Extrazelluläre Vesikel des Gram - Coastwise Ventures Group Co., Ltd

npj Biofilms and Microbiomes Band 9, Artikelnummer: 30 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Es ist mittlerweile bekannt, dass die Darmmikrobiota das Immunsystem des Wirts beeinflusst. Eine Möglichkeit der bakteriellen Kommunikation mit Wirtszellen ist die Sekretion von Vesikeln, kleinen Membranstrukturen, die verschiedene Ladungen enthalten. Die Forschung zu von grampositiven Darmbakterien abgesonderten Vesikeln, ihren Interaktionsmechanismen mit dem Wirt und ihren immunmodulatorischen Wirkungen ist noch relativ selten. Hier haben wir die Größe, den Proteingehalt und die immunmodulatorischen Wirkungen extrazellulärer Vesikel (EVs) charakterisiert, die von einem neu sequenzierten grampositiven menschlichen Darmsymbiontenstamm – Bifidobacterium longum AO44 – abgesondert werden. Wir fanden heraus, dass B. longum-EVs entzündungshemmende Wirkungen haben und die IL-10-Sekretion sowohl aus Splenozyten als auch aus Co-Kulturen von dendritischen Zellen (DC) und CD4+-T-Zellen induzieren. Darüber hinaus zeigte der Proteingehalt der EVs eine Anreicherung von ABC-Transportern, Quorum-Sensing-Proteinen und extrazellulären Proteinen, die gelöste Stoffe binden, von denen zuvor gezeigt wurde, dass sie eine herausragende Funktion bei der entzündungshemmenden Wirkung anderer B. longum-Stämme haben. Diese Studie unterstreicht die Bedeutung von Bakterienvesikeln für die Erleichterung der immunmodulierenden Wirkung von Darmbakterien auf den Wirt und wirft Licht auf Bakterienvesikel als zukünftige Therapeutika.

In den letzten zwei Jahrzehnten haben viele Studien die tiefgreifenden Auswirkungen der Darmmikrobiota auf die menschliche Physiologie gezeigt1,2,3, wobei eine Reihe nützlicher Funktionen hauptsächlich mit der Reifung und Modulation des Immunsystems zusammenhängen3,4,5,6,7, 8,9,10,11,12,13,14. Immunmodulatorische Bakterien wurden von uns und anderen schon lange identifiziert15,16,17,18, doch nur wenige aus Bakterien stammende immunmodulatorische Moleküle wurden charakterisiert19,20,21. Bakterienvesikel haben als Einheit, die sowohl mit Bakterien- als auch mit Wirtszellen interagieren kann, an Interesse gewonnen22. Vesikel sind Membranstrukturen, die sowohl von gramnegativen als auch von grampositiven Bakterien abgesondert werden. Die Größe der Vesikel variiert zwischen 20 und 300 nm und sie transportieren verschiedene Ladungen, darunter Proteine (sowohl Membran- als auch Zytoplasmaproteine), Peptidoglycane, Nukleinsäuren und Toxine sowie Lipopolysaccharide (LPS, bei gramnegativen Bakterien). Vesikel interagieren mit Bakterien und Wirtszellen, indem sie ihre Ladung verinnerlichen und freigeben. Diese Wechselwirkungen machen Vesikel ideal für den molekularen Transport über große Entfernungen zu benachbarten Bakterien oder Wirtsimmunzellen. Somit können Bakterienvesikel für potenzielle Therapeutika genutzt werden23. Obwohl die von gramnegativen Bakterien produzierten Vesikel bereits seit den 60er Jahren untersucht wurden24, wurde die Produktion extrazellulärer Vesikel (EVs) durch grampositive Bakterien erst 30 Jahre später nachgewiesen25. Obwohl sie bereits in den 90er Jahren entdeckt wurden, nahm das Interesse an der Vesikulogenese und den immunmodulatorischen Wirkungen grampositiver Elektrofahrzeuge im letzten Jahrzehnt zu26,27, wobei der Schwerpunkt immer noch auf pathogenen Bakterien wie Staphylococcus aureus28, Mycobacterium tuberculosis29 und anderen lag Bacillus anthracis30,31. Einige Studien zeigten, dass im Gegensatz zu gramnegativen Bakterien nur metabolisch aktive grampositive Bakterien EVs absondern32,33, neuere Studien legen jedoch nahe, dass EVs auch im Rahmen eines Prozesses des „blasenden Zelltods“ abgesondert werden34. Bisher gibt es nur begrenzte Kenntnisse über die Faktoren, die an der genetischen Regulierung der Vesikulogenese und dem Membranzustand der Bakterien beteiligt sind, der die Freisetzung von Elektrofahrzeugen ermöglicht26,35. Unter den Mitgliedern der grampositiven Darmmikrobiota hat die Gattung Bifidobacterium an Interesse gewonnen, da sie bekanntermaßen menschliche Milch-Oligosaccharide abbaut und im Magen-Darm-Trakt von gestillten Säuglingen36 sowie im Darm von Erwachsenen37 weit verbreitet ist. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Arten der Gattung Bifidobacterium sowohl das angeborene als auch das adaptive Immunsystem beeinflussen, meist mit entzündungshemmender Wirkung16,38, wobei einige Effektormoleküle bisher charakterisiert wurden39,40. Während gezeigt wurde, dass mehrere extrazelluläre Moleküle, wie das Bifidobacterium bifidum pili40 und Exopolysaccharide von Bifidobacterium breve39, entzündungshemmende Wirkungen hervorrufen, sind die Mechanismen, über die diese Moleküle mit dem Wirt interagieren, nicht vollständig geklärt. Ein wichtiges Mitglied der Gattung Bifidobacterium ist Bifidobacterium longum. Diese Art kommt im menschlichen Darm sehr häufig vor, sogar unter den Bifidobacterium-Arten41. Es wurde festgestellt, dass B. longum in vitro auf Zelllinien42, in vivo in Mausmodellen43 und vor allem in klinischen Studien zu entzündlichen Darmerkrankungen (IBD)44 eine entzündungshemmende Wirkung hat. Diese entzündungshemmenden Wirkungen wurden hauptsächlich auf seine Fähigkeit zurückgeführt, oxidativen Stress zu reduzieren, die Sekretion von Entzündungszytokinen herunterzuregulieren und den Gehalt an kurzkettigen Fettsäuren (SCFA) im Darm zu erhöhen45. Die molekularen Mechanismen, die seinen Interaktionen mit dem Wirt zugrunde liegen, und die therapeutischen Wirkungen müssen jedoch noch entdeckt werden. Mehrere Studien haben hervorgehoben, dass von Bifidobacterium-Arten abgesonderte EVs entzündungshemmend wirken und möglicherweise als Adjuvanzien bei der Behandlung von Allergien eingesetzt werden46,47. Beispielsweise wurde festgestellt, dass Vesikel von B. bifidum mit dendritischen Zellen (DCs) interagieren, gefolgt von der Differenzierung regulatorischer T-Zellen (T-regs)47. Interessanterweise hat eine aktuelle Studie das Potenzial von B. longum-Vesikeln zur Linderung von Nahrungsmittelallergien durch Apoptose-Induktion in Mastzellen hervorgehoben46. Obwohl Studien zu den immunmodulatorischen Wirkungen von Vesikeln sowohl von gramnegativen als auch von grampositiven Darmsymbionten beginnen26, haben nur wenige die Moleküle und Mechanismen entdeckt, die diesen Wirkungen zugrunde liegen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass EVs aus mehreren Stämmen derselben Art unterschiedliche immunmodulatorische Wirkungen mit unterschiedlichen Mechanismen hervorrufen, was das große Potenzial von Vesikeln unterstreicht, die aus den Tausenden von Bakterienstämmen stammen, die im menschlichen Darm vorkommen48. Hier demonstrieren wir die immunmodulatorischen Wirkungen von Darmbakterienvesikeln, die von einem neu sequenzierten und kommentierten Bifidobacterium longum-Stamm AO44 produziert werden. Unsere Ergebnisse eröffnen einen neuen Weg für zukünftige Studien zu den möglichen therapeutischen Wirkungen von Bakterienvesikeln.

Die DNA des B. longum-Stammes AO44 wurde extrahiert, das gesamte Genom sequenziert und bei der GenBank unter der Zugangsnummer PRJNA908295 hinterlegt. Um zu bestimmen, welche bakterielle Einheit eine entzündungshemmende Immunantwort (dh die IL-10-Sekretion) stimuliert, wurde eine chemische Fraktionierung unter Verwendung von Methanol/Chloroform-Extraktionen (MeOH/CHCl3) durchgeführt. Sowohl Bakterienzellen als auch konditionierte Medien von B. longum AO44, gezüchtet in Gifu Anaerobic Medium (GAM) oder Brain Heart Infusion Supplemented (BHIS), wurden gesammelt und hydrophobe/hydrophile Fraktionen extrahiert (Abb. 1a, b). Spezifische pathogenfreie (SPF) Maus-Splenozyten wurden verwendet, um die immunmodulatorischen Wirkungen jeder chemischen Fraktion zu bewerten. Splenozyten wurden mit Anti-CD3 aktiviert und mit jeder Bakterienfraktion ergänzt. Mit Anti-CD3 aktivierte SPF-Splenozyten von Mäusen ermöglichen die Untersuchung der Auswirkungen bakterieller Einheiten auf die gesamte Population von Immunzellen in der Milz. Die CHCl3-Fraktion von Bakterien, die sowohl in GAM als auch in BHIS gezüchtet wurden, übte im Vergleich zu anderen Fraktionen die höchste IL-10-Sekretion durch Splenozyten aus. Die Faltveränderung gegenüber der Kontrolle (mit Anti-CD3 aktivierte Splenozyten) ist dargestellt (Abb. 1c, d). Die immunmodulatorischen Wirkungen der Fraktion der konzentrierten (10x) konditionierten Medien (dh der konditionierten Medien) waren ähnlich der CHCl3-Fraktion, was darauf hindeutet, dass eine bakterielle Einheit, die in beiden Fraktionen vorhanden ist, die aktive immunmodulatorische Komponente enthält.

a Darstellung des Bakterienwachstums und der Zell-/Überstandstrennung. b Darstellung der bakteriell konditionierten Medien und der chemischen Fraktionierung der Zellen. c Faltungsänderung (im Vergleich zur Kontrolle) der IL-10-Konzentrationen in Splenozyten, die einer der chemischen Fraktionen ausgesetzt wurden, die aus B. longum erzeugt wurden, das in BHIS-Medien gezüchtet wurde. d Faltungsänderung (im Vergleich zur Kontrolle) der IL-10-Konzentrationen in Splenozyten, die einer der chemischen Fraktionen ausgesetzt wurden, die aus in GAM-Medien gezüchtetem B. longum erzeugt wurden. Jeder Punkt stellt eine technische Wiederholung von drei unabhängigen Experimenten dar. Brown-Forsythe- und Welch-ANOVA, *P < 0,05 und **P < 0,01. Fehlerbalken repräsentieren sd CHCl3-Fraktion = hydrophobe organische Fraktion, MeOH-Fraktion = hydrophile organische Fraktion, H2O-Fraktion = hydrophile polare Fraktion, SupX10 = konzentrierte konditionierte Medien. Abbildung 1a, b wurde mit BioRender.com erstellt.

Gemäß den chemischen Eigenschaften von CHCl3 enthält diese Fraktion hauptsächlich hydrophobe Moleküle, wie z. B. bakterielle Zellmembranen. Da sowohl die CHCl3-Fraktion als auch die konzentrierte Überstandsfraktion einen ähnlichen Effekt auf die IL-10-Sekretion hatten und EVs aus bakteriellen Zellmembranen bestehen, die in das konditionierte Medium sezerniert werden (d. h. in den Überständen vorhanden sind), haben wir uns auf die Charakterisierung von EVs konzentriert die aktive bakterielle Einheit. EVs von B. longum AO44 wurden durch eine Reihe von Filtrationen und Ultrazentrifugation isoliert (Abb. 2a), um EVs in Pellets zu erhalten. Als Kontrolle wurden BHIS-Medien ohne Bakterien dem gleichen Filtrations- und Ultrazentrifugationsprozess unterzogen, um zu bestätigen, dass die Immunwirkung von einer bakteriellen Einheit und nicht vom konzentrierten Medium selbst herrührt. Die EVs wurden durch Morphologie und Größe charakterisiert (Abb. 2b – d). Ein repräsentatives Kryo-TEM-Bild bestätigt das Vorhandensein der Vesikel im ultrazentrifugierten Pellet und zeigt ihre Morphologie (Abb. 2b). Darüber hinaus wurden mithilfe von Cryo-TEM EVs identifiziert, die aus der Bakterienzellmembran hervorgehen und die Bakterienzellen in ihren Wachstumsmedien umgeben (Abb. 2c). Die Größenverteilung der EVs wurde mit NanoSight gemessen, wobei die meisten Vesikel eine Größe von 150 nm hatten (Abb. 2d). Um zu verifizieren, dass die EVs von B. longum synthetisiert wurden, wurden die Bakterien in Gegenwart fluoreszierender D-Aminosäuren gezüchtet, um neu synthetisierte Proteine und insbesondere die Peptidoglykane der Bakterien zu markieren. Stoffwechselaktive Bakterien bauen die fluoreszierenden D-Aminosäuren ein, um Proteine zu synthetisieren. Die metabolische Markierung durch fluoreszierende D-Aminosäuren ist eine Methode, die die Markierung neu synthetisierter bakterieller EVs während ihrer Produktion ermöglicht, ohne dass sie nach der Extraktion markiert werden müssen. Dieser Schritt kann Spuren der Fluoreszenzmarker hinterlassen, die zu unspezifischen Markierungsartefakten führen können . Die markierten Vesikel wurden durch eine spezifische Durchflusszytometrie zum Nachweis kleiner Partikel identifiziert und von den unmarkierten Vesikeln unterschieden (Abb. 2e, f).

a Illustration des Prozesses der Isolierung extrazellulärer Vesikel. b Kryo-TEM-Bilder verschiedener durch Bakterien freigesetzter Elektrofahrzeuge aus derselben Probe. „S“ in „b“ bezeichnet den perforierten TEM-Trägerfilm. Alle Balken entsprechen 100 nm. c Kryo-TEM-Bilder der Bakterien in verschiedenen Stadien der EV-Bildung: (1) Die Spitze eines Bakteriums. Ein Sternchen weist auf mögliche sich bildende EVs hin, die in der Projektion durch die Zellwand sichtbar sind. (2) Ein EV, der sich zwischen Zellwand und Kapsel bildet (Pfeil). (3) Ein vollständig ausgebildetes EV zwischen der Zellwand und der Kapsel (Pfeil); „S“ bezeichnet den perforierten TEM-Trägerfilm. (4) Die Spitze des Bakteriums nach Freisetzung eines EV; ein Pfeil zeigt auf die verzerrte Zellwand; Pfeilspitzen zeigen auf freigegebene Elektrofahrzeuge. Rechts ist eine Vergrößerung von (4) eingefügt. Maßstabsbalken entsprechen 100 nm. d Größenverteilung und Konzentration (1e10) der extrazellulären B. longum-Vesikel, gemessen in NanoSight. Fehlerbalken stellen sd e, f extrazelluläre B. longum-Vesikel dar, die durch D-Aminosäuren-Markierung fluoreszierend markiert sind und in der Durchflusszytometrie nachgewiesen wurden. e unmarkierte Vesikel und f markierte Vesikel. Abbildung 2a wurde mit BioRender.com erstellt.

B. longum AO44-EVs wurden mittels Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie auf ihren Proteomgehalt analysiert. In allen drei Wiederholungen wurden 463 Proteine identifiziert und quantifiziert. Die angereicherten KEGG-Pfade sind in Abb. 3a und der Ergänzungstabelle 1c in Prozent dargestellt. Die drei größten Proteingruppen gehörten zu: Stoffwechselwegen (16,9 %), Ribosomen (9,4 %) und Biosynthese von Sekundärmetaboliten (7,7 %), die viertgrößte Gruppe waren ABC-Transporter (6,1 %) und die sechstgrößte Gruppe Quorum Sensing (4,9 %). Darüber hinaus waren ABC-Transporter laut INTERPRO-Datenbank mit Proteinzahlen von 31 und einem p-Wert von 1e-10 die am stärksten angereicherte Kategorie (Abb. 3b und Ergänzungstabelle 1b). INTERPRO bestätigte, dass andere Proteinkategorien im Zusammenhang mit ABC-Transportern in AO44-EVs von B. longum angereichert sind, einschließlich Transmembranpermeaseproteinen, Nukleotid-bindenden Proteinen und hochspezifischen periplasmatischen Proteinen, die gelöste Stoffe binden (Abb. 3b). Die STRING-Analyse und die Interaktionskarte dieser ABC-Transporter-Untergruppe und der von KEGG analysierten Quorum-Sensing-Untergruppe sind in Abb. 3c, d dargestellt. Zu beachten ist, dass die Untergruppe der ABC-Transporter auch Proteine enthielt, die zum Quorum-Sensing-Weg und einem ATP-Bindungsweg gehörten (Abb. 3c). Die Quorum-Sensing-Untergruppe umfasste Proteine, die an der Fettsäurebiosynthese, dem Proteinexport, ABC-Transportern und Proteinen beteiligt sind, die intrinsische Bestandteile der Membran sind (Abb. 3d). Alle in den Vesikeln identifizierten Proteine sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt (Ergänzungstabelle 1a enthält die gesamte Liste der integralen Membrankomponenten, Ergänzungstabelle 1b enthält die INTERPRO-Analyse und Ergänzungstabelle 1c die KEGG-Analyse).

a KEGG-Wege, angereichert mit B. longum-EVs. b Angereicherte Domänen- und Proteinfamilienkategorien der INTERPRO-Datenbank (P-Wert und Proteinanzahl), analysiert von DAVID Bioinformatics Resources (LHRI/ADRD am Frederick National Laboratory). Die Anreicherung erfolgte vor dem Hintergrund des bakteriellen Genoms. c STRING-Analyse und Interaktionskarte des ABC-Transporter-Clusters gemäß Annotation durch die KEGG-Pathway-Datenbank (lila – ABC-Transporter, blau – Quorum Sensing, grau – ATP-Bindung). d STRING-Analyse und Interaktionskarte der Quorum-Sensing-Proteine, wie in der KEGG-Pathway-Datenbank annotiert (blau – Quorum-Sensing, gelb – Fettsäurebiosynthese, braun – Proteinexport, lila – ABC-Transporter, hellblau – intrinsische Komponente der Membran).

Um zu bestätigen, dass sich das Proteinprofil der EVs vom Proteinprofil der Bakterienzellen und Überstände unterscheidet, wurde auch eine Proteomikanalyse an den Bakterienzellen und Überständen durchgeführt (Ergänzungstabelle 2). Die Proteinintensitätsprofile der Bakterienzellen wurden mit den EVs-Daten und den Proteinen verglichen, die aus den Überständen nach der Ultrazentrifugation analysiert wurden. Replikate aus jeder Gruppe wurden durch unbeaufsichtigtes Clustering zusammengefasst und in einer Heatmap dargestellt (Abb. 4a). In der Proteomik der Bakterienzellen wurden mehrere intensive Proteine identifiziert, jedoch nicht in den EVs, und in den EVs, jedoch nicht in den Überständen, was darauf hindeutet, dass die EVs einen spezifischen Proteingehalt enthalten, der nur für die EVs gilt und sich vom Gesamtproteingehalt unterscheidet der Zellen sowie vom sezernierten Proteingehalt. ABC-Transporterproteine und -domänen waren gemäß der INTERPRO-Datenbank im Vergleich zu Bakterienzellen signifikant an EVs angereichert (Abb. 4b). In den Bakterienzellen identifizierte Differenzialproteine (rechts) und die EVs (links) sind im Vulkandiagramm dargestellt (Abb. 4c).

eine Heatmap-Darstellung der Proteinintensitäten von Bakterienzellen, Elektrofahrzeugen und Überstandsproben, wie von der Perseus-Software analysiert. Dieses unbeaufsichtigte hierarchische Clustering wurde mithilfe der euklidischen Distanzanalyse durchgeführt. b Angereicherte Domänen- und Proteinfamilienkategorien der INTERPRO-Datenbank (P-Werte), wie von DAVID Bioinformatics Resources (LHRI/ADRD am Frederick National Laboratory) analysiert und Bakterienzellen und Elektrofahrzeuge verglichen. Die Anreicherung erfolgte vor dem Hintergrund des bakteriellen Genoms. c Vulkanplot-Darstellung der in den Bakterienzellen (rechts) und den EVs (links) identifizierten Differentialproteine. Rot – ABC-Transporter, Blau – ATP-bindende Proteine, Grün – Plasmamembran, Orange – Ribosomale Proteine.

EVs wurden in absteigenden Konzentrationen in SPF-Maus-Splenozyten eingeführt und sowohl die IL-10- als auch die IL-17-Konzentration im Zellmedium gemessen. Die IL-10-Konzentration war bei der niedrigsten Verdünnung der EVs (1:50) im Vergleich zu allen anderen Verdünnungen und Kontrollen am höchsten. Die IL-10-Konzentrationen nahmen auf nichtlineare Weise ab, wenn die Vesikel bei einer Verdünnung von 1:1250 auf eine nicht wirksame Konzentration verdünnt wurden (Abb. 5a). Im Gegensatz dazu wurden die IL-17-Konzentrationen nicht in allen Konzentrationen durch die Vesikel beeinflusst (Abb. 5b). Die Zellfrequenzen von CD8+ Ki67+ PD1+ und CD4+ Ki67+ PD1+ wurden mittels Durchflusszytometrie gemessen, um die Zellproliferation und -aktivierung zu beurteilen. Sowohl die Zellfrequenzen von CD8+ Ki67+ PD1+ als auch CD4+ Ki67+ PD1+ waren höher, wenn die Zellen der niedrigsten Verdünnung der Vesikel (1:50) ausgesetzt wurden, wobei CD8+ Ki67+ PD1+ im Vergleich zu anderen Verdünnungen und den Kontrollen etwas signifikanter war (Abb. 5c, d ). Um die entzündungshemmende Reaktion von Antigen-präsentierenden Zellen und T-Zellen auf B. longum-EVs weiter zu untersuchen, wurden DC-CD4+-T-Zellen in Gegenwart der bakteriellen EVs co-kultiviert. Die IL-10-Spiegel waren in Zellen, die mit EVs von B. longum aktiviert wurden, signifikant höher als in Zellen, die mit konzentriertem BHIS aktiviert wurden (x1000, Abb. 5e). Die IL-17-fache Veränderung zeigte keine signifikanten Unterschiede und sogar eine leichte Abnahme bei mit EVs aktivierten Zellen im Vergleich zu Zellen, die mit konzentriertem BHIS aktiviert wurden (x1000, Abb. 5f). Sowohl die IL-10- als auch die IL-17-Induktion in der Kokultur von DC-CD4+-T-Zellen stimmte mit der Induktion im gesamten Splenozyten-Assay überein.

a IL-10-Konzentrationen und b IL-17-Konzentrationen im Splenozytenmedium nach Exposition gegenüber Anti-CD3; oder Anti-CD3 kombiniert mit konzentriertem BHIS (hellgrau, 1:50-Verdünnung) oder absteigenden Verdünnungen extrazellulärer Vesikel. c Häufigkeit von CD4+ Ki67+ PD1+-Zellen in der Gesamtzahl der CD4-Zellen nach Exposition gegenüber Anti-CD3; Anti-CD3 kombiniert mit konzentriertem BHIS (1:50-Verdünnung) oder absteigenden Verdünnungen extrazellulärer Vesikel. d Häufigkeit von CD8+ Ki67+ PD1+-Zellen der gesamten CD8-Zellen nach Exposition gegenüber Anti-CD3 oder Anti-CD3 in Kombination mit konzentriertem BHIS (1:50-Verdünnung) oder absteigenden Verdünnungen extrazellulärer Vesikel. e, f-fache Änderung (im Vergleich zur Kontrolle) der IL-10- (e) oder IL-17-Konzentrationen (f) in DC-CD4+-T-Zellmedien, die entweder B. longum-EVs oder konzentriertem BHIS ausgesetzt waren. Jeder Punkt stellt eine biologische Wiederholung von drei unabhängigen Experimenten dar. a–d Gewöhnliche einfaktorielle ANOVA, e, f ungepaarter t-Test. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 und ****P < 0,0001. Fehlerbalken stellen SD dar

Die Darmmikrobiota hat potenziell erhebliche Auswirkungen auf unsere Gesundheit, sodass sie als Goldgrube für therapeutische Moleküle angesehen werden kann, die aus den Bakterien stammen19,20,21. Ein Hauptweg bakteriell induzierter therapeutischer Wirkungen auf den Wirt verläuft über die bakterielle Kommunikation mit dem Immunsystem des Wirts6,7,8,9,16,49. Beispielsweise können von Darmbakterien produzierte SCFAs über die Induktion von T-regs50 entzündungshemmende Wirkungen auf den Wirt hervorrufen. Die Art und Weise dieser Kommensal-Wirt-Kommunikation und die beteiligten bakteriellen immunmodulierenden Moleküle sind jedoch noch weitgehend unbekannt. Eine mögliche Art der Interaktion zwischen Darmmikroben und Wirt ist die Sekretion von Bakterienvesikeln, die Wirtszellen erreichen können, möglicherweise sogar an entfernten Orten. Tatsächlich wird ein äußeres Oberflächenpolysaccharid (PS) des gramnegativen Bakteriums Bacteroides fragilis über bakterielle Außenmembranvesikel (OMVs) an Wirtszellen übermittelt, wodurch experimentelle Kolitis bei Mäusen gelindert wird51. Studien zu extrazellulären Vesikeln (EVs) grampositiver Darmbakterien sind im Entstehen begriffen, sind jedoch im Vergleich zu Studien zu gramnegativen OMVs46,47 noch relativ selten. Insbesondere haben einige neuere Studien die physiologischen Wirkungen von Elektrofahrzeugen gezeigt, die von Bakterien der Gattung Bifidobacterium produziert werden. Von dieser Gattung ist Bifidobacterium longum ein häufiger grampositiver Darmkommensal mit entzündungshemmender und immunmodulatorischer Wirkung.

Hier haben wir uns entschieden, einen neu isolierten, aus dem menschlichen Darm stammenden B. longum-Stamm AO44 zu untersuchen, mit dem Ziel, seine immunmodulatorischen Einheiten zu charakterisieren. Wir führten zunächst eine chemische Fraktionierung von Bakterienzellen und Überständen von B. longum AO44 durch, um die chemischen Eigenschaften der aktiven immunmodulatorischen Bakterienverbindungen zu ermitteln. Es wurden zwei reichhaltige Wachstumsmedien ausgewählt (BHIS und GAM), die überwiegend zum Züchten von Bifidobacterium-Arten verwendet werden. Wir führten CHCl3:MeOH:H2O-Fraktionierungen durch, die Moleküle in rohe hydrophobe und hydrophile Fraktionen sowie organische und polare Fraktionen trennten. Da gezeigt wurde, dass Bakterien der Gattung Bifidobacterium überwiegend entzündungshemmende Wirkungen hervorrufen38, haben wir ein Screening auf die Induktion des entzündungshemmenden Zytokins IL-10 durch die aktiven Fraktionen durchgeführt. Sowohl die konzentrierte Überstandsfraktion als auch die CHCl3-Zellfraktion hatten den höchsten Effekt auf die IL-10-Sekretion durch Immunzellen, sowohl in GAM- als auch in BHIS-Medien. Die unpolare organische CHCl3-Fraktion enthält hydrophobe Moleküle wie Membranteile und Lipide. Daher haben wir vermutet, dass die aktive Komponente eine zelluläre Substanz ist, die in beiden enthalten ist. Da der Überstand durch Zentrifugation von den Bakterienzellen getrennt wurde, handelt es sich bei den gefundenen hydrophoben Membranteilen wahrscheinlich um Zelltrümmer oder EVs, die von den Bakterienzellen an das Medium abgegeben werden. Daher isolierten wir als nächstes EVs aus in BHIS gezüchteten Bakterien und bestätigten ihre Fähigkeit, die Sekretion von IL-10, jedoch nicht von IL-17 in Kulturen ganzer Splenozyten zu induzieren, was ihre entzündungshemmende Wirkung unterstreicht.

Wir haben ihre zusätzlichen potenziellen Immuneffekte weiter untersucht und festgestellt, dass dieselben Elektrofahrzeuge auch in der Lage sind, die Zellfrequenzen von CD4+ Ki67+ PD1+ und CD8+ Ki67+ PD1+ im Vergleich zur Kontrolle zu erhöhen. Eine Hochregulierung von CD4+ Ki67+ PD1+ und CD8+ Ki67+ PD1+ weist auf eine Aktivierung (PD1+) und Proliferation (Ki67+) sowohl von CD4- als auch CD8-Zellen hin, was mit der Induktion von IL-10 übereinstimmt. Um einen mechanistischeren Einblick in die entzündungshemmende Wirkung von Elektrofahrzeugen auf die Immunzellen des Wirts zu erhalten, untersuchten wir deren immunmodulatorische Wirkung in der Kokultur von DC-CD4+-T-Zellen. Hier, wie bei den gesamten Splenozyten, induzierten die EVs die IL-10-Sekretion und nicht die IL-17-Sekretion. Dies weist erneut auf ihre entzündungshemmende Wirkung hin und identifiziert DCs und CD4+ T-Zellen als Hauptakteure in dieser Interaktion. Nachdem wir die immunmodulatorischen Wirkungen von Elektrofahrzeugen identifiziert hatten, charakterisierten wir ihren Inhalt durch Proteomik. Die Proteomikanalyse ergab einen einzigartigen Proteingehalt in den EVs, der sich vom Proteingehalt ganzer Bakterienzellen und sekretierter Proteine im Überstand unterscheidet. Insbesondere wurde in den Elektrofahrzeugen eine Anreicherung von ABC-Transportern und Quorum-Sensing-Proteinen beobachtet. Bakterielle hochaffine Transportsysteme sind am aktiven Transport gelöster Stoffe durch die Zytoplasmamembran beteiligt, einschließlich Transmembranpermeaseproteinen, Nukleotid-bindenden Proteinen und hochspezifischen periplasmatischen gelösten Stoff-bindenden Proteinen, die alle in den Vesikeln vorhanden sind. Zu beachten ist, dass ABC-Transporter und extrazelluläre Proteine, die gelöste Stoffe binden (einschließlich „Familie 5“), in den EVs eines anderen B. longum-Stammes angereichert waren, der nachweislich Allergien lindert46. Darüber hinaus wurde zuvor gezeigt, dass Quorum-Sensing-Proteine mit gramnegativen OMVs angereichert sind, was die Bildung von bakteriellem Biofilm fördert52,53. Schließlich demonstrieren wir eine spezifische Fluoreszenzmarkierung der Bakterienvesikel, die zukünftige Studien zu Wechselwirkungen zwischen Elektrofahrzeugen und Wirt ermöglichen kann. Zusammenfassend haben wir die EVs eines neu isolierten, aus dem Darm stammenden B. longum anhand von Morphologie, Größe, Inhalt und immunmodulatorischen Aktivitäten charakterisiert. Unsere Ergebnisse, die die durch Elektrofahrzeuge vermittelte Aktivierung von Immunzellen belegen, können zu zukünftigen Studien führen, in denen ihre Auswirkungen in vivo, auf Gesundheit und Krankheit bewertet werden, und diese spezifischen Elektrofahrzeuge als potenzielle zukünftige Therapeutika in Betracht gezogen werden.

B. longum AO44 wurde auf Brain Heart Infusion-Agarplatten (BHI, BD BBLTM) aufgetaut, ergänzt mit 5 µg/ml Hämin (Alfa Aesar) in 1 N NaOH und 2,5 µg/ml Vitamin K (Thermo Fisher Scientific) in 100 % EtOH ( früher als BHIS bezeichnet), bei 37 °C in einer anaeroben Kammer, 85 % N2, 10 % CO2, 5 % H2 (COY).

B. longum AO44 wurde bei 37 °C unter anaeroben Bedingungen vorkultiviert. Zuerst in 10 ml BHIS oder GAM in einem ca. 20 ml Hungate-Röhrchen und dann mit 0,5 % v/v auf 900 ml BHIS oder GAM in einer 1-l-Glasflasche bei 37 °C unter anaeroben Bedingungen beimpft. Nach 4-tägiger Inkubation bei 37 °C wurden der Überstand und die Zellen durch Zentrifugation (7500 × g, Thermo Fisher Scientific Sorvall R6-Zentrifuge mit 1Lx4-Flaschenrotor) getrennt.

Überstandsfraktionierung – Die 10-fache Überstandsfraktion (dh roher konzentrierter Überstand) wurde durch Eindampfen des zentrifugierten Überstands auf 1/10 Volumen mittels Rotationsverdampfer hergestellt. Überstand-Methanol-Fraktionen wurden wie folgt hergestellt: 10 ml des zentrifugierten Überstands wurden zunächst zur Trockne lyophilisiert. Zum trockenen Rückstand wurden 30 ml Methanol gegeben. Nach dem Mischen mit einem Spatel und Ultraschallbehandlung (15 Minuten) wurde die gemischte Lösung über Nacht bei Raumtemperatur (RT) stehen gelassen, um die Moleküle vollständig in Methanol zu extrahieren. Die Methanollösung wurde vorsichtig von den unlöslichen Rückständen entfernt. Diese Methanolfraktion (30 ml) wurde im Vakuum zur Trockene konzentriert und in 1 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) erneut gelöst. Die Überstand-Wasser-Fraktion wurde wie folgt hergestellt: Die unlöslichen Rückstände aus dem obigen Verfahren wurden in 1 ml Wasser gelöst.

Zellpelletfraktionierung – Zell-Chloroform-Fraktion wurde wie folgt hergestellt: Zellpellets aus der 1-l-Kultur wurden in 300 ml Chloroform:Methanol = 1:1 (v/v) eingeweicht. Nach dem Mischen mit einem Spatel und Ultraschallbehandlung (15 Minuten) wurde die gemischte Lösung über Nacht bei RT belassen, um die Moleküle vollständig in organischem Lösungsmittel zu extrahieren. Der Extrakt wurde von den Zellpellets entfernt, filtriert und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Dem trockenen Rückstand wurden dann 30 ml Chloroform zugesetzt, mit einem Spatel und durch Ultraschallbehandlung (15 Minuten) gemischt und über Nacht bei RT belassen, damit die Moleküle vollständig in das organische Lösungsmittel extrahiert wurden. Die Chloroformlösung wurde von den unlöslichen Rückständen befreit, im Vakuum eingeengt und anschließend erneut in 3 ml DMSO gelöst. Zell-Methanol-Fraktionen wurden wie folgt hergestellt: Die unlöslichen Rückstände aus dem obigen Zell-Chloroform-Extraktionsprozess wurden in 30 ml Methanol gelöst, mit einem Spatel und durch Ultraschallbehandlung (15 Minuten) gemischt und über Nacht bei RT stehen gelassen, um eine vollständige molekulare Extraktion zu ermöglichen organische Lösung. Die Methanollösung wurde von den unlöslichen Rückständen entfernt, im Vakuum konzentriert und erneut in 3 ml DMSO gelöst.

B. longum AO44 wurde in 10 ml BHIS bei 37 °C unter anaeroben Bedingungen über Nacht gezüchtet. Die Bakterienkultur wurde dann 1:40 auf 200 ml BHIS verdünnt und 8 Stunden lang bei 37 °C unter anaeroben Bedingungen gezüchtet. Eine zweite Verdünnung von 1:20 wurde durchgeführt und die Bakterien wurden 16 Stunden lang bei 37 °C unter anaeroben Bedingungen gezüchtet. Die Kultur wurde 30 Minuten lang bei 8000 × g zentrifugiert und dann zweimal durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,45 µm und einen Filter mit einer Porengröße von 0,22 µm filtriert. Der filtrierte Überstand wurde dann unter Verwendung von Centricon® Plus-70-Zentrifugalfiltereinheiten (Merck) mit einem 100-kDa-Ausschluss konzentriert. Der verbleibende Überstand wurde 1 Stunde lang bei 4 ° C und 100.000 × g ultrazentrifugiert, um das Membranvesikelpellet zu erhalten. Nach der Ultrazentrifugation wurde die obere Flüssigkeit verworfen und das Vesikelpellet in 1 ml steriler Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) resuspendiert, mit einem Filter mit einer Porengröße von 0,22 µm filtriert und bei –80 °C eingefroren. Die Vesikelgrößenverteilung wurde mit NanoSight gemessen.

Die Milzen wurden von C57BL/6 SPF-Mäusen entnommen und auf einem 40-µm-Zellsieb mit 1 ml ACK-Lysepuffer (Thermo Fisher Scientific) 1–2 Minuten lang mechanisch aufgeschlossen. Die Zellen wurden dann in 20 ml eiskaltes RPMI-Medium (Sartorius) übertragen und 10 Minuten lang bei 4 ° C und 300 × g zentrifugiert. Die Zellen wurden zweimal mit 10 ml eiskaltem RPMI gewaschen, gezählt und mit RPMI bei 37 °C auf eine Endkonzentration von 2 Millionen Zellen/ml verdünnt. Anschließend wurden die Zellen mit 0,05 mM β-Mercaptoethanol (Merck) und Anti-CD3 (0,5 µg/ml, 145-2C11, BioLegend) zur suboptimalen Aktivierung der T-Zellen ergänzt. 100 µl Zellen wurden in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte ausplattiert und mit 100 µl verdünnten Fraktionen (1:250-Verdünnung) oder Vesikeln (1:50–1:31.250-Verdünnung) versetzt. Die Zellen und ihre Medien wurden 5 Tage später zur Durchflusszytometrie und ELISA-Analyse gesammelt.

Die Milzen wurden von C57BL/6 SPF-Mäusen entnommen. Zur Extraktion von DC wurde der Milz Kollagenase II in einer Konzentration von 1 mg/ml in RPMI-Medium injiziert, 30 Minuten bei 37 °C inkubiert und dann auf einem 40-µm-Zellsieb mechanisch aufgeschlossen. Zur Extraktion von CD4+-T-Zellen wurde die Milz auf einem 40-µm-Zellsieb mit 1 ml PBS, das 2 % fötales Rinderserum (FBS) enthielt, mechanisch aufgeschlossen. Die Zellen wurden dann zweimal mit 10 ml PBS oder Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), enthaltend 2 % FBS und 1 mM EDTA, gewaschen und 5 Minuten bei Raumtemperatur und 300 × g zentrifugiert. Zellen aus jeder Milz wurden entweder zur Isolierung von DC unter Verwendung des EasySep™ Mouse Pan-DC Enrichment Kit (STEMCELL Technologies Inc.) oder von CD4+ T-Zellen unter Verwendung des EasySep Mouse CD4+ T Cell Isolation Kit (STEMCELL Technologies Inc.) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. 50 µl isolierte DC wurden in einer 96-Well-Platte in RPMI-Medium mit einer Endkonzentration von 400.000 Zellen/ml ausplattiert. 50 µl isolierter CD4+-T-Zellen wurden in derselben 96-Well-Platte in RPMI-Medium mit einer Endkonzentration von 2 Millionen Zellen/ml ausplattiert. Anschließend wurden die Zellen mit 0,05 mM β-Mercaptoethanol (Merck) und Anti-CD3 (0,5 µg/ml, 145-2C11, BioLegend) zur suboptimalen Aktivierung der CD4+-T-Zellen ergänzt. Anschließend wurde die Kokultur von DC-CD4+-T-Zellen mit 100 µl verdünnten Vesikeln (1:50-Verdünnung) und konzentriertem BHIS als Kontrolle (1:50-Verdünnung) versetzt. Die Zellmedien wurden 3 Tage später für die ELISA-Analyse gesammelt.

Kryo-TEM-Proben wurden in einem Verglasungssystem mit kontrollierter Umgebung (CEVS)54 bei kontrollierter Temperatur (25 °C) und 100 % relativer Luftfeuchtigkeit hergestellt. Ein 4-μl-Tropfen der Lösung wurde auf einen mit Kohlenstoff beschichteten perforierten Film aufgetragen, der auf einem TEM-Gitter (Lacey Formvar/Kohlenstofffilme auf 200-Mesh-Kupfergitter, Ted Pella Inc., Redding, USA) getragen und mit einer Pinzette im CEVS gehalten wurde. Die Gitter wurden zuvor in einem PELCO EasiGlow Glimmentlader (Ted Pella Inc., Redding, USA) plasmageätzt, um ihre Hydrophilie zu erhöhen. Überschüssige Flüssigkeit wurde zweimal mit Filterpapier von der Rückseite des Gitters abgetupft, um einen für die Bildgebung geeigneten dünnen Film zu bilden. Anschließend wurde die Lösung verglast, indem das Gitter schnell in flüssiges Ethan bei seinem Gefrierpunkt (−183 °C) getaucht wurde. Die Proben wurden bis zur Bildgebung in einem Dewar-Gefäß mit flüssigem Stickstoff gelagert. Die Proben wurden mit einem Thermo-Fisher Scientific Talos 200C, einem hochauflösenden TEM, das bei 200 kV betrieben wird und mit einer Feldemissionskanone (FEG) ausgestattet ist, und einer Direktbildkamera Falcon III abgebildet. Die Übertragung der Proben in das Mikroskop erfolgte mit einem Gatan 626-Kryohalter, der bei –180 °C gehalten wurde. Alle Bilder wurden mit einer Niedrigdosis-Bildgebung aufgenommen, um Schäden durch Elektronenstrahlen zu minimieren, und mit einer Volta-Phasenplatte (VPP), um den Bildkontrast zu verbessern.

Bakterien wurden über Nacht bei 37 °C unter anaeroben Bedingungen in einer anaeroben Kammer in BHIS-Medium, ergänzt mit HADA (0,8 mM, Tocris, Bio-Techne), gezüchtet, Gesamtvolumen 10 ml55. Markierte Bakterien wurden durch 5-minütige Zentrifugation bei 7500 × g vom Medium getrennt. Anschließend wurden die Vesikel wie oben beschrieben isoliert und mit dem BD FACSymphonyTM A1 detektiert, einem Durchflusszytometrie-Analysegerät mit einem Kleinpartikeldetektor, der Partikel mit einer Größe von bis zu 90 nm erkennen kann. Verwendete Spannungen: FS – 550, SS – 650, SP SSC – 450, BV421 – 460.

Aus Gründen der Konsistenz wurde eine konstante Gruppe von Antikörpern verwendet. Das Panel umfasste Antikörper gegen CD4 (RMA-5), CD8 (53-6.7), TCRß (H57-597), CD19 (6D5), Ki67 (16A8), PD-1 (29F.1A12, alle von BioLegend). Zur intrazellulären Färbung von Transkriptionsfaktoren wurden die Zellen auf Oberflächenmarker gefärbt und in Fix/Perm-Puffer (eBioscience) für 30–60 Minuten bei RT fixiert und in Permeabilisierungspuffer (eBioscience) für 30 Minuten bei RT in Gegenwart von Antikörpern permeabilisiert. Die Zellen wurden mit einem BD BioSciences® LSRFortessa erfasst und die Analyse mit der Kaluza® Analysis Software durchgeführt. Konzentration, Klon und Quelle der Antikörper wurden konstant gehalten, um eine einheitliche Färbung sicherzustellen.

Die IL-10- und IL-17-Konzentrationen in Splenozyten und DC-CD4+-T-Zellmedien wurden mit dem Mouse IL-10 and IL-17 ELISA MAXTM Standard Kit (BioLegend) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. ELISA-Nachweisgrenzen: IL-10 – 31,5–2000 pg/ml, IL-17 – 15,6–1000 pg/ml.

Die EVs und Überstandsproben wurden in 10 mM Dithiothreitol (DTT), 100 mM Tris und 5 % Natriumdodecylsulfat (SDS) gelöst, mit Ultraschall behandelt und 5 Minuten lang bei 95 °C gekocht und in 80 % Aceton ausgefällt. Die Proteinpellets wurden in 9 M Harnstoff und 400 mM Ammoniumbicarbonat gelöst, dann mit 3 mM DTT reduziert (30 Min. bei 60 °C) und mit 10 mM Iodacetamid in 100 mM Ammoniumbicarbonat (30 Min. bei RT im Dunkeln) modifiziert. und in 2 M Harnstoff, 25 mM Ammoniumbicarbonat mit modifiziertem Trypsin (Promega) über Nacht bei 37 °C in einem Enzym-zu-Substrat-Verhältnis von 1:50 (M/M) verdaut. Die tryptischen Peptide wurden mit einer selbstgebauten C18-Stufenspitze entsalzt, getrocknet und in 0,1 % Ameisensäure resuspendiert. Die Peptide wurden durch Umkehrphasenchromatographie auf 0,075 × 300 mm großen Quarzglaskapillaren (J&W), gefüllt mit Reprosil-Umkehrphasenmaterial (Dr. Maisch GmbH, Deutschland), aufgetrennt. Die Peptide wurden mit einem linearen 60-minütigen Gradienten von 5 % bis 28 %, einem 15-minütigen Gradienten von 28 % bis 95 % und 15 Minuten bei 95 % Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure in Wasser bei Flussraten von 0,15 μl/min eluiert. Die Massenspektrometrie wurde mit einem Q Exactive HF-Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific) im positiven Modus (m/z 300–1800, Auflösung 60.000 für MS1 und 15.000 für MS2) unter Verwendung wiederholter vollständiger MS-Scans, gefolgt von einer durch hohe Kollisionen induzierten Dissoziation (HCD, bei 27 normalisierter Kollisionsenergie) der 18 dominantesten Ionen (>1 Ladung), ausgewählt aus dem ersten MS-Scan. Eine dynamische Ausschlussliste wurde mit einer Ausschlussdauer von 20 s aktiviert. Die Massenspektrometriedaten wurden mit der MaxQuant-Software 1.5.2.856 zur Peakauswahl und -identifizierung mithilfe der Andromeda-Suchmaschine analysiert, wobei nach dem Proteom von Bifidobacterium longum aus der Uniprot-Datenbank mit einer Massentoleranz von 6 ppm für die Vorläufermassen und 20 ppm für das Fragment gesucht wurde Ionen. Oxidation an Methionin und Protein-N-Terminus-Acetylierung wurden als variable Modifikationen akzeptiert und Carbamidomethyl an Cystein wurde als statische Modifikation akzeptiert. Die minimale Peptidlänge wurde auf sechs Aminosäuren festgelegt und es waren maximal zwei Fehlspaltungen zulässig. Die Daten wurden durch markierungsfreie Analyse mit derselben Software quantifiziert. Die Falscherkennungsraten (FDRs) auf Peptid- und Proteinebene wurden mithilfe der Target-Decoy-Strategie auf 1 % gefiltert. Proteintabellen wurden gefiltert, um die Identifizierungen aus der Reverse-Datenbank, häufige Kontaminanten und einzelne Peptididentifizierungen zu eliminieren57.

Für die Bakterienzellproben wurden die Peptide mit einem linearen 180-minütigen Gradienten von 5 % bis 28 %, einem 15-minütigen Gradienten von 28 % bis 95 % und 25 Minuten bei 95 % Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure in Wasser bei Flussraten von eluiert 0,15 μl/min. Die Massenspektrometrie wurde mit dem Exploris 480-Massenspektrometer (Thermo) im positiven Modus (m/z 350–1200, Auflösung 120.000 für MS1 und 15.000 für MS2) unter Verwendung wiederholter vollständiger MS-Scans, gefolgt von einer hohen kollisionsinduzierten Dissoziation (HCD, bei 27 normalisiert) durchgeführt Kollisionsenergie) der 30 dominantesten Ionen (>1 Ladung), ausgewählt aus dem ersten MS-Scan. Eine dynamische Ausschlussliste wurde mit einer Ausschlussdauer von 30 s aktiviert. Die MS-Datenanalyse erfolgte ähnlich wie bei den EV-Proben.

In dieser Studie wurde der B. longum-Stamm AO44, ein menschliches Isolat, verwendet16 (Brigham and Women's Hospital). Die genomische DNA wurde mit dem ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit (Zymo Research) extrahiert. Die DNA wurde mit Illumina MiSeq PE 2x150 sequenziert und die verwendete Assemblierungsmethode war SPAdes v3.15.3.

Die massenspektrometrische Analyse der Identifizierung und Quantisierung des Proteominhalts der Vesikel wurde mit der Software Perseus 1.6.10.43 durchgeführt. Alle anderen statistischen Analysen wurden mit Prism-GraphPad durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die in dieser Studie analysierten Daten sind im Artikel und seiner ergänzenden Tabellendatei verfügbar. Die Gesamtgenomsequenz von B. longum wurde bei der GenBank unter der Zugangsnummer PRJNA908295 hinterlegt. Die Massenspektrometrie-Proteomikdaten wurden über das PRIDE-Partner-Repository, Datensatz-ID PXD038667, beim ProteomeXchange-Konsortium hinterlegt. Weitere Daten sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Wir möchten den Mitgliedern des Geva-Zatorsky-Labors für fruchtbare Diskussionen und Beiträge danken. Besonderer Dank geht an Rachel Herren vom Geva-Zatorsky-Labor für das Korrekturlesen. Wir danken Lihi Shaulov vom BCF-Team, der Elektronenmikroskop-Abteilung der Rappaport Faculty of Medicine, Technion, und Amir Grau vom Biomedical Core Facility (BCF)-Team, der Durchflusszytometrie-Abteilung der Rappaport Faculty of Medicine als Marina Nudelman von BD Bioscience. Wir danken dem Smoler Proteomics Center am Technion für Hilfe bei der Proteomik sowie Inna Kovrigina und Prof. Marcelle Machluf von der Fakultät für Biotechnologie und Lebensmitteltechnik am Technion für Hilfe beim NanoSight. Die Kryo-TEM-Arbeit wurde am Technion Center for Electron Microscopy of Soft Matter durchgeführt. Besonderer Dank geht an Prof. Neta Regev-Rudzki und Dr. Ruthie Shouval und Meirav Pevsner-Fischer vom Shouval-Labor der Weizmann-Institute für aufschlussreiche Diskussionen und Vorschläge. Diese Arbeit wurde vom Technion Institute of Technology, „Keren Hanasi“, Cathedra, dem Rappaport Technion Integrated Cancer Center, dem Alon Fellowship for Outstanding Young Researchers, der Israeli Science Foundation (Stipendium 1571/17 und 3165/20) und dem Seerave unterstützt Foundation, dem Israel Cancer Research Fund Research Career Development Award, dem Canadian Institute for Advanced Research (CIFAR), dem Human Frontier Science Program Career Development Award (Grant CDA00025/2019-C), dem Gutwirth Foundation Award, dem D. Dan and Betty Schenkung der Kahn-Stiftung an die University of Michigan, das Weizmann Institute und das Technion–Israel Institute of Technology Collaboration for Research sowie die Europäische Union (ERC, ExtractABact, 101078712). Die geäußerten Ansichten und Meinungen sind jedoch ausschließlich die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die der Europäischen Union oder der Exekutivagentur des Europäischen Forschungsrats wider. Weder die Europäische Union noch die Bewilligungsbehörde können hierfür haftbar gemacht werden. NGZ ist CIFAR-Stipendiat im Humans & the Microbiome-Programm, Kavli-Stipendiat und Horev-Stipendiat (Taub Foundation). NM wird durch das RTICC-Rubinstein-Stipendium unterstützt. LZ ist Empfänger von JSPS Overseas Research Fellowships.

Abteilung für Zellbiologie und Krebswissenschaft, Rappaport-Fakultät für Medizin und Forschungsinstitut, Rappaport Technion Integrated Cancer Center (RTICC), Technion-Israel Institute of Technology, Haifa, 31096, Israel

Noa Mandelbaum, Shaqed Carasso, Elliot Berinstein, Tal Gefen und Naama Geva-Zatorsky

Abteilung für Chemie und Chemische Biologie, Harvard University, Cambridge, MA, USA

Lihan Zhang und Emily P. Balskus

Smoler Proteomics Center, Lokey Interdisciplinary Center for Life Sciences & Engineering, Technion-Israel Institute of Technology, Haifa, 3200003, Israel

Tamar Ziv

Abteilung für Chemieingenieurwesen und Russell Berrie Nanotechnology Institute (RBNI), Technion-Israel Institute of Technology, Haifa, 3200003, Israel

Sapir Lifshiz-Simon, Irina Davidovich und Yeshayahu Talmon

Die Shraga Segal-Abteilung für Mikrobiologie, Immunologie und Genetik, Fakultät für Gesundheitswissenschaften, Ben-Gurion-Universität, Beer-Sheva, 84105, Israel

Ishai Light & Tomer Köche

Howard Hughes Medical Institute, Harvard University, Cambridge, MA, USA

Emily P. Balskus

Mensch und Mikrobiom, CIFAR, Toronto, Kanada

Naam Geva-Zatorsky

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Konzeptualisierung der Studie: NM, TG und NGZ, alle Experimente und Analysen wurden von NM und TG durchgeführt. Einige Experimente wurden von LZ und EB durchgeführt. Die Zusammenstellung des Bakteriengenoms wurde von SCTZ durchgeführt, das alle Proteomikanalysen durchführte. Die Kryo-TEM-Bildgebung wurde von YT, SLS und ID durchgeführt. Ein Teil der NanoSight-Experimente wurde von IL und TC durchgeführt. Die Konzeptualisierung des ersten Teils der Studie wurde von EPB, LZ, NM, TG und NGZ durchgeführt. Vorbereitung des Originalentwurfs durch NM , TG und NGZ Alle Autoren haben zum Artikel beigetragen und die eingereichte Version genehmigt.

Korrespondenz mit Naama Geva-Zatorsky.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Mandelbaum, N., Zhang, L., Carasso, S. et al. Extrazelluläre Vesikel des grampositiven Darmsymbionten Bifidobacterium longum induzieren immunmodulatorische und entzündungshemmende Wirkungen. npj Biofilms Microbiomes 9, 30 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00400-9

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Eingegangen: 05. Dezember 2022

Angenommen: 18. Mai 2023

Veröffentlicht: 03. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00400-9

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