Enthüllung der Proteoformen von Corynebacterium glutamicum durch die Oberseite

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 2602 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Corynebacterium glutamicum ist ein Bakterium, das häufig in der industriellen Produktion von Aminosäuren sowie einer breiten Palette anderer biotechnologischer Produkte eingesetzt wird. Die vorliegende Studie beschreibt die Charakterisierung von C. glutamicum-Proteoformen und ihrer posttranslationalen Modifikationen (PTMs) unter Verwendung von Top-Down-Proteomik. Trotz früherer Hinweise darauf, dass PTMs eine Rolle bei der Regulierung des Metabolismus von C. glutamicum spielen, ist dies die erste Top-Down-Proteomanalyse dieses Organismus. Wir identifizierten 1125 Proteoformen aus 273 Proteinen, wobei 60 % der Proteine mindestens eine Massenverschiebung aufwiesen, was auf das Vorhandensein von PTMs schließen lässt, darunter mehrere acetylierte, oxidierte und formylierte Proteoformen. Darüber hinaus wurden Proteine identifiziert, die für die Aminosäureproduktion, die Proteinsekretion und den oxidativen Stress relevant sind und deren Massenverschiebungen auf das Vorhandensein nicht charakterisierter PTMs und Proteoformen schließen lassen, die biotechnologisch relevante Prozesse in diesem industriellen Arbeitstier beeinflussen könnten. Beispielsweise wurden die Membranproteine mepB und SecG als gespaltene bzw. formylierte Proteoform identifiziert. Während OdhI im Zentralstoffwechsel als zwei Proteoformen mit potenzieller biologischer Relevanz identifiziert wurde: eine gespaltene Proteoform und eine Proteoform mit PTMs, die einer Massenverschiebung von 70 Da entsprechen.

Das Bakterium Corynebacterium glutamicum ist ein industrielles Arbeitstier, das in der Lage ist, ein breites Spektrum an Biomolekülen aus einem großen Substratpool1 zu produzieren und ist derzeit die beste Option für die Produktion von L-Alpha-Aminosäuren2. Die Aminosäureproduktion stellt einen Multimilliarden-Dollar-Markt dar3 mit einer jährlichen Produktion von etwa 10 Millionen Tonnen weltweit2, wobei L-Glutamat und L-Lysin 3,3 Millionen Tonnen/Jahr bzw. 2,2 Millionen Tonnen/Jahr entsprechen2. Neben der Aminosäureproduktion wird C. glutamicum auch in anderen biotechnologischen Prozessen eingesetzt, beispielsweise bei der Produktion von heterologen Proteinen4, organischen Säuren5, Carotinoiden, Isobutanol6 und Polymeren7. In jüngerer Zeit wurde sein Potenzial in biologischen Sanierungsprozessen untersucht8.

Jüngste Entwicklungen in der Proteomik haben die Bedeutung posttranslationaler Modifikationen (PTMs) bei mehreren Bakterienarten gezeigt9. In C. glutamicum wurde die Bedeutung von PTMs zuvor untersucht und die entscheidende Wirkung der Phosphorylierung des Oxoglutarat-Dehydrogenase-Inhibitors (OdhI) auf die Produktion von L-Glutamat aufgezeigt10,11. In jüngerer Zeit zeigte die massenspektrometrische Proteomik von C. glutamicum den Einfluss von L-Glutamat-produzierenden Bedingungen auf die Succinylierung und Acetylierung von C. glutamicum-Stoffwechselproteinen, einschließlich OdhI12.

Derzeit gibt es zwei Hauptansätze der Proteomik, die als Bottom-Up- und Top-Down-Ansätze bezeichnet werden. Kurz gesagt werden beim Bottom-up-Ansatz Proteine durch eine Protease (normalerweise Trypsin) gespalten und die daraus resultierenden Peptide massenspektrometrisch analysiert, während beim Top-down-Ansatz Proteine in ihrer intakten Form untersucht werden13. Als Folge der Protease-Verdauung können bei Bottom-up-Ansätzen, einschließlich PTMs, Informationen aus mehreren Proteinregionen verloren gehen. Darüber hinaus wird bei diesem Ansatz die Proteinidentität auf der Grundlage der Peptididentifizierung abgeleitet, was in Fällen, in denen Peptide zu mehr als einem Protein gehören, zu Mehrdeutigkeiten führen kann13. Im Gegensatz dazu ermöglicht der Top-Down-Ansatz die Identifizierung der gesamten Proteinsequenz. Darüber hinaus ermöglicht die Analyse intakter Proteinformen die Identifizierung von Proteoformen, definiert als verschiedene Formen von Proteinen, die von demselben Gen stammen14. Solche Proteoformen können durch Aminosäurerestsubstitution, proteolytische Spaltung, alternatives Spleißen und verschiedene Arten von PTMs15 erzeugt werden. Darüber hinaus können verschiedene Proteoformen desselben Proteins unterschiedliche Funktionen haben und biologische Prozesse eines Organismus beeinflussen16. Die Leistungsfähigkeit der Top-Down-Proteomik wurde auf andere Bakterien angewendet17. Beispielsweise wurde eine Top-Down-Proteomik von Escherichia coli und die Identifizierung von Proteoformen durchgeführt18. Trotz der Belege für die Relevanz von PTMs im Metabolismus von C. glutamicum wurden bisher keine Top-Down-Proteomstudien veröffentlicht. Hier haben wir die erste Top-Down-Proteomikanalyse von C. glutamicum durchgeführt und dabei einen Vorläufer-toleranten Ansatz verwendet, um PTMs und Proteoformen zu identifizieren und aufzudecken.

Wie erwartet konnte in den vorfraktionierten intrazellulären Proteinen ein breites Spektrum an Proteoform-Molekülmassen beobachtet werden, GELFrEE war jedoch effizient bei der Trennung großer Proteoformen von kleineren Formen (Abb. 1A). Die Fraktionen 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9 und 11 zeigten Proteoformen unter 50 kDa und wurden aus diesem Grund für die anschließende LC-MS/MS-Analyse ausgewählt. Trotz des deutlichen Vorhandenseins von Proteinen im Bereich von 30–50 kDa, wie durch SDS-PAGE gezeigt (Abb. 1A), wurden in der LC-MS-Analyse Proteoformen überwiegend unter 30 kDa nachgewiesen (ergänzende Abb. S1). Die verringerte Anzahl beobachteter Proteoformen mit mehr als 30 kDa kann auf bekannte Herausforderungen bei der Identifizierung denaturierter großer Proteoformen zurückzuführen sein, wie z. B. die Verringerung des Signal-Rausch-Verhältnisses, die mit zunehmendem Molekulargewicht der Proteoformen auftritt19.

SDS-PAGE von GELFrEE-Fraktionen und globales Profil der identifizierten Massenverschiebungen (Δm). (A) SDS-PAGE der Fraktionen, die aus GELFrEE (dargestellt durch die Zahlen) und der vorfraktionierten Probe (T) resultieren. (B) Differenz der beobachteten und theoretischen Vorläufermassen (Massenverschiebungen, Δm) PrSMs-Zählhistogramm, wobei die zehn häufigsten Δm in verschiedenen Farben hervorgehoben werden. Der Behälter wurde auf 1 und x-Grenzwerte auf –500 Da und 500 Da eingestellt.

Die Top-Down-Proteomanalyse von C. glutamicum ergab 5127 Proteoform-Spektrum-Übereinstimmungen (PrSMs), was die Identifizierung von 1125 verschiedenen Proteoformen im Zusammenhang mit 273 verschiedenen Proteinen ermöglichte (ergänzende Tabelle 1). Ungefähr 65 % (177 Proteine) der gesamten Proteinzahl und 47 % der PrSMs (2423 PrSMs) wurden mit Massenverschiebungen (Δm), Massenunterschieden zwischen der erwarteten Vorläufermasse und der beobachteten Vorläufermasse, identifiziert, was auf das Vorhandensein von PTMs schließen lässt. Mutmaßliche PTMs wurden in der ergänzenden Tabelle 1 unter Verwendung der gesamten Unimod-Datenbank kommentiert. Diese Informationen sollten jedoch mit Vorsicht verwendet werden, da die Spektren nicht manuell überprüft wurden und die Software für Vergleiche gerundete Massenverschiebungen berücksichtigte, was zu einer Toleranz von etwa 0,5 Da führte. Zur Spektrenvisualisierung und weiteren Auswertung von PTMs steht Software zur Verfügung, darunter ProSight Lite20 und TopMSV21. Die Analyse aller PrSMs mit Δm ergab eine große Diversität von Δm, was auf das Vorhandensein verschiedener PTMs schließen lässt (Abb. 1B).

Einige der hier identifizierten häufigsten Δm wurden auch in Escherichia coli durch Bottom-up-Proteomik unter Verwendung einer unvoreingenommenen Identifizierungsstrategie als stark vorhanden gemeldet22. Bei C. glutamicum waren die am häufigsten identifizierten Massenverschiebungen 16 Da (mutmaßliche Oxidation, 10,15 % der modifizierten PrSMs), –18 Da (mutmaßliche Dehydratisierung, 2,97 % der modifizierten PrSMs) und 32 Da (mögliche Doppeloxidation, 1,32 % der modifizierten PrSMs). modifizierte PrSMs). Interessanterweise war der Anteil der in E. coli identifizierten Peptidspektrum-Übereinstimmungen (PSMs) mit -18 Da (3,8 %) und 32 Da (0,8 %) Δm denen in dieser Studie sehr ähnlich. Im Gegensatz dazu war der Anteil der PSMs, die mit 16 Da (24 %) Δm identifiziert wurden, in E. coli größer als in C. glutamicum. Es ist jedoch erwähnenswert, dass die hohe Anzahl von PrSMs, die mit 15 Da Δm identifiziert wurden (6,11 % der modifizierten PrSMs), möglicherweise auf eine fehlerhafte Identifizierung von 16 Da Δm zurückzuführen ist, wie in den nächsten Themen weiter erläutert wird.

Mit Δm identifizierte Proteine wurden mit der String Cytoscape-App analysiert. Nach der Clusterung der Proteine nach ihren Interaktionsknoten wurde jeder Cluster einer Überrepräsentationsanalyse unterzogen und die repräsentativsten Begriffe wurden mit verschiedenen Genontologiebegriffen wie proteinhaltigen Komplexen und Elektronentransferaktivität in Zusammenhang gebracht und CYTH-Domäne (CyaB, Thiamintriphosphatase), Pyrimidin-Metabolismus, Transmembranhelix, Biosynthese von Sekundärmetaboliten und Thioredoxin-Domäne. Darüber hinaus wiesen acht ribosomale PrSMs zwei Δm auf, was auf das Vorhandensein von mindestens zwei gleichzeitig auftretenden PTMs hinweist (ergänzende Abbildung S2).

Über die funktionelle Annotation hinaus analysierten wir die Anzahl der N-terminalen Acetylierungen und einige häufig identifizierte Δm: 16 Da, 15 Da, 28 Da, 266 Da, -18 Da und 32 Da (Abb. 2A). Diese Δm deuten auf das Vorhandensein von Oxidation (UnimodAC: 35, Δm = 15,994915 Da), Desamidierung gefolgt von einer Methylierung (UnimodAC: 528, Δm = 14,999666 Da), Formylierung (UnimodAC: 122, Δm = 27,994915 Da) und Natriumdodecylsulfat ( SDS)-Addukte23, Dehydratisierung (UnimodAC: 23, Δm = −18.010565 Da) und Persulfid (UnimodAC: 421, Δm = 31.972071 Da). Die Massenverschiebung um 28 Da könnte auch einer Dimethylierung entsprechen (Unimod: 36, Δm = 28,031300 Da). Obwohl es schwierig ist, zwischen Formylierung und Dimethylierung zu unterscheiden, lässt die höhere Zahl von Δm nahe 27,99 Da und 27,98 Da (Ergänzungstabelle 2) auf Formylierungsereignisse schließen. Die Aminosäurerest-Lokalisierung der 28-Da-Massenverschiebung war nicht eindeutig möglich, wie aus dem Fehlen dieser Massenverschiebung in Abb. 2B hervorgeht. Ein möglicher Grund dafür ist, dass die vorgeschlagenen Formylierungsereignisse hauptsächlich am N-Terminus von Proteinen identifiziert wurden und ihre Zuordnung immer zwischen einigen wenigen N-terminalen Resten des Proteins erfolgte, wie im Fall des Proteins MscL (ergänzende Abb. 7). Wenn die Zuordnung der Massenverschiebung in mehr als einem Aminosäurerest erfolgte, wurden die Informationen zur Vermeidung von Mehrdeutigkeiten nicht aufgezeichnet. Die vorgeschlagenen Oxidationsereignisse im Zusammenhang mit dem 16 Da Δm werden durch eine große Anzahl von Methioninresten, die durch diese Massenverschiebung modifiziert wurden, weiter gestützt (Abb. 2B). Andererseits scheint 15 Da Δm manchmal falsch interpretiert zu werden, da der am häufigsten identifizierte Rest mit dieser Modifikation ebenfalls Methionin war. Allerdings wurden einige Glutaminsäurereste mit diesem Δm identifiziert, was darauf hindeutet, dass in einigen Fällen noch eine Desamidierung gefolgt von einer Methylierung vorliegen kann, diese jedoch leicht mit Oxidationen verwechselt werden kann (Abb. 2B). Die in einigen Proteinen identifizierte Massenverschiebung um 32 Da könnte mit Persulfid-PTM in Zusammenhang stehen. Diese Modifikation tritt jedoch in Cystein und Asparaginsäure auf, und keines davon konnte in den eindeutig identifizierten Resten beobachtet werden (Abb. 2B). Eine andere Möglichkeit wären zwei Oxidationen, unterstützt durch die mit dieser Massenverschiebung identifizierten Methioninreste. Andererseits sollte die Möglichkeit einer Persulfidmodifikation nicht ausgeschlossen werden, vor allem bei Proteinen, bei denen der modifizierte Aminosäurerest nicht eindeutig identifiziert werden konnte. Die Proteinoxidation kann in biologischen Prozessen von großer Bedeutung sein, es ist jedoch wichtig zu beachten, dass es sich auch um ein Artefakt handeln kann, das durch die Probenhandhabung verursacht wird24. Darüber hinaus betrugen mehrere Δm etwa 266 Da, was auf das Vorhandensein von Addukten aus Natriumdodecylsulfat (SDS) schließen lässt. Das Vorhandensein von SDS-Artefakten wurde auch in einer intakten Proteomanalyse von E. coli berichtet und vermutet, dass diese durch eine unvollständige Entfernung des Detergens verursacht wurden25. Was das −18 Da Δm anbelangt, kann es auf Dehydrierungsereignisse zurückzuführen sein und wurde überwiegend in Serinresten identifiziert (Abb. 2B). Diese vorherrschenden Massenverschiebungen können auch mit anderen mutmaßlichen PTMs zusammenhängen, wie z. B. der Tyrosinoxidation zu 2-Aminotyrosin (UnimodAC: 342, Δm = 15,010899 Da) für Massenverschiebungen von 15 Da. Diese Möglichkeiten können für jedes identifizierte PrSM in der Ergänzungstabelle 1 separat beobachtet werden. Die N-terminale Acetylierung war das am häufigsten identifizierte PTM (Abb. 2A); Andererseits wurde die Massenverschiebung von 42 Da, die auf eine Lysinacetylierung schließen lässt (UnimodAC: 1, Δm = 42,010565 Da), nicht häufig festgestellt (ergänzende Tabelle 2). Bei der Identifizierung von Proteoformen wurde die N-terminale Acetylierung als variable Modifikation verwendet. Daher könnten Proteoformen mit Lysinacetylierung in der Nähe des N-Terminus ohne Fragmente zur Erklärung der 42-Massenverschiebung zu einem Lysinrest fälschlicherweise mit einer N-terminalen Acetylierung identifiziert werden.

Anzahl der identifizierten PrSMs und Proteinakzessionen der häufigsten Modifikationen und Verhältnis der eindeutig identifizierten Reste jeder Massenverschiebung. (A) Anzahl der Proteoform-Spektrum-Übereinstimmungen (PrSMs) und Proteine, die mit den häufigsten Massenverschiebungen und N-terminaler Acetylierung identifiziert wurden. (B) Verhältnis der Anzahl PrSMs eines durch jede Massenverschiebung modifizierten Aminosäurerests (Δm) und der Gesamtzahl der PrSMs, die mit demselben Δm identifiziert wurden. Beispielsweise beträgt die Anzahl der mit einer Massenverschiebung von 16 Da (41 PrSMs) identifizierten Methionine/Anzahl aller mit 16 Da Δm (85 PrSMs) identifizierten Reste = 48 % (dargestellt durch den hellgrünen Balken über dem (M) im x Achse).

Die Überrepräsentationsanalyse von Proteinen, die zu den sechs häufigsten Modifikationen gehören, ermöglichte die Identifizierung von Begriffen im Zusammenhang mit ribosomalen Proteinen, die bei Proteinen mit Δm von –18 Da, 15 Da, 16 Da und N-terminal acetylierten Proteinen vorherrschen (Abb. 3). Es wird beschrieben, dass prokaryotische ribosomale Proteine häufig methyliert und acetyliert sind26. Andererseits waren Δm von 28 Da und 266 Da für Begriffe im Zusammenhang mit Membranproteinen überrepräsentiert. Darüber hinaus zeigten Proteine, die mit einer Massenverschiebung von 28 Da identifiziert wurden, eine Überrepräsentation für das Sekretionssystem und den Proteinexport (Abb. 3).

Überrepräsentationsanalyse von Proteinen anhand identifizierter Modifikationen und Massenverschiebungen. Die Proteinzugangscodes jeder Modifikation oder Massenverschiebung wurden separat einer Überrepräsentationsanalyse auf DAVID gegen alle kodierten Proteine des C. glutamicum-Genoms unterzogen. Der resultierende FDR, der den Anreicherungswert darstellt, und der Prozentsatz, der das Verhältnis der identifizierten Proteine zu allen im zugehörigen Gensatz vorhandenen Proteinen darstellt, wurden mithilfe der ggplot2-Blasendiagrammdarstellung aufgezeichnet.

Wir identifizierten 13 Proteine, die mehr als 15 Proteoformen aufwiesen, und die meisten davon waren ribosomal (ergänzende Abbildung S3). Darüber hinaus ergab die Annotation der Zellkomponenten bei der Betrachtung von Proteinen mit mehr als 9 Proteoformen auch Membranproteine (ergänzende Abbildung S3). Trotz der großen Anzahl an Proteoformen ist es erwähnenswert, dass einige von ihnen durch SDS-Addukte verstärkt werden können. Beispielsweise wurden Proteoformen des 50S-ribosomalen Proteins L7/L12 (Q8NT28) mit Δm von 266 Da, 532 Da und 401 Da identifiziert, was wahrscheinlich auf die Addition eines SDS-Addukts, zweier SDS-Addukte und zweier SDS-Addukte plus den Verlust von Initiator-Methioninrest. Das Vorhandensein von SDS-Addukten in Proteinen ist nicht wünschenswert. Die Identifizierung dieser Proteine ist jedoch wichtig, um Fehlidentifizierungen zu vermeiden und Proteine zuzuordnen, die nur durch Adduktformen identifizierbar waren25.

Um genauere Daten zu den biotechnologischen und metabolischen Prozessen von C. glutamicum bereitzustellen, wurden einige PrSMs, die mit diesen Funktionen in Zusammenhang stehen oder möglicherweise daran beteiligt sind, manuell durch Inspektion der MS1- und MS2-Spektren charakterisiert (Tabelle 1).

Das Sekretionssystemprotein (SecG) (Abb. 4A) und der mechanosensitive Kanal mit großer Leitfähigkeit (MscL) (ergänzende Abb. S4) wurden mit Massenverschiebungen von 28 Da identifiziert. Die PrSMs-Fragmente dieser Proteoformen präsentierten Ionen, die die Identifizierung einer Massenverschiebung von 28 Da immer in der Nähe des N-Terminus unterstützen, und die Massenfehler von Fragmenten, die dieses Δm enthielten, waren äußerst gering. Ein Beispiel für die MS1- und MS2-Inspektion wird mit SecG (Q8Z469) demonstriert (Abb. 4A). In dieser Abbildung ist die große Anzahl von b-Ionen dargestellt, die die Massenverschiebung von 27,9883 unterstützen (b4, b5, b6, b7, b8, b9, b10, b11 und b12), dargestellt durch die blauen Linien in der Proteinsequenz, und das ist möglich Es ist ersichtlich, dass die Massenverschiebung aufgrund der in dieser Region enthaltenen mehreren b-Ionen auf einen sehr engen Bereich von drei Aminosäureresten beschränkt ist.

PrSMs des Proteinexportmembranproteins SecG (Q9Z469) und der mutmaßlichen Metalloendopeptidase mepB (Q8NS24). Im oberen Bereich beider Bilder (A und B) ist die Sequenz des identifizierten Proteins zu sehen, wobei mögliche Stellen des Δm durch im blauen Hintergrund hervorgehobene Reste und übereinstimmende Fragmente durch blaue Linien zwischen Aminosäureresten dargestellt werden. Im unteren Bereich sind das MS1- und Isolationsfenster des identifizierten Vorläufers dargestellt (rechte Seite jeder Abbildung) sowie die Massendarstellung des MS2-Spektrums, verbunden mit dem Massenfehler der übereinstimmenden Fragmente. (A) Untersuchung der in SecG identifizierten Massenverschiebung von 28 Da, wobei wir sehen konnten, dass 12 Fragmente (alle B-Ionen) die Identifizierung der Massenverschiebung von 27,9883 in der Nähe des N-Terminals unterstützen. Der Massenfehler eines großen Teils dieser Fragmente lag nahe bei 0 ppm, wie unten im Bild dargestellt. (B) Inspektion der mepB-gespaltenen Proteoform (Spaltungsstelle dargestellt durch die rote Klammer), die eine große Anzahl von Fragmenten zeigt, die die gespaltene Proteoform (alle B-Ionen) mit einem Massenfehler nahe 0 ppm unterstützen.

Die Massenverschiebung um 28 Da in der Nähe des Protein-N-Terminus dieser Proteine lässt auf das Vorhandensein einer N-terminalen Formylierung (Unimod: 122, Δm = 27,994915 Da) in den identifizierten Proteoformen schließen. Jüngste Erkenntnisse deuten darauf hin, dass die N-terminale Formylierung von Methionin ein Signal für den Proteinabbau ist. Dieser Mechanismus wurde als Qualitätskontrolle der Proteintranslation in Bakterien angenommen27. Sowohl die oben erwähnten SecG- als auch MscL-formylierten PrSMs wurden mit der Anwesenheit von N-terminalem Methionin identifiziert. Dies deutet auf einen möglichen Mechanismus des Abbaus von Membranproteinen hin, darunter einige mit vielversprechenden biotechnologischen Anwendungen. Beispielsweise ist das SecG-Protein Teil des Sec-Protein-Exportwegs. Es besteht ein wachsendes Interesse an der Fähigkeit von C. glutamicum, heterologe Proteine von biotechnologischem Interesse zu exprimieren und abzusondern4,28. Darüber hinaus sind MscL und MscS mechanosensitive Kanäle, die dafür bekannt sind, auf osmotischen Stress zu reagieren. Ein weiterer mechanosensitiver Kanal von C. glutamicum (MscCG; P42531) spielt eine wichtige Rolle beim L-Glutamat-Ausfluss29.

Die Top-Down-Proteomik ist bei der Identifizierung gespaltener Proteoformen effizient. Beispielsweise wurde mepB, ein mit der Metalloendopeptidase (Q8NS24) verwandtes Membranprotein, anhand eines Teils seiner Sequenz mit einer Vorläufermasse von 14,464 kDa identifiziert. Diese Masse entspricht dem Verlust von 97 Aminosäureresten aus seiner N-terminalen Region (Abb. 4B). Im Gegensatz dazu sollte sich eine mepB-Spaltungsstelle zwischen Ala43 und Ala44 befinden, nach einem mutmaßlichen Signalpeptid oder einer Transmembranhelix30. Darüber hinaus verfügt mepB laut pfam (https://pfam.xfam.org/) über eine Domäne, die zur M23-Metallopeptidase-Familie (MEROPS) gehört [130–226]. Ein gut charakterisiertes Mitglied von MEROPS ist das LytM-Protein aus Staphylococcus aureus, eine Metallopeptidase, die an der Autolyse beteiligt ist31. Es wurde gezeigt, dass die Spaltung der N-terminalen Kette zu einer Aktivierung der Peptidaseaktivität führt32. Darüber hinaus weisen MEROPS-Proteine eine Spezifität für Peptidoglycan-Polyglycin-Regionen auf, von denen einige eine Aktivität im Zellwandstoffwechsel vermuten lassen33. Übereinstimmend wurde das C. glutamicum mepB-Gen als Teil des MtrAB-Regulons beschrieben, einem Zweikomponentensystem, das an der Osmoregulation und der Kontrolle des Zellwandstoffwechsels beteiligt ist34. Obwohl nicht klar ist, ob mepB sezerniert oder membrangebunden wird, wurde vermutet, dass seine Aktivität extrazitoplasmatisch erfolgt30. In Anbetracht dessen spielt C. glutamicum mepB möglicherweise eine wichtige Rolle im Zellwandstoffwechsel und/oder in der Integrität der heterologen Proteinsekretion, und seine Aktivität wird wahrscheinlich durch die Abspaltung seines N-Terminus reguliert.

C. glutamicum wird häufig in der industriellen Produktion von Aminosäuren verwendet, insbesondere von L-Glutamat, das in Millionen Tonnen pro Jahr produziert wird35. Der Tricarbonsäurezyklus (TCA) ist ein wichtiger Schritt bei der L-Glutamatproduktion durch C. glutamicum. Es ist allgemein bekannt, dass die Aktivität des 2-Oxoglutarat-Dehydrogenase-Komplexes (ODHC) unter Bedingungen abnimmt, die die Produktion von L-Glutamat induzieren36,37. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die ODHC-Aktivität durch den Phosphorylierungsstatus des Oxoglutarat-Dehydrogenase-Inhibitors (OdhI, Q8NQJ3) reguliert wird. Daher ist die phosphorylierte Proteoform von OdhI nicht in der Lage, mit ODHC zu interagieren, während nicht phosphoryliertes OdhI mit ODHC interagiert und die Umwandlung von 2-Oxoglutarat in Succinyl-CoA11 hemmt (Abb. 5A). Darüber hinaus führt die verringerte ODHC-Aktivität zu einer erhöhten Produktion von L-Glutamat aus 2-Oxoglutarat37 (Abb. 5A). Übereinstimmend wird der OdhI-Phosphorylierungsstatus durch Methoden beeinflusst, die die L-Glutamat-Produktion induzieren11.

Darstellung bekannter und mutmaßlicher OdhI-Wechselwirkungen mit ODHC und deren Auswirkungen auf die L-Glutamat-Produktion. (A) Wechselwirkung von OdhI und ODHC, behindert durch OdhI-Phosphorylierung. Das Fehlen der Phosphatgruppe auf OdhI führt zu dessen Wechselwirkung und Hemmung von ODHC (dargestellt durch das rote Symbol) und der Fluss zur L-Glutamatproduktion wird erhöht (dargestellt durch den großen Pfeil von 2-Oxoglutarat zu L-Glutamat)11, 37. (B) Darstellung möglicher Stoffwechseleffekte und Proteininteraktionen, die durch die in dieser Studie beschriebenen OdhI-Proteoformen beeinflusst werden: Δm von 70 Da (dargestellt durch das Sternsymbol) und N-terminale Dipeptidspaltung (dargestellt durch die SD-Buchstaben auf OdhI). Die Wirkung der identifizierten Proteoformen auf die OdhI-Funktion bleibt unklar, potenzielle betroffene Mechanismen werden jedoch durch die Hemmung von ODHC (violettes Kästchen; Steigerung der L-Glutamatproduktion, symbolisiert durch den großen Pfeil) oder die Aktivierung von ODHC (grünes Kästchen; Abnahme von L -Glutamatproduktion, symbolisiert durch die Linie mit einem Punkt). Beide Hypothesen könnten die L-Glutamat-Produktion beeinflussen. OdhI-Oxoglutarat-Dehydrogenase-Inhibitor, ODHC-Oxoglutarat-Dehydrogenase-Komplex.

In dieser Studie wurden sieben Proteoformen von OdhI identifiziert. Einige von ihnen schienen durch die Probenvorbereitung oder den Ionisierungsprozess verursacht worden zu sein, wie z. B. Oxidation (Δm = 16 Da) und Dehydrierung (Δm = −18 Da). Umgekehrt wurden zwei Proteoformen mit potenzieller biologischer Relevanz identifiziert: eine davon mit N-terminaler Spaltung von drei Resten und eine andere mit Δm von 70 Da (ergänzende Abbildung S5). Obwohl diese beiden Proteoformen von TopPic zuverlässig identifiziert wurden, deckte eine geringe Anzahl übereinstimmender Fragmente die modifizierten Regionen ab, was unser Vertrauen in ihre Identifizierung, vor allem in Bezug auf ihre Position in der Sequenz, verringerte. Andererseits deutete eine Bottom-up-Proteomanalyse in einer von unserer Gruppe durchgeführten Vorstudie in Übereinstimmung mit einer der identifizierten Proteoformen auf das Vorhandensein von Δm von 70 Da im N-terminalen Peptid von OdhI hin (Daten nicht gezeigt).

Kürzlich wurde die 70-Da-Massenverschiebung im heterolog exprimierten GM-CSF-Protein im Escherichia coli-System identifiziert. Es wurde angenommen, dass diese Veränderung auf Crotonaldehyd zurückzuführen ist, das bei oxidativem Stress durch Lipidperoxidation entsteht. Der Aldehyd reagiert mit dem N-Terminus des Proteins oder Lysinresten, was zu einem Δm von 70 Da38 führt. Ein weiteres mögliches PTM für diese Massenverschiebung ist die Butyrylierung von Lysin (UnimodAC: 1289, Δm = 70,041865 Da). In der vorliegenden Studie konnte der genaue Ort der Modifikation, die zur 70-Da-Massenverschiebung in OdhI führte, aufgrund der Komplexität der Spektren und der begrenzten Fragmentierung durch MS/MS nicht identifiziert werden. Daher konnten andere Modifikationen wie 5 Methylgruppenadditionen (14 Da) und Acetylierung (42 Da) gefolgt von Formylierung (28 Da) nicht ausgeschlossen werden. Wie bereits erwähnt, entsteht die ODHC-Inaktivierung durch die Wechselwirkung von nicht phosphoryliertem OdhI und der OdhA-Untereinheit von ODHC. Die T14-OdhI-Phosphorylierung hemmt diese Wechselwirkung, was zur ODHC-Aktivierung führt10. OdhI verfügt über eine Fork-Head-assoziierte (FHA) Domäne, die für die Erkennung eines Phosphothreoninrests verantwortlich ist. Darüber hinaus ist diese Domäne die Region, die mit der OdhA-Untereinheit von ODHC interagiert und zu deren Inaktivierung führt. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Phosphorylierung des OdhI-Threoninrests drastische Änderungen in seiner Konformation verursacht, was zu einer automatischen Hemmung seiner Funktion und folglich zur Aktivierung von ODHC39 führt. Kürzlich wurde berichtet, dass die K142-Succinylierung auch die OdhI-ODHC-Wechselwirkung beeinflusst und die Hemmung von ODHC behindert, was Auswirkungen auf die L-Glutamat-Produktion von C. glutamicum hat12,40.

Da darüber hinaus auch eine Acetylierungsstelle an K52 von OdhI beschrieben wurde12,40, untersuchten wir eine solche Modifikation zusätzlich zur N-terminalen Formylierung (27,9949 Da + 42,0106 Da) als mögliche Ursache für die Produktion der 70 Da OdhI-Proteoform. Diese Modifikationen führten jedoch zu einem erheblichen Verlust übereinstimmender Fragmentpeaks (Daten nicht gezeigt). Daher ist es unwahrscheinlich, dass dies die Ursache einer solchen Massenverschiebung war. Darüber hinaus liegt die vorgeschlagene Region für das 70 Da Δm in der Nähe der bekannten T14-Phosphorylierungsstelle von OdhI, was die Frage aufwirft, ob sie dessen Wechselwirkung mit ODHC beeinflussen könnte. Die OdhI-Phosphorylierung an T14 wird hauptsächlich durch C. glutamicum PknG10 katalysiert. In Anbetracht der Erkennungskapazität der OdhI-FHA-Domäne ihres Phosphothreonins und der engen Lage dieser Phosphorylierungsstelle mit der 70 Da Δm-Proteoform kann diese Modifikation die OdhI-Hemmung von ODHC beeinflussen und zu dessen Aktivierung oder Inaktivierung führen (Abb. 5B). Ein möglicher Mechanismus ist die Behinderung der OdhI-Phosphorylierung durch das Vorhandensein des 70-Da-PTM, was die Interaktion mit der FHA-Domäne und folglich die Hemmung von ODHC ermöglicht (Abb. 5B, violetter Kasten). Eine weitere Hypothese ist, dass die 70-Da-Modifikation von OdhI, selbst wenn sie einen T14-phosphorylierten Rest aufweist, die FHA-Domänenerkennung des Phosphothreonins stört, was zur Hemmung von ODHC durch OdhI führt (Abb. 5B, violetter Kasten). Darüber hinaus verhält sich die 70-Da-Massenverschiebung möglicherweise sogar ähnlich wie der phosphorylierte Rest und induziert die Konformationsänderung von OdhI, hemmt es und aktiviert ODHC (Abb. 5B, grüner Kasten). Es ist weniger wahrscheinlich, dass die Verkürzung des N-terminalen Tripeptids ähnliche Effekte hervorruft, ihr Einfluss auf OdhI kann jedoch nicht ausgeschlossen werden (Abb. 5B). Darüber hinaus können diese Veränderungen als Folge der ODHC-Regulierung die L-Glutamat-Produktion in diesen Bakterien beeinflussen (Abb. 5B). Trotz dieser potenziell relevanten Auswirkungen mutmaßlicher OdhI-Proteoformen müssen weitere Studien durchgeführt werden, um die Bedeutung und Gültigkeit dieser Modifikationen in der OdhI-Funktion zu untersuchen.

Ein weiteres Protein mit Relevanz für den Glutamatproduktionsprozess ist das Heavy-Metal-Associated Domain (HMA)-enthaltende Protein (Q8NL68, HMADP). Das entsprechende Transkript wurde bei einer Reihe von Glutamat-Überproduktionsbedingungen als hochreguliert identifiziert, seine Funktion in diesem Prozess bleibt jedoch unklar41. Hier haben wir drei verschiedene Proteoformen dieses Proteins identifiziert. Einer von ihnen präsentierte Δm von –2 Da (ergänzende Abbildung S6), was auf das Vorhandensein einer Disulfidbindung (UnimodAC: 2020, Δm = –2,015650 Da) und einer Aminosäurerestsubstitution (UnimodAC: 1217, Δm = –2,015650 Da) schließen lässt. Val- > Pro oder UnimodAC: 1145, Δm = −1,997892 Da, Met- > Glu) oder Didehydro (UnimodAC: 401, Δm = −2,015650 Da) in der modifizierten Region. Darüber hinaus wurden mehrere PrSMs mit Δm von ca. identifiziert. 30 Tage. Die Untersuchung seiner Spektren ergab die Bestätigung dieser Massenverschiebung, es ist jedoch wahrscheinlicher, dass sie auf zwei PTMs zurückzuführen ist, eines mit 14 Da und das andere mit 16 Da (ergänzende Abbildung S6), was möglicherweise einer Methylierung bzw. Oxidation entspricht. Darüber hinaus konnte in der Nähe dieser identifizierten Proteoform (Δm = 30 Da) eine Isotopenhülle mit der intakten Masse der −2 Da-Modifikation von HMADP nachgewiesen werden (ergänzende Abbildung S6, Vorläufer in Blau).

Die beiden mutmaßlichen Modifikationen von HMADP-Proteoformen liegen in der Proteinsequenz nahe beieinander (ergänzende Abbildung S6). Darüber hinaus konnte keine kanonische Proteoform identifiziert werden. Diese legen nahe, dass das Vorhandensein einer Methylierung die Bildung von Disulfidbindungen beeinflussen kann. Die HMA-Sequenz findet sich in bakteriellen Proteinen, die eine Resistenz gegen toxische Schwermetalle verleihen42. Um die HMADP-Funktion von C. glutamicum zu klären, wurde die Q8NL68-Proteinsequenz mit den UniprotKB-Referenzproteomen plus Swiss-Prot-Datenbank mit Standardparametern in Uniprot verglichen, was zu einer Ähnlichkeit mit Kupfer-Chaperon und Schwermetalltransport-/Entgiftungsproteinen führte (ergänzende Tabelle 3). Es wurde gezeigt, dass die Transkripte für das auf Kupfer reagierende Zweikomponentensystem CopRS in C. glutamicum während der Penicillin-Induktion der Glutaminsäureproduktion hochreguliert werden43. Kürzlich wurde gezeigt, dass Kupfer die Glutaminsäureproduktion durch C. glutamicum induzieren kann, allerdings in geringerer Menge im Vergleich zu typischen Behandlungen wie Penicillin oder Biotin-Limitierung44. Trotzdem bleibt die Rolle von HMADP bei der L-Glutamat-Produktion unklar, es scheint jedoch ein Protein zu sein, das mit Stressreaktionen in Zusammenhang steht, und kann daher durch PTMs, die mit oxidativem Stress in Zusammenhang stehen, reguliert werden oder andere Proteine regulieren.

Weniger häufige Δm-Werte wurden bei einem Peroxiredoxin (Q8NMS6) beobachtet. Eine Proteoform mit einer Massenverschiebung von 154 Da wurde identifiziert und es wurde auch eine N-terminale Acetylierung nachgewiesen (ergänzende Abbildung S7). Durch die Untersuchung des MS/MS-Spektrums konnten wir Fragmente identifizieren, die die 154-Da-Massenverschiebung unterstützen. Allerdings konnte die N-Acetylierung nicht auf einen kürzeren Sequenzbereich eingegrenzt werden, sodass unklar ist, ob es sich tatsächlich um eine Reihe von Methylierungsereignissen handelte eine Acetylierung (ergänzende Abb. S7). Betrachtet man nur ein PTM, kann die Massenverschiebung von 154 Da durch drei Ereignisse verursacht werden: Zugabe von Glycerophosphat (UnimodAC: 419, Δm = 154,003110 Da), Decanoyl (UnimodAC: 449, Δm = 154,135765 Da) oder 4-Oxo-2- Nonenal (ONE) (UnimodAC: 721, Δm = 154,099380 Da). Die ONE-Proteinmodifikation ist ein Lipidperoxidationsprodukt, das durch Wechselwirkungen reaktiver Spezies mit Membranlipiden verursacht wird, was darauf hindeutet, dass dieses Protein in der Nähe der Zellmembran von C. glutamicum lokalisiert sein könnte. Dieses Molekül kann an nukleophile Aminosäurereste angefügt werden45. Bei Betrachtung der vorgeschlagenen Modifikationsregion ist das Vorhandensein von ONE an der vorgeschlagenen Stelle unwahrscheinlich. In der Nähe dieser Stelle befinden sich jedoch drei mögliche Modifikationsstellen, C51, K48 und C46 (ergänzende Abbildung S7). Dieses Peroxiredoxin wurde als Peroxiredoxin Q beschrieben, das eine wichtige Rolle bei der Reaktion auf oxidativen Stress spielt und in der Lage ist, H2O2, t-BOOH, Cumolhydroperoxid und Peroxynitrit zu reduzieren. Interessanterweise handelt es sich bei dem C46, für das die Massenverschiebung um 154 Da vermutet wird, um das katalytische Cystein dieses Peroxiredoxins46. Dies legt nahe, dass diese Modifikation einen wichtigen Einfluss auf seine katalytische Aktivität und folglich auf mehrere oxidative Stressreaktionen von C. glutamicum haben könnte. Darüber hinaus sind Proteine, die an der Regulierung des oxidativen Stresses beteiligt sind, häufig anfällig für oxidative Modifikationen als Prozess zur Regulierung der Redoxaktivität in der Zelle24. Diese Beweise unterstützen die 154-Da-Massenverschiebung als EINE Modifikation im C. glutamicum-Peroxiredoxin. Andere Möglichkeiten können jedoch nicht ausgeschlossen werden. Eine weitere Peroxiredoxin-Proteoform mit einem Δm von 186 Da unterstützt die Identifizierung der 154-Massenverschiebung in diesem Protein und wird wahrscheinlich durch ein zweites PTM in seiner Sequenz von etwa 32 Da verursacht. Übereinstimmend befand sich in der Nähe des zur Identifizierung der 186 Da Δm-Proteoform fragmentierten Vorläufers eine Isotopenhülle, die dem Verlust von etwa 32 Da entsprach (ergänzende Abbildung S7). Dies deutet auf das Vorhandensein eines PTM von 32 Da zusätzlich zur mutmaßlichen ONE-Modifikation hin. Massenunterschiede von 32 Da sind normalerweise auf zwei Oxidationen in verschiedenen Methioninen zurückzuführen, aber die Methionine in dieser Proteinsequenz liegen näher am C-Terminus, wo mehrere Fragmente ohne diese Massenverschiebung identifiziert wurden. Eine weitere Möglichkeit für diese Massenverschiebung wäre eine Dihydroxylierung von Cystein (UnimodAC: 425, Δm = 31,989829 Da). In der Nähe der modifizierten Region befinden sich zwei Cysteine (ergänzende Abbildung S7). Obwohl der pKa von freiem Cystein etwa 8,6 beträgt, wird er durch das Vorhandensein positiv geladener Reste in der Nähe des Cysteins um 3–4 Einheiten verringert, was die Oxidation seiner Thiolgruppe unterstützt47. Übereinstimmend gibt es in der Nähe von C51 Arginin (R54) und Lysin (K47). Darüber hinaus ist C51 der auflösende Rest und soll im katalytischen Prozess dieses Peroxiredoxins sehr wichtig sein46. Zwei Oxidationen von Cysteinen führen zur Bildung von Sulfinsäure, einer irreversiblen Modifikation und einem Signal für den Proteinabbau47. Daher besteht eine gute Chance, dass das Peroxiredoxin-Protein von C. glutamicum oxidative Modifikationen erfährt, die seine Aktivität und Integrität regulieren könnten. Darüber hinaus deutet die vorgeschlagene Modifikation durch eine ONE-Peroxidation auf eine mögliche Rolle dieses Proteins bei der Zellmembranreparatur hin.

Ein weiteres Thioredoxin (Q8NLG6, trxB1), beschrieben als Thiol-Disulfid-Isomerase und Thioredoxine, wurde durch zwei Proteoformen identifiziert, beide mit N-terminaler Spaltung von 26 Aminosäureresten. Interessanterweise wurde eine Proteoform mit einer Massenverschiebung von etwa –2 Da in einer Region in der Nähe von zwei Cysteinen identifiziert (ergänzende Abbildung S8), was auf die Bildung einer Disulfidbindung schließen lässt. Eine weitere Proteoform wurde mit einem Δm von 29,88 Da mit unklarer Möglichkeit von Modifikationen identifiziert (ergänzende Abbildung S8), wie z. B. zwei Oxidationen plus einer Disulfidbindung oder Methylierung gefolgt von Oxidation. Darüber hinaus wurden beide Proteoformen durch qualitativ hochwertige MS/MS-Spektren identifiziert, wobei mehrere Fragmente die beiden modifizierten Formen repräsentierten (ergänzende Abbildung S8). Es wurde gezeigt, dass dieses Thioredoxin auf Disulfidstress reagiert, der durch den SigM-Sigma-Faktor in C. glutamicum reguliert wird48. Es ist bekannt, dass Thioredoxine über ihr CxxC-Motiv als Reparatursystem für oxidierte Cysteinreste fungieren. Seine Cysteinreste werden oxidiert und bilden eine Disulfidbindung, wodurch die reduzierte Form der Cysteinreste im Zielprotein entsteht47. Das Vorhandensein eines −2 Da Δm, das in der Nähe dieses Motivs von trxB1 identifiziert wurde, bestätigt, dass es sich um eine Disulfidbindung handelt. Darüber hinaus weist die Identifizierung oxidierter und reduzierter Proteoformen eines Thioredoxins auf die Möglichkeit vergleichender Studien zur Quantifizierung dieser Proteoformen und zur Abschätzung des Redoxstatus der Zelle hin.

Eine Top-Down-Proteomanalyse des industriellen Arbeitstiers Corynebacterium glutamicum ergab mehrere neue mutmaßliche PTMs dieses Bakteriums, die mit verschiedenen biologischen Prozessen zusammenhängen. Genauer gesagt wurden 1125 Proteoformen aus 273 Proteinen identifiziert. Darüber hinaus scheinen Membranproteine und Proteine, die an der Translation beteiligt sind, stark anfällig für PTMs zu sein. Proteine, die für biotechnologische und metabolische Prozesse relevant sind, wurden durch neue Proteoformen identifiziert, was möglicherweise neue Regulationsstrategien impliziert. Beispielsweise ist das OdhI-Protein an der Aminosäureproduktion beteiligt und wurde durch eine neue Proteoform identifiziert, was auf eine mutmaßliche Butyrylierung oder Crotonaldehydperoxidation schließen lässt, die sich auf die Hemmung von ODHC und damit auf die Glutamatproduktion auswirken könnte. Das Endoproteinase-mepB-Protein wurde auch mit einer neuen Proteoform identifiziert, die 93 Aminosäurereste an ihrem N-Terminus abspaltet, was auf einen unbeschriebenen Mechanismus seiner Aktivierung in C. glutamicum mit möglichen Auswirkungen auf den Zellwandstoffwechsel schließen lässt. Das SecG-Membranprotein, eine Untereinheit des Proteinsekretionssystems, wies eine mutmaßliche N-terminale Formylierung auf, was auf eine Abbausignalisierung mit möglichen Konsequenzen für die Proteinsekretion schließen lässt. Ein weiteres Membranprotein mit einer mutmaßlichen N-terminalen Formylierung, MscL, wurde identifiziert, das den Metabolitenausfluss beeinflussen könnte. Es wurde ein Peroxiredoxin mit einer mutmaßlichen ONE-Modifikation in der Nähe seines katalytischen Cysteinrests identifiziert, was auf eine Rolle bei Reaktionen auf oxidativen Stress schließen lässt. Ein weiteres Stressreaktionsprotein wurde mit N-terminaler Spaltung identifiziert, das die Disulfid-Stressreaktion beeinflussen könnte. Das HMADP-Protein, das an den Glutamatproduktionsbedingungen und dem Metalltransport/-entgiftung beteiligt ist, wurde durch zwei Proteoformen identifiziert, eine mit einer mutmaßlichen Disulfidbindung und eine mit mutmaßlicher Methylierung und Oxidation, was auf mögliche Auswirkungen auf die Glutamatproduktion und/oder Metallentgiftung hindeutet. Der Einfluss dieser Proteoformen auf biologische Prozesse von C. glutamicum sollte validiert und weiter untersucht werden. Beispielsweise wurde in einer kürzlich durchgeführten Studie die Gentechnik von C. glutamicum OdhI eingesetzt, bei der mimische Aminosäurereste eingeführt wurden, um den Einfluss der Acetylierung und Succinylierung von OdhI auf seine Wechselwirkung mit ODHC40 zu untersuchen. Eine weitere Möglichkeit wäre eine vergleichende Analyse, die quantitative Top-Down-Proteomik mit Metabolomik koppelt und Unterschiede in der Proteoformhäufigkeit beobachtet, die mit Veränderungen der Metabolitenhäufigkeit korrelieren.

C. glutamicum ATCC 13032 wurde in tryptischem Soja-Agar (17 g/L Pankreas-verdautes Kasein, 3 g/L Papain-Verdau von Sojabohnen, 5 g/L NaCl, 2,5 g/L K2HPO4, 2,5 g/L Glucose-Monohydrat, 1,5 g/L) gezüchtet g/L Agar) und die Vorkultur wurde über Nacht in tryptischer Sojabrühe unter Rühren mit 170 U/min bei 30 °C durchgeführt. Anschließend wurde die Vorkultur zum Beimpfen von drei Flaschen mit CGXII-Medium [20 g/L (NH4)2SO4, 5 g/L Harnstoff, 40 g/L Glucose, 1 g/L KH2PO4, 1 g/L L K2HPO4, 0,25 g/L MgSO4.7H2O, 42 g/L MOPS, 10 mg/L CaCl2, 10 mg/L FeSO4.7H2O, 10 mg/L MnSO4.7H2O, 1 mg/L ZnSO4.7H2O, 0,2 mg/L CuSO4, 0,02 mg/L NiCl2.6H2O, 0,2 mg/L Biotin, 0,03 mg/L Protocatechinsäure]49 [optische Anfangsdichte (OD) = 1,0]. Die Proben wurden 36 Stunden lang unter Rühren mit 170 U/min bei 30 °C gezüchtet. Die Wachstumsmessungen wurden mit OD600 unter Verwendung eines Spektrophotometers CLARIOstar (BMG LABTECH, Deutschland) bewertet.

C. glutamicum-Kulturen wurden geerntet und 10 Minuten lang bei 21 °C und 12.000 × g zentrifugiert. Die Pellets wurden mit CGXII-Medium ohne Glucose gewaschen, indem die Pellets resuspendiert und 10 Minuten lang bei 21 °C und 12.000 × g zentrifugiert wurden. Anschließend wurden die Zellen in Lysepuffer (100 mM Tris-HCl, 2 mM DTT, SDS 4 %, cOmplete™ EDTA-freier Protease-Inhibitor-Cocktail von Roche, Basel, Schweiz) resuspendiert, gefolgt von einem physikalischen Aufschluss durch Mazeration in flüssigem Stickstoff. Nach der Mazeration wurde die Lösung 15 Minuten lang bei 21 °C und 20.000 × g zentrifugiert, um unlösliche Partikel abzutrennen, und der Überstand mit löslichen intrazellulären Proteinen wurde bis zur weiteren Verwendung bei –80 °C gelagert. Anschließend wurden die Proteine mit Qubit™ (Invitrogen) quantifiziert. Eine gepoolte Probe wurde unter Verwendung gleicher Proteinmengen jedes Replikats hergestellt und 500 µg der gepoolten Probe wurden durch Gel-eluierte Flüssigfraktionseinschlusselektrophorese – GELFrEE50, unter Verwendung einer selbstgemachten Kartusche mit 12 % Trenngel und 4 % Stapelgel fraktioniert. Zuerst wurde die Probe 2x in Probenpuffer verdünnt (Tris-HCl 0,125 M, SDS 4 %, Glycerin 20 %, DTT 0,1 M, Bromphenolblau 0,01 %), dann wurde sie einer Elektrophorese unter Verwendung eines Laufpuffers (Tris-HCl) unterzogen 0,025 M, Glycin 0,192 M, SDS 0,1 %) und ein konstanter Strom von 10 mA. Die Fraktionen wurden entsprechend der Zeit (in Minuten) nach der Elution mit Bromphenolblau (0 Min.) gesammelt. Nachfolgende Sammlungen waren wie folgt: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 75, 90 und 120 Minuten. Der Molekularmassenbereich der Proteine aus jeder Fraktion wurde durch SDS-PAGE51 bewertet. GELFrEE-Fraktionen wurden dann zur SDS-Entfernung einer Methanol/Chloroform/Wasser-Fällung unterzogen52. Kurz gesagt, den Fraktionen wurden vier Volumina Methanol zugesetzt, gefolgt von der Zugabe von 1 Volumen Chloroform und 3 Volumina Wasser, wobei nach dem Einschluss jeder Lösung 30 Sekunden lang gevortext wurde. Nach Zugabe von Wasser und Vortexen wurden die Lösungen 10 Minuten lang bei 21 °C und 20.000 × g zentrifugiert, was zur Bildung von zwei Schichten führte, zwischen denen Proteine schwammen. Dann wurde die obere Schicht entfernt, wobei darauf zu achten war, dass das Proteinpellet nicht gestört wurde, und 3 Volumina Methanol wurden zugegeben, gefolgt von vorsichtigem Mischen und Zentrifugieren bei 20.000 × g für 10 Minuten bei 21 °C. Anschließend wurde der Überstand verworfen, gefolgt von einer zweiten Wäsche mit 3 Volumina Methanol wie zuvor beschrieben, und das resultierende Pellet wurde in einer Laminar-Flow-Biohaube getrocknet. Nach dem Trocknen wurden die Pellets in 5 % Acetonitril und 0,1 % Ameisensäure resuspendiert und vor der LC-MS/MS bei –80 °C gelagert.

Drei technische Replikate der GELFrEE-Fraktionen 0, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9 und 11 wurden einer Top-Down-Analyse auf einem Nano-UHPLC-Dionex Ultimate 3000-System unterzogen, das an ein Orbitrap Elite™-Massenspektrometer gekoppelt war (Thermo Scientific, Bremen, Deutschland) (LC–MS/MS). Für die Umkehrphasentrennung wurden analytische (30 cm, 75 µM ID) und Trap-Säulen (4 cm, 100 µM ID) gepackt mit PLRPS 1000 A, 5 µM (Agilent, Kalifornien, USA) verwendet. In der analytischen Säule wurde mit einem P-2000-Instrument (Sutter, Kalifornien, USA) eine Spitze von etwa 1 cm gezogen, die als Emitter im Massenspektrometer verwendet werden sollte. Beide Säulen wurden bei Raumtemperatur gehalten und auf etwa 22 °C kontrolliert. Die Proben wurden mit einer Flussrate von 3 µL/min für 10 Minuten unter der isokratischen Bedingung von 5 % Acetonitril und 0,1 % Ameisensäure geladen, dann wurde ein Gradient unter einem Fluss von 0,230 µL/min verwendet, um Proteoformen aus der Säule für die MS-Analyse zu eluieren . Der Gradient bestand aus den Lösungen A (Ameisensäure 0,1 %) und B (Acetonitril, Ameisensäure 0,1 %) und wurde erzeugt durch: 5 % B (0–10 Min.), 20 % B (10–55 Min.), 55 % B (55–60 Min.), 85 % B (60–80 Min.) und 5 % B (80–90 Min.). Die Erfassungen erfolgten während des 90-minütigen Gradienten im positiven Modus, und die beiden am häufigsten vorkommenden Ionen wurden durch schrittweise hochenergetische Kollisionsdissoziation (HCD) fragmentiert, wobei eine normalisierte Kollisionsenergie von 25 in zwei Schritten mit einer Kollisionsenergiebreite von 10 angewendet wurde. Dies führt zu zwei getrennten Fragmentierungen von Ionen mit normalisierten Kollisionsenergien von 20 und 30 und der gemeinsamen Analyse aller resultierenden Fragmente im Orbitrap. Die Isolationsbreite der Vorläufer betrug 25 m/z bei einer dynamischen Ausschlussdauer von 30 s. Die quelleninduzierte Dissoziation (SID) wurde in MS1 und im ersten MS2 mit 15 eV verwendet, während sie für das zweitintensivste Ion auf 35 eV eingestellt wurde. Die Auflösungen betrugen 240.000 bzw. 120.000 für MS1 und MS2. Die Massenspektrometrie-Proteomikdaten wurden über das PRIDE53-Partner-Repository mit der Datensatzkennung PXD038038 beim ProteomeXchange-Konsortium hinterlegt.

Thermo-Rohdateien wurden mit dem MSConvert-Tool54 in das MzML-Format konvertiert. Die Identifizierung und Charakterisierung von Proteoformen erfolgte mit dem Softwaretool TopPic Suite, Version 1.455. Kurz gesagt, die Spektren wurden unter Verwendung von TopFD mit Standardparametern entfaltet, gefolgt von Identifizierungen gegen ein C. glutamicum ATCC 13032-Referenzproteom (11-2020), erhalten von UniProt (https://www.uniprot.org/). Bei der Identifizierung waren zwei Massenverschiebungen zwischen −500 Da und 500 Da erlaubt und die N-terminalen Formen wurden als „NONE“ (Keine Modifikationen), „NME“ (N-terminale Methionin-Exzision), „NME-ACETYLATION“ (N) festgelegt -terminale Methionin-Exzision und N-terminale Acetylierung) und „M-ACETYLATION“ (N-terminale Acetylierung). Mit einer Täuschungsdatenbank wurde eine falsche Entdeckungsratenstrategie angewendet, die dazu führte, dass nur Proteoformen mit einem FDR unter 1 % auf der Ebene der Proteoform-Spektrum-Übereinstimmungen (PrSMs) identifiziert wurden. Auf die Charakterisierung und Annotation der Proteoformen folgte die visuelle Interpretation der TopMSV21-Dateien. Die MW-Bewertung und Retentionszeiten der erkannten Proteine wurden mit VisioProt-MS56 durchgeführt.

Die Identifizierungsdaten von Proteoformen wurden in R 4.0.2 (R Core Team 2020) mit den Paketen Tidyverse57 und ggplot258 analysiert. Kurz gesagt wurde die Anzahl der identifizierten Massenverschiebungen (Δm) gezählt und die Häufigkeit der häufigsten Δm basierend auf gerundeten Werten definiert. Anschließend wurde die Anzahl der durch jedes Δm modifizierten Aminosäurereste definiert. Funktionelle Annotationen und Überrepräsentationsanalysen wurden mit der String Cytoscape-App59,60 und DAVID61 durchgeführt. Die visuelle Interpretation der überrepräsentierten DAVID-Begriffe wurde auch mithilfe der Computersprache R durch die Erstellung eines Blasendiagramms mit den in ggplot2 vorhandenen Werkzeugen durchgeführt.

Massenspektren-Rohdateien sind über das Proteomics IDEntifications Database Archive (PRIDE, https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/, ID: PXD038038) verfügbar.

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Diese Arbeit wurde von Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES), Financier of Studies and Projects (FINEP) und Federal District Research Support Foundation (FAP-DF, Process N.: 00193.00001484/2021-91 und 0193001195/2016) unterstützt. .

Labor für Proteinchemie und Biochemie, Abteilung für Zellbiologie, Institut für Biologie, Universität Brasilia, Brasilia, Brasilien

Reynaldo Magalhães Melo, Jaques Miranda Ferreira de Souza, Wagner Fontes, Marcelo Valle de Sousa, Carlos André Ornelas Ricart und Luis Henrique Ferreira do Vale

Labor für Pflanzenbiochemie, Abteilung für Botanik, Institut für Biologie, Universität Brasilia, Brasilia, Brasilien

Thomas Christopher Rhys Williams

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RMM führte das Bakterienwachstum durch und bereitete die Probe für die Massenspektrometrie vor. RMM und TCRW analysierten die Daten. JMFS, WF, MVS und LHFV führten die Wartung des Massenspektrometers und die Injektion von Proben durch. CAOR, RMM, TCRW und LHVF konzipierten die Experimente. Alle Autoren haben das Manuskript überarbeitet.

Korrespondenz mit Luis Henrique Ferreira do Vale.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Melo, RM, de Souza, JMF, Williams, TCR et al. Aufdeckung von Corynebacterium glutamicum-Proteoformen durch Top-Down-Proteomik. Sci Rep 13, 2602 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29857-6

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Eingegangen: 07. Dezember 2022

Angenommen: 11. Februar 2023

Veröffentlicht: 14. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29857-6

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