Reversible Regulierung der Cas12a-Aktivitäten durch AcrVA5

Cell Discovery Band 8, Artikelnummer: 45 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Sehr geehrter Herausgeber,

Das geclusterte, regelmäßig beabstandete Short Palindromic Repeat (CRISPR)/CRISPR-assoziierte (Cas) System schützt Bakterien und Archaeen vor mobilen genetischen Elementen (MGEs) wie Bakteriophagen1. Der Cas-Effektor kann von einer CRISPR-RNA (crRNA) gesteuert werden, um durch Basenpaarung auf die eindringenden Nukleinsäuren abzuzielen, und spaltet dann das Ziel, um dem Wirt Immunität zu verleihen2,3. Um mit dem durch das CRISPR-System des Wirts ausgeübten Immunitätsdruck fertig zu werden, haben Phagen verschiedene Arten von Anti-CRISPR-Systemen (Acr) entwickelt, um die Cas-Nukleasen zu inaktivieren und wiederum das Immunitätssystem des Wirts zu schließen4. Die Acr-Proteine können direkt mit den Cas-Proteinen interagieren, um die crRNA-Beladung oder Zielbindung zu verhindern; Alternativ besitzen sie enzymatische Aktivitäten, um die crRNAs zu spalten oder die Cas-Proteine posttranslational zu modifizieren4. Darunter befindet sich eine kürzlich beschriebene Acetyltransferase der GNAT-Familie, nämlich AcrVA5, die von den MGEs kodiert wird und spezifisch den Typ-VA-Cas12a-Effektor durch Acetylmodifikation einer wichtigen Lysinstelle hemmt. Das AcrVA5-inaktivierte Cas12a verliert die Fähigkeit, mit der PAM-Stelle (Protospacer Adjacent Motif) zu interagieren, und kann die Wirte nicht durch Spaltung der eindringenden MGEs5,6 schützen. Durch die Inaktivierung des Cas12a-Systems können MGEs, die das acrVA5-Gen enthalten, das bakterielle Immunsystem effektiv lahmlegen und haben das Potenzial, sich weit unter den Cas12a-tragenden Wirten auszubreiten. Zu unserer großen Überraschung existiert das acrVA5-Gen jedoch nur in drei Moraxella bovoculi-Stämmen, die ihre Deacetylasen verloren haben (Ergänzungstabelle S1). Daher besteht begründeter Verdacht, dass zwischen der Acetyltransferase AcrVA5 und den weit verbreiteten bakteriellen Deacetylasen7 eine Konkurrenzbeziehung besteht, die Cas12a durch Deacetylierung reaktivieren kann, um die Wirte vor der Invasion von MGEs zu schützen, die die acrVA5-Kassette beherbergen.

Wir führten zunächst das AcrVA5-vermittelte In-vitro-Acetylierungsexperiment durch und zeigten, dass das AcrVA5-acetylierte Lachnospiraceae-Bakterium (Lb) Cas12a sowohl cis- als auch trans-Spaltungsaktivitäten gegenüber doppelsträngiger Ziel-DNA (dsDNA) verlor (ergänzende Abb. S1a, b). , was mit den vorherigen Ergebnissen übereinstimmt5,6, die AcrVA5-Behandlung zeigte jedoch keine Auswirkung auf die LbCas12a-Transspaltungsaktivitäten, wenn sie durch einzelsträngige Ziel-DNA (ssDNA) ausgelöst wurde (ergänzende Abbildung S1c). Da die PAM-Stelle nur für Cas12a erforderlich ist, um Ziel-dsDNA, nicht jedoch ssDNA8, zu erkennen, bestätigten die obigen Ergebnisse außerdem, dass die AcrVA5-vermittelte Acetylierung Cas12a daran hinderte, mit den PAM-Sequenzen in Ziel-dsDNA5 zu interagieren.

Neben LbCas12a analysierten wir auch Cas12a-Orthologe von Francisella tularensis subsp. novicida (FnCas12a) und Acidaminococcus sp. (AsCas12a) und zeigte, dass AcrVA5 beide Orthologen inaktivieren konnte (Ergänzende Abbildungen S2 und S3). Bemerkenswerterweise hat sich AcrVA5 in einer früheren Studie jemals als unwirksam gegen AsCas12a erwiesen6. Wir fanden jedoch heraus, dass AsCas12a den konservierten Lysinrest enthielt (ergänzende Abbildung S3c) und zeigten, dass die AcrVA5-vermittelte Behandlung zum Verlust sowohl von cis- als auch von AsCas12a führte Transspaltungsaktivitäten von AsCas12a mit Ziel-dsDNA.

Die posttranslationale Lysinacetylierung spielt eine wichtige Rolle in verschiedenen zellulären Prozessen in Organismen von Bakterien bis hin zum Menschen9. In Bakterien deacetyliert das NAD+-abhängige Sirtuin-Typ-CobB eine große Anzahl von Proteinen und reguliert den globalen Acetylierungsgrad7. Um zu testen, ob CobB das mit AcrVA5 behandelte Cas12a deacetylieren und seine cis- und trans-Spaltungsaktivitäten reaktivieren kann, haben wir anschließend rekombinantes E. coli CobB und LbCas12a gereinigt und den In-vitro-Deacetylierungstest durchgeführt. Basierend auf den Western-Blot-Ergebnissen wurde Cas12a durch AcrVA5 in Gegenwart von Acetyl-CoA erfolgreich acetyliert und die Acetylmodifikation konnte nach der Behandlung mit CobB effizient entfernt werden. In Übereinstimmung mit früheren Erkenntnissen7 erfordert die CobB-vermittelte Deacetylierung zwingend NAD+ als Cofaktor (ergänzende Abbildung S4). Dementsprechend verlor das AcrVA5-acetylierte LbCas12a sowohl cis- als auch trans-Spaltungsaktivitäten mit der Ziel-dsDNA, erholte sich jedoch beide Aktivitäten weitgehend, nachdem es durch CobB deacetyliert wurde (Abb. 1a, b). Darüber hinaus haben wir mehrere Cas12a-Orthologe wie FnCas12a und AsCas12a getestet und festgestellt, dass CobB beide Cas12a-Orthologen deacetylieren und reaktivieren konnte (Ergänzende Abbildungen S5 – S8). Es ist erwähnenswert, dass die erfolgreiche Reaktivierung von acetyliertem AsCas12a durch CobB-Behandlung AsCas12a erneut als Ziel von AcrVA5 bewies (ergänzende Abbildung S3), während der Grund für die unterschiedlichen Ergebnisse zwischen dieser Arbeit und der vorherigen Studie6 noch unbekannt war und könnte eine interessante Frage sein, die weiterer Untersuchung bedarf. Basierend auf den obigen Ergebnissen kann man schlussfolgern, dass AcrVA5 und CobB sowohl die cis- als auch die trans-Spaltungsaktivitäten von Cas12a reversibel regulieren, indem sie seinen Acetylstatus in vitro modulieren.

a Das LbCas12a-cis-Spaltungsexperiment mit Ziel-dsDNA. Wie unten dargestellt, spaltete aktives Cas12a die Ziel-dsDNA unter Anleitung von crRNA erfolgreich in zwei Stücke, acetyliertes Cas12a wurde jedoch inaktiviert und verlor die cis-Spaltungsaktivitäten gegenüber der Ziel-dsDNA. M, 1-kb-DNA-Leiter (Thermo Fisher Scientific); S, dsDNA-Substrat; P, Cas12a cis-gespaltene Produkte. b Das LbCas12a-Transspaltungsexperiment mit Ziel-dsDNA. Wie unten dargestellt, wurden die Trans-Spaltungsaktivitäten aktiver Cas12a-Proteine durch die Ziel-dsDNA, die Trans-Spaltung des Fluoreszenzlöscher-Reporters (FQ-Reporter) und die Beleuchtung von Fluoreszenzsignalen ausgelöst. Sobald Cas12a jedoch acetyliert war, wurde es inaktiviert und verlor die Transspaltungsaktivitäten in Gegenwart der Ziel-dsDNA. Das Fluoreszenzsignal wurde mit einem Echtzeit-qPCR-Gerät erfasst und die Werte wurden abzüglich des Hintergrundsignals angezeigt. NC, die negative Kontrollreaktion ohne hinzugefügtes Ziel; LbCas12a, Reaktion mit unbehandeltem LbCas12a; LbCas12a-AcCoA, Reaktion unter Verwendung von LbCas12a, das nur mit Acetyl-CoA behandelt wurde; LbCas12a-AcCoA-AcrVA5, Reaktion unter Verwendung von LbCas12a, behandelt mit AcrVA5 in Gegenwart von Acetyl-CoA; acLbCas12a, AcrVA5-acetyliertes LbCas12a; acLbCas12a-NAD+, acetyliertes LbCas12a, nur mit NAD+ behandelt; acLbCas12a-NAD+-CobB, acetyliertes LbCas12a, behandelt mit CobB in Gegenwart von NAD+. c Analyse der physiologischen Rolle von CobB beim Schutz des Wirts vor dem Eindringen fremder Apr-Reporterplasmide. W3110/cas12a, der Wildtyp, der den LbCas12a/crRNA-Komplex exprimiert; ΔcobB, der cobB-Nullmutant, der den LbCas12a/crRNA-Komplex exprimiert; W3110/cobB+cas12a, der Wildtyp, der sowohl den LbCas12a/crRNA-Komplex als auch CobB exprimiert. apr-WT, Reporterplasmid mit dem Wildtyp-apr-Gen; apr-Mut, Reporterplasmid mit dem mutierten apr-Gen, das der Spaltung durch Cas12a entkommen kann. d Ein Regulierungsmodell der AcrVA5- und CobB-vermittelten reversiblen Regulierung von Cas12a-Aktivitäten. Die Acetyltransferase AcrVA5 verwendet Acetyl-CoA, um Cas12a zu acetylieren, wodurch Cas12a sowie das Resistenzsystem des Wirts gegen MGEs inaktiviert werden. Der Wirt verfügt jedoch über das NAD+-abhängige CobB, das Cas12a deacetyliert und reaktiviert und dem Wirt einen sekundären Schutz gegen die eindringenden Nukleinsäuren bietet Säuren.

Wir untersuchten außerdem die physiologische Rolle von CobB beim Schutz des Cas12a-haltigen Wirts vor der Invasion von MGEs, die das acrVA5-Gen beherbergen. Wir konstruierten zunächst ein CRISPR-Plasmid, das sowohl LbCas12a als auch eine crRNA exprimierte, die auf eine spezifische Sequenz im Apramycin-Resistenzgen (apr) abzielte, und transformierten es in E. coli-Stämme mit oder ohne einem hohen Grad an CobB-Expression (ergänzende Abbildung S9). Aufgrund des geringen Expressionsniveaus des nativen cobB-Gens in E. coli10 (ergänzende Abbildung S10) wurden der Wildtyp W3110 sowie die cobB-deletierten Stämme als cobB-negativer Wirt angesehen, während der cobB-überexprimierende Stamm der war cobB-positiver Wirt. Um ein Reporterplasmid ohne die Targeting-Sequenz des Cas12a/crRNA-Komplexes herzustellen, mutierten wir die Cas12a-Targeting-DNA-Sequenz im apr-Gen, ohne die Aminosäuresequenz und die Apramycin-Resistenz zu verändern (ergänzende Abbildung S11), wodurch ein mutiertes Plasmid erhalten wurde Apr-Gen. Da die Nonsense-Mutation sowohl die PAM-Stelle als auch die Leitsequenz veränderte, gelang es Cas12a nicht, die Zielsequenz in vitro zu spalten (ergänzende Abbildung S11b). Infolgedessen entkam das Reporterplasmid mit der Mutante apr effektiv dem Abwehrsystem des Wirts und zeigte auf acrVA5-unabhängige Weise hohe Transformationseffizienzen (Abb. 1c), was daher als Kontrolle des Transformationsassays verwendet wurde.

Das Reporterplasmid, das das Wildtyp-apr-Gen enthielt, wurde dann in E. coli-Stämme transformiert, die Cas12a exprimierten, um die Invasion von MGEs nachzuahmen. Wie erwartet konnten in Abwesenheit des acrVA5-Gens in allen getesteten Stämmen unabhängig von der Expression keine Transformanten erhalten werden Der CobB-Spiegel, der die Invasion des fremden Plasmids darstellt, konnte von den Wirten vollständig blockiert werden (Abb. 1c). Wenn das Reporterplasmid jedoch sowohl apr als auch acrVA5 enthielt und damit MGEs nachahmte, die die acrVA5-Kassette enthielten, wurde die hohe Transformationseffizienz des Reporterplasmids in den cobB-negativen Wirten erzielt, was mit den obigen Erkenntnissen übereinstimmte, dass AcrVA5 Cas12a wirksam inaktivierte. Da die Überexpression von CobB im cobB-positiven Wirt das AcrVA5-acetylierte Cas12a deacetylieren und reaktivieren konnte, wurde die Transformation des Reporterplasmids weitgehend blockiert. Wie erwartet war die Effizienz des Reporterplasmids immer noch viel geringer als die der Kontrolle, obwohl eine Überexpression von CobB und AcrVA5 die Effizienz der E. coli-Transformation erheblich verringern kann (Abb. 1c). Basierend auf den obigen Ergebnissen kann man schlussfolgern, dass AcrVA5 und CobB die Cas12a-Aktivitäten in vivo durch Acetylierung bzw. Deacetylierung reversibel regulierten.

Da die AcrVA5-vermittelte Acetylmodifikation von Cas12a von MGEs5,6 als wirksame Anti-Cas12a-Strategie angesehen wurde, kann die CobB-vermittelte Deacetylierungsreaktivierung von Cas12a durch Modifikation sowohl als Präventionsstrategie für die Anti-CRISPR-Elemente als auch als a angesehen werden Schutz für das CRISPR-Abwehrsystem, der Wirte vor dem Eindringen der acrVA5-haltigen MGEs schützt (Abb. 1d). Darüber hinaus unterstreicht diese Studie das Potenzial, komplexere Systeme zur Regulierung der Cas12a-Spaltungsaktivitäten zu schaffen, die sowohl die Genbearbeitung in vivo als auch den Nachweis von Zielnukleinsäuren in vitro erleichtern können11.

Neben Cas12a fungiert AcrVA5 möglicherweise als Breitband-Acetyltransferase und beeinflusst zelluläre Stoffwechselprozesse. Als nächstes führten wir die In-vitro-Western-Blot-Analyse unter Verwendung von E. coli-Zellextrakten und gereinigtem AcrVA5 durch und stellten fest, dass eine große Anzahl von Proteinen durch AcrVA5 acetyliert werden konnte (ergänzende Abbildung S12). In ähnlicher Weise war nach Überexpression von AcrVA5 in E. coli der Acetylierungsgrad der gesamten Zelle stark erhöht, und die acetylierten Proteine konnten dann durch CobB in Gegenwart von NAD+ effizient deacetyliert werden (ergänzende Abbildung S13). Mithilfe der Massenspektrometrie haben wir 2688 Stellen und 1101 Proteine als potenzielle AcrVA5-Ziele weiter charakterisiert (Ergänzungstabelle S2). Wahrscheinlich aufgrund der geringen Proteingröße und der verringerten sterischen Hinderung zeigte AcrVA5 keine offensichtliche Präferenz für die Zielsequenz, bevorzugte jedoch positiv geladene Aminosäuren wie Lysin, Arginin und Histidin (ergänzende Abbildung S14). Angesichts der umfangreichen Ziele von AcrVA5 kann man sich vorstellen, dass CobB und AcrVA5 um die Kontrolle sowohl des Immunsystems des Wirts als auch darüber hinaus konkurrieren. Darüber hinaus wurde kürzlich festgestellt, dass die Dsr-Proteine, die die Deacetylasedomänen enthalten, Wirte vor dem Eindringen von dsDNA-Phagen schützen12, und die vorliegende Studie könnte möglicherweise einen Hinweis auf die unklaren Mechanismen liefern.

Zusammenfassend könnte man folgern, dass die Kriege zwischen eindringenden MGEs und den mikrobiellen Wirten nie enden werden und dass es neben der Acetyl- und Deacetylmodifikation wahrscheinlich noch andere Arten von Konkurrenzmechanismen gibt, die künftiger Forschung bedürfen. Während man, wie es in der chinesischen Redewendung heißt, glauben kann, dass ein Laster um einen Fuß steigt, Tugenden jedoch um zehn.

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Wir danken Professor Jiaoyu Deng (Wuhan Institute of Virology, CAS) für die großzügige Bereitstellung des E. coli W3110-Stammes und der Mutanten. Wir danken Qiuxiang Cheng (Tolo Biotech.) für ihre Hilfe bei der Datenanalyse, Weixin Li, Yuangang Ni und Bangtai Luo (Tolo Biotech.) für ihre Hilfe bei der Proteinreinigung und Jiacheng Wu (Shanghai Tech University) für seine Unterstützung in der Bioinformatik Analyse. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (31922046, 31770057), des Sanming Project of Medicine in Shenzhen (SZSM202011017) und des National Key Research and Development Program of China (2018YFA0903700) unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Xiaoman Kang, Lei Yin, Songkuan Zhuang

CAS Center for Excellence in Molecular Plant Sciences, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Shanghai, China

Xiaoman Kang & Guoping Zhao

Universität der Chinesischen Akademie der Wissenschaften, Peking, China

Xiaoman Kang

Tolo Biotechnology Company Limited, Shanghai, China

Lei Yin

Abteilung für klinisches Labor, Shenzhen Second People's Hospital & Institute of Translational Medicine/das erste angegliederte Krankenhaus des Shenzhen University Health Science Center, Shenzhen, China

Songkuan Zhuang, Tianshuai Hu, Yong Xu und Jin Wang

Hochschule für Biowissenschaften, Shanghai Normal University, Shanghai, China

Zhile Wu

Institut für Antibiotika, Huashan Hospital, Fudan-Universität, Shanghai, China

Yijian Chen

Schlüssellabor für klinische Pharmakologie von Antibiotika, Nationale Gesundheitskommission, Shanghai, China

Yijian Chen

Guangdong Key Laboratory of Systems Biology and Synthetic Biology for Urogenital Tumors, Shenzhen Second People's Hospital/das erste angegliederte Krankenhaus der Shenzhen University, Shenzhen, China

Jin Wang

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JW konzipierte das Projekt und gestaltete die Experimente. XK, LY und SZ führten die meisten Experimente durch und trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit bei. TH half bei der Proteinreinigung. Das ZW führte die bioinformatischen Arbeiten durch. GZ, YC, YX und JW analysierten die experimentellen Daten. JW schrieb das Manuskript, und alle Autoren überarbeiteten das Manuskript und genehmigten die endgültige Fassung des Manuskripts.

Korrespondenz mit Yijian Chen, Yong Xu oder Jin Wang.

JW und GZ sind Mitbegründer von Tolo Biotechnology Co., Ltd. LY ist Mitarbeiter von Tolo Biotechnology Co., Ltd. Alle anderen Autoren erklären, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Kang, X., Yin, L., Zhuang, S. et al. Reversible Regulierung der Cas12a-Aktivitäten durch AcrVA5-vermittelte Acetylierung und CobB-vermittelte Deacetylierung. Cell Discov 8, 45 (2022). https://doi.org/10.1038/s41421-022-00396-0

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Eingegangen: 15. November 2021

Angenommen: 10. März 2022

Veröffentlicht: 17. Mai 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41421-022-00396-0

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