gesagt, die Kulturen wurden in Vollmedium bei 5 % Hämatokrit in O+ roten Blutkörperchen (RBCs) (Biochemed Services) bei 37 °C, einem pH-Wert von 7,0–7,5, 5 % CO2, 5 % O2 und 90 % N2 gehalten. Alle 48 Stunden wurden Mediumwechsel durchgeführt und die Kulturen erweitert, um die Parasitämie bei etwa 1 % zu halten. Nach der Expansion wurde jeder rekombinante Pool in 16 0,5-ml-Aliquots aufgeteilt und dabei auf 1 % Parasitämie verdünnt. Die Aliquots wurden in Platten mit 48 Vertiefungen aufbewahrt und mit CQ behandelt (ergänzende Abbildung 7). Insgesamt hatten wir 32 Kulturen: 2 Pools × 4 CQ-Konzentrationen (0 (Kontrolle), 50, 100 oder 250 nM) × 2 Arzneimitteldauer (48 Stunden oder 96 Stunden) × 2 technische Replikate. Wir definieren den Tag, an dem das Medikament verabreicht wurde, als Tag 0. Nach 2 Tagen (48 Stunden) der Medikamentenbehandlung wurden die infizierten Erythrozyten zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen, um restliches Medikament zu entfernen. Für die Platte, die für eine 48-stündige CQ-Behandlung vorgesehen war (48-Well-Platte 1), wurden die Kulturen in Vollmedium gehalten; und Proben wurden an den Tagen 0, 4 und 7 gesammelt. Für die Platte, die für eine 96-stündige CQ-Behandlung vorgesehen war (48-Well-Platte 2), wurde frisches CQ wieder zum Kulturmedium hinzugefügt und weitere 48 Stunden lang behandelt; und nach insgesamt 96 Stunden CQ-Behandlung wurde das Medikament entfernt und Proben wurden an den Tagen 0, 5 und 10 gesammelt. CQ wurde in H2O gelöst und in unvollständigem Medium (Gibco, Life Technologies) verdünnt. Das Kulturmedium wurde alle 48 Stunden gewechselt. Die Parasitämie wurde mit 20 % Giemsa-gefärbten Objektträgern überwacht und die Kulturen wurden auf 1 % Parasitämie verdünnt, wenn die Parasitämie mehr als 1 % betrug. Pro Probe wurden etwa 15 μl gepackte Erythrozyten gesammelt.

Wir haben Illumina-Bibliotheken vorbereitet und beide Elternteile sowie die 96 gesammelten Segregantenpools sequenziert. Wir extrahierten genomische DNA mit dem Qiagen DNA Mini Kit und quantifizierten die DNA mit dem Quant-iT PicoGreen Assay (Invitrogen). Für Proben mit <50 ng DNA haben wir WGA52 durchgeführt. WGA-Produkte wurden mit KAPA Pure Beads (Roche Molecular Systems) im Verhältnis 1:1 gereinigt. Wir haben Sequenzierungsbibliotheken mit 50–100 ng DNA- oder WGA-Produkten mit dem KAPA HyperPlus Kit gemäß den Anweisungen mit drei PCR-Zyklen vorbereitet. Alle Bibliotheken wurden am 150-bp-Paarende mit Illumina Novaseq S4- oder Hiseq

Wir haben die Sequenzierungslesevorgänge mithilfe von BWA mem (http://bio-bwa.sourceforge.net/) dem 3D7-Referenzgenom (PlasmoDB Version 46) zugeordnet und die Alignment-Dateien mithilfe von Picard Tools v2.0.1 (http://bio-bwa.sourceforge.net/) dedupliziert und transformatiert ://broadinstitute.github.io/picard/). Wir haben den Basisqualitätswert basierend auf einer Reihe verifizierter bekannter Varianten53 mit BaseRekalibrator neu kalibriert und Varianten über HaplotypeCaller aufgerufen. Beide Funktionen stammten aus dem Genome Analysis Toolkit GATK v3.7 (https://software.broadinstitute.org/gatk/). Nur Varianten, die sich in den Kerngenomregionen (definiert in Lit. 53) befinden, wurden aufgerufen und für die weitere Analyse verwendet.

Wir haben Aufrufe der beiden Eltern mithilfe von GenotypeGVCFs in GATK zusammengeführt und die Standardfiltration auf den Rohvariantendatensatz angewendet, wie in Ref. beschrieben. 54. Wir haben die Variantenqualitätswerte neu kalibriert und Loci mit Variantenqualitätswerten <1 entfernt. Die endgültigen Varianten im VCF-Format wurden mit snpEff v4.3 (https://pcingola.github.io/SnpEff/) mit 3D7 (PlasmoDB, Release 46) als Referenz kommentiert. Nach der Filterung und Annotation wählten wir SNP-Loci aus, die sich in den beiden Eltern unterscheiden, und verwendeten diese SNPs für die weitere BSA.

Wir verwendeten statistische Methoden, die in den Referenzen beschrieben sind. 25,48,50 für BSA. Die Variantenaufrufe aus getrennten Nachkommenpools wurden zusammengeführt. Zusätzlich wurden SNP-Loci mit einer Abdeckung <30× entfernt. Wir haben die Lesevorgänge mit den Genotypen jedes Elternteils gezählt und die Allelhäufigkeiten berechnet. Die Allelfrequenzen von 3D7 wurden über das Genom aufgetragen und Ausreißer wurden gemäß der Hampel-Regel55 mit einer Fenstergröße von 100 Loci entfernt. Wir haben die BSA mit dem R-Paket QTLseqr56 durchgeführt. Extreme QTLs wurden als Regionen mit G′ > 20 definiert (Lit. 57). Sobald ein QTL erkannt wurde, berechneten wir mithilfe der Li-Methode58 ein ungefähres 95-%-Konfidenzintervall, um die verursachenden Gene zu lokalisieren.

Einzelne Nachkommen wurden durch Grenzverdünnung von 0,3 Zellen pro Vertiefung aus Massenkulturen am Tag 10 nach 96 Stunden Kontrolle/250 nM CQ-Behandlung kloniert. Einzelne Vertiefungen mit Parasiten wurden durch qPCR (wie zuvor beschrieben49) bestimmt und unter Standardkulturbedingungen auf größere Kulturen ausgeweitet, um genügend Material sowohl für die Kryokonservierung als auch für die Genomsequenzierung zu erhalten.

Die geklonten Nachkommen wurden wie im Abschnitt „Genkreuzung und BSA“ beschrieben sequenziert und genotypisiert, mit den folgenden Modifikationen: (1) die geklonten Nachkommen wurden mit 25-facher Genomabdeckung sequenziert; (2) SNP-Aufrufe wurden entfernt, wenn die Abdeckung mehr als drei Lesevorgänge pro Stichprobe betrug.

Einzigartige rekombinante Nachkommen wurden aus allen geklonten Nachkommen mithilfe einer zuvor beschriebenen Pipeline identifiziert49. Nichtklonale Nachkommen wurden anhand der Anzahl und Verteilung heterozygoter SNP-Aufrufe identifiziert. Es wurde festgestellt, dass selbstgezüchtete Nachkommen eine Sequenzähnlichkeit von mehr als 90 % mit beiden Elternteilen aufwiesen. Einzigartige rekombinante Nachkommen, die mehrfach beprobt wurden, wurden als Cluster einzelner klonaler Nachkommen mit einer Sequenzähnlichkeit von mehr als 90 % identifiziert. Wir haben die Häufigkeit von 3D7-Allelen im gesamten Genom in Nachkommenpopulationen mit und ohne CQ-Behandlung aufgezeichnet. Heatmaps wurden erstellt, um Vererbungsmuster in einzelnen einzigartigen rekombinanten Nachkommen zu visualisieren (Abb. 4a). Wir haben 16 einzigartige rekombinante Nachkommen mit unterschiedlichen Allelkombinationen in den QTL-Regionen von Chromosom 6 und Chromosom 7 für die weitere Messung der CQ IC50 v-Werte ausgewählt (ergänzende Abbildung 5).

Der exakte Fisher-Test wurde verwendet, um die Verknüpfung zwischen allen interchromosomalen Loci-Paaren im Satz von 109 einzigartigen rekombinanten Nachkommen zu testen. Die Verteilung des −log der resultierenden P-Werte wurde in Abb. 4c dargestellt und der Signifikanzgrenzwert wurde auf der Grundlage einer Bonferroni-Korrektur für die Anzahl der Loci berechnet.

Kryokonservierte Bestände von 3D7-, NHP4026- und 3D7×NHP4026-Nachkommen wurden aufgetaut und in vollständigem Medium unter Standardkulturbedingungen wie oben beschrieben gezüchtet. Die Kulturen wurden mit einem Mediumwechsel alle 48 Stunden unter 3 % Parasitämie gehalten. Die IC50-Werte der Eltern und Nachkommen wurden mithilfe eines standardmäßigen 72-Stunden-SYBR-Green-1-Fluoreszenztests59 ermittelt. Die Kulturen wurden täglich auf Parasitämie und Stadium untersucht. Kulturen, die zu mindestens 70 % aus Ringen bestanden, wurden in CQ-Dosis-Wirkungs-Assays einer Reihe von zweifachen Arzneimittelverdünnungen in zehn Vertiefungen mit 0,15 % Parasitämie geladen. Arzneimittelvorräte (1 mg ml−1) für CQ wurden in H2O als Einmal-Aliquots zubereitet und bis zur Verwendung bei –20 °C gelagert. Arzneimittelverdünnungen wurden in unvollständigem Medium hergestellt. Biologische Replikate wurden mit mindestens zwei Kultivierungszyklen zwischen den Belastungsterminen durchgeführt. Die IC50-Werte wurden in GraphPad Prism 8 anhand einer Vier-Parameter-Kurve aus zwei pro Platte geladenen technischen Replikaten berechnet.

Wir haben Plasmide für die CRISPR-Cas9-Bearbeitung wie zuvor beschrieben entworfen60. Die Leit-RNA (GAAATTAAATACATAAAAGA) wurde entwickelt, um auf pfaat1 in NHP4026 abzuzielen. Änderungen (258L/313F, 258S/313S und 258S/313F, Abb. 5a) wurden durch Homologiearmsequenz mit Ziel- und Schildmutationen in NHP4026 eingeführt. Es wurden keine Kontrollmutanten für die Bindungsstelle erzeugt, da P. falciparum keine fehleranfällige, nicht homologe Endverbindung aufweist61. Die Parasiten wurden im Ringstadium mit 100 µg Plasmid-DNA transfiziert und erfolgreiche Transfektanten wurden durch 6-tägige Behandlung mit 24 nM WR99210 (Geschenk von Jacobus Pharmaceuticals) selektiert. Die Parasiten erholten sich nach ca. 3 Wochen. Um festzustellen, ob wiederhergestellte Parasiten die erwarteten Mutationen enthielten, amplifizierten wir die Zielregion (Vorwärtsprimer, AGTACGGTACTTTTTATATGTACAGCT; Rückwärtsprimer, TGCATTTGGTTGTTGAGAGAAGG) und bestätigten die Mutation mit Sanger-Sequenzierung. Wir haben Parasiten aus erfolgreichen Transfektionsexperimenten geklont: Für jeden pfaat1-Genotyp wurden unabhängig editierte Parasiten (aus verschiedenen Transfektionsexperimenten) gewonnen. Editierte Parasiten wurden im Genom sequenziert, um Off-Target-Editierungen an anderer Stelle im Genom zu identifizieren. Wir konnten keine SNP- oder Indel-Änderungen zwischen dem ursprünglichen NHP4026 und anderen CRISPR-editierten Parasiten als den Ziel- und Schildmutationen feststellen.

Die IC50-Werte der Parasiten für CQ, Amodiaquin, Lumefantrin, Mefloquin und Chinin wurden für zwei bis vier Klone pro CRISPR-Cas9-modifizierter Linie und für NHP4026 über mehrere Belastungsdaten hinweg gemessen, wie oben für geklonte Nachkommen beschrieben, mit der Ausnahme, dass jede Platte zwei technische Replikate von NHP4026 enthielt als Kontrollen. Diese Replikation des Genotyps innerhalb jedes Ladedatums ermöglichte die Erkennung von Chargeneffekten aufgrund des Ladedatums.

Die Varianzanalyse wurde verwendet, um Chargeneffekte zu berücksichtigen und Unterschiede in den IC50-Werten zwischen allen Genotypgruppen und für jeden Kontrast zwischen jeder CRISPR-Cas9-modifizierten Linie und NHP4026 für jedes getestete Medikament zu testen62. Ein lineares Modell mit Belastungsdatum (Charge) und Genotyp als erklärende Variablen wurde verwendet, um chargenkorrigierte IC50-Werte zur Visualisierung der Auswirkungen von CRISPRCas9-Modifikationen zu generieren (Abb. 5b und erweiterte Daten, Abb. 7).

Parasiten wurden mithilfe eines Dichtegradienten63 mit Schizonten im Spätstadium synchronisiert. Die oberste Schicht der Schizonten im Spätstadium wurde entfernt und zweimal mit Medium des Roswell Park Memorial Institute (RPMI) gewaschen. Synchronisierte Kulturen wurden in 5 ml Vollmedium mit 5 % Hämatokrit suspendiert und über Nacht unter leichtem Schütteln wieder eindringen gelassen. Parasitämie und Parasitenstadium wurden mittels Durchflusszytometrie quantifiziert. Kurz gesagt, 80 μl Kultur und eine RBC-Kontrolle wurden mit SYBR Green I und SYTO 61 gefärbt und auf einem Guava easyCyte HT (Luminex) gemessen. Zur Bestimmung der relativen Parasitämie und des Stadiums wurden insgesamt 50.000 Ereignisse aufgezeichnet. Als sich 80 % der Parasiten im Ringstadium befanden, wurden die direkten Konkurrenzexperimente durchgeführt64. Konkurrenztests wurden zwischen CRISPR-Cas9-editierten Parasiten und NHP4026 im Verhältnis 1:1 bei einer Parasitämie von 1 % in einer 96-Well-Platte (200 μl pro Well) durchgeführt und 30 Tage lang aufrechterhalten. Jeder der Tests enthielt drei biologische Replikate (drei unabhängige Klone aus verschiedenen CRISPR-Cas9-Editierungsexperimenten) und zwei technische Replikate (zwei Kulturvertiefungen). Alle 2 Tage wurde die Parasitämie mikroskopisch unter Verwendung von Giemsa-gefärbten Objektträgern beurteilt, Proben wurden entnommen und bei –80 °C gelagert und die Kulturen wurden mit frischen Erythrozyten und Medium auf 1 % Parasitämie verdünnt. Der Anteil der Parasiten in jedem Wettbewerb (Extended Data Abb. 10) wurde mithilfe eines rhAmp-SNP-Assays (Integrated DNA Technologies) mit Primern gemessen, die auf die CRISPR-Cas9-editierte Region in pfaat1 abzielten.

Wir haben die Selektionskoeffizienten gemessen, indem wir ein lineares Modell zwischen dem natürlichen Logarithmus des Allelverhältnisses (Häufigkeit (alleleditierter Parasit)/Häufigkeit (NHP4026)) und der Zeit (gemessen in 48-stündigen asexuellen Parasitenzyklen) gemessen haben. Die Steigung des linearen Modells liefert ein Maß für die treibenden Kräfte jeder Mutation65. Um die relative Fitness von Parasiten zu vergleichen, die verschiedene pfaat1-Allele tragen, normalisierten wir die Fitness von NHP4026 auf 1 und verwendeten Steigung + 1, um die Fitness von CRISPR-Cas9-editierten Parasiten zu quantifizieren (Abb. 5c).

Um pfAAT1-exprimierende Hefe zu erzeugen, wurde das Plasmid, das die pfaat1-Kodierungssequenz trägt, wie zuvor beschrieben in Hefe Saccharomyces cerevisiae (BY4743) transformiert27. Die Verdopplungszeit (h) wurde für Stämme gemessen, die einen leeren Vektor, WT pfAAT1 oder S258L-Mutante pfAAT1 tragen. Wir haben die Verdopplungszeit unter zwei Kulturbedingungen gemessen: Kontrolle oder mit 1 mM CQ. Für jeden Assay wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt.

Dreidimensionale Homologiemodelle für pfAAT1 wurden mit AlphaFold29,66 und I-TASSER30,67,68 vorhergesagt und mit der PyMol-Software (v2.3.0; Schrödinger, LLC) analysiert. Auf der Ebene der Primärsequenz verwendeten wir TOPCONS32, um die Topologie der Transmembranhelix zum Vergleich vorherzusagen. Wir haben eine Cartoon-Version der Protein-Transmembrantopologie basierend auf den rechnerisch vorhergesagten Strukturen und der Membrantopologie gezeichnet (Extended Data Abb. 9). Die Modelle wurden gekürzt, um die Amino-terminalen Reste 1–166 auszuschließen, die sich wahrscheinlich außerhalb der Membran befinden, da AlphaFold diesem N-terminalen Abschnitt eine geringe Konfidenz zuordnet. Darüber hinaus sind interessierende Mutationen sowohl nach 3D-Modellen als auch nach TOPCONS nur auf Transmembranhelices abgebildet. I-TASSER generierte Modelle mit einer ähnlichen Topologie wie AlphaFold mit den höchsten Variationen in den AlphaFold-Regionen 1–166 und 475–516 mit niedrigem Vertrauen. Die fünf besten I-TASSER-Modelle überlagern das AlphaFold-Modell mit einem quadratischen Mittelwertabweichungsbereich von 2,4–2,8 Å über 303–327 von 440 ausgerichteten Resten unter Verwendung des PDBeFold-Servers (http://www.ebi.ac.uk/msd). -srv/ssm). Die vier gängigen SNPs (S258L, F313S, Q454E und K541L) liegen eng übereinander zwischen den Homologiemodellen. Wir haben die Auswirkung verschiedener Mutationen auf die Proteinstabilität mithilfe der Mutagenesefunktion in PyMol untersucht.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle rohen Sequenzierungsdaten wurden an das National Center for Biotechnology Information Sequence Read Archive (SRA, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra) oder das European Nucleotide Archive (ENA) übermittelt. Die Zugangsnummern sind in den Ergänzungstabellen verfügbar 1 und 2. Alle anderen Daten sind im Haupttext oder in ergänzenden Materialien verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Der für die Analyse verwendete Code und die analysierten Daten sind auf GitHub über die folgenden Links verfügbar: https://github.com/emilyli0325/CQ.AAT1.git (XL), https://github.com/MPB-mrcg?tab= Repositories (AA-N.) und https://github.com/kbuttons/CQ.AAT1.progeny.git (KAB-S.).

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Wir danken früheren und gegenwärtigen Mitarbeitern und Gastforschern der MRC-Einheit in Gambia, die an Studien beteiligt waren, aus denen Proben archiviert wurden, einschließlich derjenigen unter der früheren Leitung von B. Greenwood und T. Corrah. Die Arbeiten am Texas Biomedical Research Institute wurden in Einrichtungen durchgeführt, die mit Unterstützung des Research Facilities Improvement Program-Zuschusses C06 RR013556 errichtet wurden. Die Shoklo Malaria Research Unit ist Teil der Mahidol Oxford University Research Unit, die vom Wellcome Trust of Great Britain unterstützt wird. Wir danken den Mitarbeitern der Probenlogistik-, Sequenzierungs- und Informatikeinrichtungen des Wellcome Trust Sanger Institute für ihre Beiträge. Der Structural Biology Core am Health Science Center der University of Texas in San Antonio ist Teil institutioneller Forschungskerne, die vom Büro des Vizepräsidenten für Forschung, dem Greehey Children's Cancer Research Institute und der gemeinsamen Ressource Drug Discovery and Structural Biology des Mays Cancer Center unterstützt werden (NIH-Stipendium P30 CA054174). Finanzierung: NIH-Stipendium P01 12072248 (MTF); NIH-Stipendium R37 AI048071 (TJCA); MRC Career Development Fellowship MC_EX_MR/K02440X/1 (AA-N.); MRC-Malaria-Programmzuschuss MC_EX_MR/J002364/1 (UDA); Zuschuss des Europäischen Forschungsrats AdG-2011-294428 (DC und AA-N.); MRC-Zuschuss MR/S009760/1 (DC); Wellcome Trust (206194 und 204911) und die Bill & Melinda Gates Foundation (OPP1204628 und INV-001927) (DK); Zuschuss des Biotechnology and Biological Sciences Research Council BB/M022161/1 (SVA); und Wellcome Trust (Fördernummer 220221) (FHN). Zum Zweck des offenen Zugangs hat der Autor eine öffentliche CC BY-Urheberrechtslizenz auf alle vom Autor akzeptierten Manuskriptversionen angewendet, die sich aus dieser Einreichung ergeben.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Alfred Amambua-Ngwa, Katrina A. Button-Simons, Xue Li, Sudhir Kumar, Katelyn Vendrely Brenneman.

MRC-Einheit Gambia an der London School of Hygiene and Tropical Medicine, Banjul, Gambia

Alfred Amambua-Ngwa & Umberto D'Alessandro

Eck Institute for Global Health, Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, Notre Dame, IN, USA

Katrina A. Button-Simons, Katelyn Vendrely Brenneman, Lisa A. Checkley, Douglas A. Shoue, Haley Dalhoff, James K. Larbalestier und Michael T. Ferdig

Programm zur Intervention und Prävention von Krankheiten, Texas Biomedical Research Institute, San Antonio, TX, USA

Xue Li, Marco Ferrari, Marina McDew-White, Ann Reyes, Elizabeth Delgado und Timothy JC Anderson

Zentrum für globale Infektionskrankheitsforschung, Seattle Children's Research Institute, Seattle, WA, USA

Sudhir Kumar, Meseret T. Haile, Stefan HI Kappe und Ashley M. Vaughan

School of Life Sciences, University of Nottingham, Nottingham, Großbritannien

Sarah M. Tindall und Simon V. Avery

Wellcome Sanger Institute, Hinxton, Großbritannien

Roberto Amato, Richard D. Pearson und Dominic Kwiatkowski

Abteilung für Biochemie und Strukturbiologie, University of Texas Health Science Center in San Antonio, Antonio, TX, USA

Alexander B. Taylor

Shoklo Malaria Research Unit, Mahidol-Oxford Tropical Medicine Research Unit, Mahidol University, Mae Sot, Thailand

François H. Nosten

Zentrum für Tropenmedizin und globale Gesundheit, Nuffield Department of Medicine, Universität Oxford, Oxford, Großbritannien

François H. Nosten

Host Pathogen Interactions Program, Texas Biomedical Research Institute, San Antonio, TX, USA

Ian H. Cheeseman

Abteilung für Pädiatrie, University of Washington, Seattle, WA, USA

Stefan HI Kappe & Ashley M. Vaughan

Abteilung für globale Gesundheit, University of Washington, Seattle, WA, USA

Stefan HI Cape

Abteilung für Infektionsbiologie, London School of Hygiene and Tropical Medicine, London, Großbritannien

David J. Conway

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AA-N., KAB-S., XL, SK und KVB haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen. Konzeptualisierung: MTF, TJCA, IHC, AMV, AA-N. und DJC-Methodik: AMV, SK, SVA und ABT-Untersuchung: AA-N., UD, DK, DJC, RA, RDP, KAB-S., KVB, MM-W., MTH, LAC, HD, JKL, AR, ED-, SK-, DAS-, SMT-, MF-, ABT- und TJCA-Analyse: XL, KAB-S. und AA-N. Visualisierung: XL, KAB-S. und AA-N. Fördermittelakquise: MTF, TJCA, DJC, AA-N., DK, SVA und FHN Projektverwaltung: MF, DK, AA-N., DJC und SVA Betreuung: MF, AMV, TJCA, IHC, SHIK, SVA, DK und DJC Writing – Originalentwurf: KVB, TJCA, KAB-S. und XL Writing – Überprüfung und Bearbeitung: MTF, AMV, IHC, SK, AA-N., DJC, DK, UD, RDP, SHIK, FHN, ABT und TJCA

Korrespondenz mit Ashley M. Vaughan, Michael T. Ferdig oder Timothy JC Anderson.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Microbiology dankt Liwang Cui, Carol Sibley und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

p ist die Häufigkeit mutierter Allele (pfaat1 S258L oder pfcrt K76T), wie in Abb. 1a angegeben, und q (= 1-p) ist die abgeleitete Häufigkeit von Wildtyp-Allelen (3D7). Die x-Achse zeigt Parasitengenerationen (beschriftet mit dem Jahr der Probenentnahme). Wir haben die Selektionskoeffizienten (s) basierend auf der Allelhäufigkeit aus den Jahren 1990 und 2001 geschätzt, als die CQ-Monotherapie in Gambia im Jahr 2004 eingestellt wurde menschlicher Wirt). Die Berechnung basierte auf Schätzungen von 2, 4 oder 6 Generationen pro Jahr.

Haplotyp-Beziehungen basierten auf der Identifizierung durch Abstammung von Genomsegmenten, die 25 kb auf beiden Seiten jedes Gens umfassten (siehe Methoden). Durch Linien verbundene Haplotypen weisen auf >90 % IBD hin. Jeder Punkt stellt ein Isolat dar, dessen Punktfarben die Jahre darstellen, aus denen sie entnommen wurden. Quadratische Punkte stehen für komplexe Infektionen und Kreise für monoklonale Infektionen. MOI, Infektionsmultiplizität.

Die Felder AH zeigen den Anteil der IBD-Paare im gesamten Genom für Parasiten aus verschiedenen geografischen Regionen (markiert oben links in jedem Feld). Bei Proben, bei denen es sich bei >90 % der Genome um IBD handelt, wurde nur eine repräsentative Probe mit der höchsten Genotyprate ausgewählt und für die IBD-Analyse verwendet. Die Probennummern werden in jedem Feld angezeigt. Chromosomengrenzen werden durch graue gestrichelte vertikale Linien angezeigt. Die Position von pfaat1 und pfcrt wird durch rote Pfeile oben auf jedem Feld angezeigt. Der chr 10-Peak (Westafrika, A) enthält pfmspdbl2, das mit einer verminderten Empfindlichkeit gegenüber Halofantrin, Mefloquin und Lumefantrin verbunden ist69. Der chr 8-Peak (Ostafrika und Asien (CH)) enthält Dihydropteroat-Synthase (Sulfadoxinresistenz)70 und der chr 12-Peak (DF) enthält GTP-Cyclohydrolase I, einen kompensatorischen Locus für Antifolat-Medikamente71. Siehe auch Analysen von Amambua-Ngwa et al.17, Hendon et al.18 und Carrasquilla et al.19.

A. pfcrt-Allelverteilung in afrikanischen Ländern. B. pfaat1-Allelverteilung in afrikanischen Ländern. C. Korrelationen der Allelfrequenzen zwischen pfcrt (CVIET) und pfaat1 (S258L). Die Häufigkeiten des CVIET-Haplotyps für die Aminosäuren 72–76 in pfcrt korrelieren signifikant mit den Allelhäufigkeiten von pfaat1 S258L in Westafrika (R2 = 0,65, p = 0,0017, rote gestrichelte Linie) oder in allen afrikanischen Populationen (R2 = 0,44, p =). 0,0021). Die Punktgröße gibt die Probenanzahl an, während die Farbe die Probenorte angibt. Wir haben den t-Test verwendet, um festzustellen, ob die r-Statistik nach Pearson signifikant von Null abweicht.

Der Baum wurde mit Plasmodium reichenowi bewurzelt (im Baum nicht dargestellt). WAF: Westafrika, EAF: Ostafrika, CAF: Zentralafrika, SM: Südamerika, ESEA: Ost-Südostasien (SE) Asien, SA: Südasien, WSEA: West-SE-Asien, PO: Pazifische Ozeanregion.

Quelldaten

CQ-Behandlungen wurden auf die Pools am Tag 0 mit 0 (Kontrolle), 50, 100 oder 250 nM angewendet. CQ wurde am Tag 2 (48-Stunden-Behandlung) oder Tag 4 (96-Stunden-Behandlung) entfernt, wie hellblau schattiert. Für 48-stündige CQ-Behandlungen wurden Proben am Tag 0, 4 und 7 gesammelt; während für eine 96-stündige CQ-Behandlung Proben am Tag 0, 5 und 10 gesammelt wurden. Durchgezogene oder gestrichelte Linien sind Ergebnisse verschiedener technischer Replikate. Die 3D7-Allelfrequenzen in CQ-behandelten Pools nehmen sowohl in den QTL-Regionen chr.6 als auch chr.7 ab. In der chr.14-QTL-Region zeigen die Allelfrequenzen nach einer medikamentösen Behandlung keine bis nur geringe Veränderungen, was darauf hindeutet, dass dieser QTL nichts mit der medikamentösen Behandlung zu tun hat.

Die Bearbeitung des CRISPR/Cas9-Gens führte zu kleinen Unterschieden im IC50 für Chinin (QN), Lumefantrin (LUM) und Amodiaquin (AMD), aber zu keinen signifikanten Veränderungen für Mefloquin (MQ). Allerdings lagen alle IC50-Werte unterhalb der klinisch signifikanten Werte für diese Arzneimittel (klinische Schwellenwerte: QN = 600 nM72; MQ = 30 nM72, AMD = 60 nM72) oder am unteren Ende des In-vitro-Bereichs (0–150 nM). der Fall von LUM73. Die Anzahl der biologischen Replikate wird über der x-Achse angezeigt. P-Werte geben Signifikanzniveaus an und basieren auf einer Zwei-Wege-ANOVA-Analyse. Die Daten werden als Mittelwerte +/− SEM dargestellt.

Quelldaten

Die Verdopplungszeit der Hefe wurde aus dem linearen Anteil des exponentiellen Wachstums berechnet. Die Daten wurden als Mittelwerte aus drei unabhängigen Experimenten ± SEM und als Signifikanz dargestellt und anhand mehrerer Vergleiche (mit Türkei-Korrekturen) der Zwei-Wege-ANOVA berechnet. Das Wachstum von Hefezellen, die Wildtyp-pfaat1 (WT) exprimieren, wird durch die CQ-Behandlung (1 mM CQ während der Experimente) stark beeinträchtigt, wird jedoch in Hefen, die pfaat1 S258L exprimieren, wiederhergestellt. Veröffentlichte Ergebnisse zeigen, dass AAT1 in der Hefezellmembran exprimiert wird27, während pfAAT1 in der Verdauungsvakuolenmembran lokalisiert ist43 und möglicherweise auch in der Plasmamembran vorhanden ist35.

(A) AlphaFold-Modell von PfAAT1 (links), repräsentatives I-TASSER-Modell von PfAAT1 (Mitte), strukturelle Überlagerung des AlphaFold-Modells (blaugrün) und des I-TASSER-Modells (grau, rechts). Vorhersagen der TOPCONS-Transmembran(TM)-Helix-Topologie werden in Dunkelblau auf die Modelle abgebildet (links, Mitte). AlphaFold- und I-TASSER-Modelle stimmen mit einem RMSD von 2,5 Å über 327 von 440 Resten überein. Die Amino-terminalen Reste 1–166 wurden aufgrund der geringen Zuverlässigkeit der Strukturvorhersage aus allen Modellen ausgeschlossen. (B) Detaillierte Ansicht der Mutationen auf der vorhergesagten PfAAT1-3D-Struktur unter Verwendung des AlphaFold-Modells. Die rechte Ansicht ist mit der linken durch eine 45°-Drehung um die Achse verbunden, die von unten auf die Figur blickt, gefolgt von einer 90°-Drehung um die horizontale Achse. Die vier als raumfüllende Modelle dargestellten SNPs sind alle in einer Ebene auf einer Seite des Modells senkrecht zur Membran angeordnet. S258L (Helix 3) und F313S (Helix 5) liegen einander gegenüber, dazwischen liegt Helix 8. Angesichts der epistatischen Wechselwirkungen zwischen den PfAAT1-S258L- und F313S-SNPs, die aus unseren Funktionsanalysen hervorgehen, könnte die F313S-Substitution des sperrigen, hydrophoben Phenylalanins durch das kleinere, polare Serin eine Störung in der Transmembranregion, die die Helices 3, 5 und 8 umfasst, kompensieren Dies ermöglicht möglicherweise eine teilweise Wiederherstellung der vorhergesagten Aminosäuretransportaktivität. Q454E befindet sich auf Helix 8 nahe der TM-Oberfläche und K541N befindet sich in einer Schleife, die Helix 9 und 10 verbindet. (C) Topologie von PfAAT1 abgeleitet anhand der 3D-Struktur. Es gibt elf Transmembran(TM)-Helices. Drei der Mutationen befinden sich an den TM-Helices, während sich K541N an einer Schleife befindet, die Helix 9 und 10 verbindet. Das Farbschema entspricht dem Schema in Tafel B. Das blaue Dreieck zeigt die Amino-terminalen Reste 1–166 an, die aus der Struktur ausgeschlossen wurden Vorhersage.

Wir verwendeten drei unabhängige CRISPR/Cas9-editierte Klone für jeden Genotyp und zwei technische Replikate für jedes Konkurrenzexperiment (Durchschnittswerte aufgetragen).

Ergänzende Abbildungen. 1–7.

Ergänzende Tabelle 1. Zugangsnummern, Proben-IDs und Allele für die gambischen Proben am pfaat1-Codon 258 bzw. pfcrt-Codon 76. Ergänzende Tabelle 2. Proben, die in der pfaat1-Allel- und Evolutionsstudie verwendet wurden. Ergänzende Tabelle 3. Zusammenfassung der Genotypen der Elternparasiten. Ergänzende Tabelle 4. Informationen und Zugangsnummern für Kreuzproben. Ergänzungstabelle 5. Gene innerhalb der QTL-Regionen. Ergänzende Tabelle 6. SNPs und Indels innerhalb der chr.6-QTL-Regionen. Ergänzungstabelle 7. Einzigartige rekombinante Nachkommen aus der genetischen Kreuzung 3D7 × NHP4026 ohne CQ-Selektion. Ergänzende Tabelle 8. CQ IC50-Daten für ausgewählte Nachkommen.

Allelzahl und Mutantenanteile pro Jahr der Probenahme in Gambia für die Codons pfaat1 258 und pfcrt 76. IC50-Daten für CRISPR/Cas9-editierten Parasiten. Amodiaquin-, Mefloquin-, Lumefantrin- und Chinin-IC50-Daten für CRISPR/Cas9-editierte Parasiten. Zellverdopplungszeiten (h), Dreifachbestimmungen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Amambua-Ngwa, A., Button-Simons, KA, Li, X. et al. Die Entwicklung der Chloroquinresistenz bei Plasmodium falciparum wird durch den mutmaßlichen Aminosäuretransporter AAT1 vermittelt. Nat Microbiol (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01377-z

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Eingegangen: 26. Juli 2022

Angenommen: 29. März 2023

Veröffentlicht: 11. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01377-z

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