Das Zellwand-Lipoprotein CD1687 fungiert bei der Desoxycholatbildung als DNA-bindendes Protein

npj Biofilms and Microbiomes Band 9, Artikelnummer: 24 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Fähigkeit bakterieller Krankheitserreger, wiederkehrende und anhaltende Infektionen hervorzurufen, hängt häufig mit ihrer Fähigkeit zur Bildung von Biofilmen zusammen. Clostridioides-difficile-Infektionen haben eine hohe Rezidiv- und Rückfallrate und es wird vermutet, dass Biofilme an ihrer Pathogenität und Persistenz beteiligt sind. Die Bildung von Biofilmen durch C. difficile ist noch immer kaum verstanden. Es wurde gezeigt, dass bestimmte Moleküle wie Desoxycholat (DCA) oder Metronidazol die Bildung von Biofilmen induzieren, die beteiligten Mechanismen sind jedoch noch unklar. In dieser Studie beschreiben wir die Rolle des C. difficile-Lipoproteins CD1687 bei der DCA-induzierten Biofilmbildung. Wir haben gezeigt, dass die Expression von CD1687, das Teil eines Operons innerhalb des CD1685-CD1689-Genclusters ist, durch mehrere Transkriptionsstartstellen gesteuert wird und einige als Reaktion auf DCA induziert werden. Für die Biofilmbildung ist nur CD1687 erforderlich und die Überexpression von CD1687 reicht aus, um die Biofilmbildung auszulösen. Mithilfe der RNAseq-Analyse haben wir gezeigt, dass CD1687 die Expression von Transportern und Stoffwechselwegen beeinflusst, und wir haben per Pull-Down-Assay mehrere potenzielle Bindungspartner identifiziert, darunter transportassoziierte extrazelluläre Proteine. Wir haben dann gezeigt, dass CD1687 in C. difficile oberflächenexponiert ist und dass diese Lokalisierung für die DCA-induzierte Biofilmbildung erforderlich ist. Angesichts dieser Lokalisierung und der Tatsache, dass C. difficile eDNA-reiche Biofilme bildet, haben wir bestätigt, dass CD1687 DNA auf unspezifische Weise bindet. Wir gehen daher davon aus, dass CD1687 eine Komponente der Downstream-Reaktion auf DCA ist, die zur Biofilmbildung führt, indem es die Interaktion zwischen den Zellen und der Biofilmmatrix durch Bindung von eDNA fördert.

Magen-Darm-Infektionen sind ein großes Problem für die öffentliche Gesundheit. In Ländern mit hohem Einkommen ist der grampositive, sporenbildende Anaerobier Clostridioides difficile die Hauptursache für nosokomialen Durchfall und Kolitis bei Erwachsenen, die eine Antibiotikabehandlung erhalten1,2. Darüber hinaus können C.-difficile-Infektionen (CDI) persistieren, was eine große Herausforderung bei der Behandlung von CDI nach Anti-C.-difficile-Infektionen darstellt. schwierige Antibiotikabehandlung. Wiederkehrende CDI treten bei mehr als 20 % der Patienten auf, die zur Behandlung ihrer ersten CDI-Episode Antibiotika erhalten, und diese Rate steigt nach neuen Episoden3,4. Die Ursachen für Rezidive sind nicht vollständig geklärt. Ein erneutes Auftreten kann entweder durch eine erneute Infektion mit einem neuen Stamm oder durch einen Rückfall mit demselben Stamm verursacht werden, was darauf hindeutet, dass C. difficile im Magen-Darm-Trakt persistieren kann5. Rückfälle standen zunächst in Zusammenhang mit der Fähigkeit von C. difficile, während der Infektion zu sporulieren und einer Antibiotikabehandlung zu widerstehen6,7. Es wird jedoch auch angenommen, dass Rückfälle mit dem Fortbestehen von C. difficile als Biofilm verbunden sind8,9. Es ist bekannt, dass anhaltende und chronische Infektionen, die durch verschiedene Krankheitserreger verursacht werden, mit der Bildung von Biofilmen verbunden sind10. Schätzungen zufolge sind mindestens 60 % aller nosokomialen und chronischen bakteriellen Infektionen mit Biofilmen verbunden11. Zur Untermauerung dieser Hypothese wurde kürzlich gezeigt, dass C. difficile von der Mikrobiota des Dickdarms gebildete Biofilme integriert und dieser Biofilm in einem Labormodell von CDI9 als Reservoir für Persistenz und Wiederauftreten fungierte.

Biofilme sind strukturierte Gemeinschaften von Mikroorganismen, die mit Oberflächen verbunden und von einer selbst produzierten extrazellulären Matrix umgeben sind, die je nach Bakterienart unterschiedlich ist12. C. difficile kann als einzelne Spezies oder zusammen mit anderen Bakterien auf verschiedenen abiotischen Oberflächen und mehreren In-vitro-Systemen Biofilme bilden9,13,14,15. Darüber hinaus kann C. difficile während einer Mausinfektion in vivo Multispezies-Gemeinschaften integrieren, was auf seine Fähigkeit hindeutet, Schleimhautbiofilme zu integrieren16. Darüber hinaus kann C. difficile in einem monoassoziierten Mausmodell fleckige, glykanreiche biofilmartige Strukturen bilden17. Obwohl C. difficile Multispezies-Biofilme im Magen-Darm-Trakt integrieren kann, liegen nur begrenzte Kenntnisse über die Biologie der Bildung von C. difficile-Biofilmen als Reaktion auf die Magen-Darm-Umgebung vor. Während einer Infektion treffen Krankheitserreger auf verschiedene Umweltfaktoren, einschließlich der Anwesenheit von Antibiotika, Gallensalzen, osmotischem Druck und unterschiedlichen Nährstoffquellen, und diese sind bekanntermaßen wichtige Signale für die Biofilmbildung während der Kolonisierung18,19. Interessanterweise stünde C. difficile während der Dysbiose vor unterschiedlichen Herausforderungen, da es die Ernährungsumwelt, den Gallensalzstoffwechsel sowie osmotischen und oxidativen/nitrosativen Stress verändert20. Jeder dieser Faktoren könnte die Bildung von Biofilmen auslösen. Beispielsweise verstärken subinhibitorische Konzentrationen von Antibiotika, die zur Behandlung von CDI eingesetzt werden, die Biofilmbildung in vitro21,22. Darüber hinaus haben wir kürzlich gezeigt, dass subinhibitorische Konzentrationen des sekundären Gallensalzes Desoxycholat (DCA) die Bildung von C. difficile-Biofilmen fördern15. Im DCA-induzierten Biofilm werden vegetative Zellen vor der Toxizität von DCA sowie Antibiotika und antimikrobiellen Peptiden geschützt15. Wir haben gezeigt, dass durch DCA induzierte Biofilme durch metabolische Anpassung und Neuprogrammierung entstehen, die von den verfügbaren Nährstoffen und ausgeschiedenen Metaboliten abhängig sind. Insgesamt ist ausgeschiedenes Pyruvat entscheidend für die Induktion der Biofilmbildung23.

Zusätzlich zu Umweltfaktoren, die die Biofilmbildung induzieren, wurde gezeigt, dass mehrere zelluläre Faktoren, darunter Zelloberflächenkomponenten und Regulatoren, die Biofilmbildung durch C. difficile beeinflussen24. Unter den Genen, die als Reaktion auf DCA hochreguliert wurden, ist ein Gen, das ein Lipoprotein (CD1687) kodiert, für die Biofilmbildung als Reaktion auf DCA15 essentiell. Ziel dieser Studie war es, die Rolle von CD1687 bei der Biofilmbildung durch C. difficile als Reaktion auf DCA zu charakterisieren. Wir haben gezeigt, dass CD1687 an der Oberfläche der Bakterien exponiert und aktiv ist und dass es in vitro DNA bindet. Dies legt nahe, dass CD1687 als Protein fungiert, das die Zellen an der in der Biofilmmatrix vorhandenen extrazellulären DNA (eDNA) verankert.

In früheren transkriptomischen Experimenten haben wir beobachtet, dass die Mehrzahl der Gene im CD1685-CD1689-Cluster im 48-stündigen DCA-induzierten Biofilm, der vom C. difficile-Stamm 630∆erm gebildet wurde, hochreguliert waren15,23. Die Inaktivierung von CD1687, jedoch nicht von CD1688, verhinderte jedoch die DCA-induzierte Biofilmbildung. Um zu verifizieren, dass die CD1685-CD1689-Gene ein Operon bildeten, wurden RT-PCR-Experimente mit RNA durchgeführt, die aus Zellen extrahiert wurde, die unter Biofilm-induzierenden Bedingungen (BHISG mit 240 µM DCA) gezüchtet wurden. Wir beobachteten ein einzigartiges Transkript von CD1685 bis CD1689, was auf das Vorhandensein mindestens einer polycistronischen mRNA an diesem Ort schließen lässt (Abb. 1a). Anschließend führten wir eine qRT-PCR durch, um zu bestätigen, dass die fünf Gene nach 48 Stunden in Gegenwart von DCA hochreguliert waren und nur geringe Unterschiede in den Faltungsänderungen beobachtet wurden (ergänzende Abbildung 1a).

a.RT-PCR durchgeführt mit den Primern EA043 und EA027 (Ergänzungstabelle 1) aus verschiedenen Nukleinsäurevorlagen. cDNA wurde unter Verwendung des EA027-Primers mit Gesamt-RNA erhalten, die aus 48-Stunden-Biofilmen extrahiert wurde, die in BHISG, ergänzt mit DCA (240 µM), gezüchtet wurden. b 5'RACE resultiert aus der Amplifikation der polyguanylierten cDNA, die jeweils mit den Primern EA021 und EA018 (Ergänzungstabelle 1), dann den Primern P1686 oder P1687 zusammen mit dem Universal Amplification Primer (AAP) aus dem 5'RACE-Kit erhalten wurde . Die RNA wurde aus 48-Stunden-Zellkulturen extrahiert, die unter Biofilm-induzierenden Bedingungen (BHISG + 240 µM DCA) oder nicht-Biofilm-induzierenden Bedingungen (BHISG) gezüchtet wurden. c Organisation des CD1685-CD1689-Clusters, der Position der für die RT-PCR verwendeten Primer und der Amplikons aus den 5'RACE-Ergebnissen unter Verwendung der P1686- oder P1687-Primer (Amplikongrößen wurden anhand des von Soutourina et al. (2020) identifizierten TSS vorhergesagt ) und Fuchs et al. (2021). TSS: Transcriptional Start Site; cDNA: komplementäre DNA; gDNA: genomische DNA. Die Blots in a und b stammen aus denselben Experimenten und wurden nicht verarbeitet.

Bei der Betrachtung unserer früheren RNAseq-Experimente stellten wir eine Kartierungsverzerrung der Sequenzierungslesungen zugunsten von CD1687, CD1688 und CD1689 fest (ergänzende Abbildung 1b). Interessanterweise haben aktuelle Analysen drei Transkriptionsstartstellen (TSS) für den CD1685-CD1689-Locus vorhergesagt: eine stromaufwärts des CD1685-Gens (TSS1), eine stromaufwärts des CD1686-Gens (TSS2) und eine in der kodierenden Sequenz von CD1686 (TSS3)25 ,26 (Abb. 1c). Um das Vorhandensein mehrerer TSS zu bestätigen, wurden 5'-RACE-Experimente mit Gesamt-RNA durchgeführt, die aus Zellen extrahiert wurde, die 48 Stunden lang in BHISG mit DCA (d. h. Biofilm-induzierend) oder ohne DCA (d. h. nicht Biofilm-induzierend) gezüchtet wurden. Die anfänglichen reversen Transkriptionen wurden mit zwei Primern durchgeführt, die entweder die kodierende Sequenz von CD1686 (P1686) oder die kodierende Sequenz von CD1687 (P1687) annealten (Abb. 1b, c). In Abwesenheit von DCA wurde nur ein Amplikon beobachtet, das mit dem TSS in CD1686 assoziiert ist. Dieses Amplikon war nachweisbar, wenn der P1686-Primer verwendet wurde, jedoch nicht mit dem P1687-Primer. In Gegenwart von DCA beobachteten wir mit jedem Primer (P1686 oder P1687) Amplikons, die den drei vorhergesagten TSS entsprachen, und mit P1687 wurden zwei zusätzliche Amplikons nachgewiesen. Dies legt nahe, dass diese beiden zusätzlichen TSS (TSSa und TSSb; Abb. 1c) in Gegenwart von DCA aktiv sind und eines davon (TSSa) das aktivste aller TSS zu sein scheint (Abb. 1b). Jedes Amplikon wurde sequenziert (Ergänzungstabelle 2) und die Position von TSS1, TSS2 und TSS3 stimmte weitgehend mit der vorhergesagten Position überein. Die große Variation der Sequenzen für TSSa und TSSb machte es jedoch schwierig, ihre genaue Position zu identifizieren. Insgesamt wird die Transkription des CD1685-CD1689-Operons von mehreren TSS in Gegenwart von DCA initiiert, was darauf hindeutet, dass mehrere Faktoren integriert sind, um die Expression des CD1685-1689-Operons zu regulieren, um den Zustand der Bakterienpopulation widerzuspiegeln.

Wir haben CD1687 zuvor mit dem Clostron-System15 inaktiviert, aber dieser Ansatz weist bekanntermaßen einige Einschränkungen auf. Um zu bestätigen, dass nur CD1687 für die Biofilmbildung erforderlich war, wurden CD1686, CD1687 und CD1688-CD1689 gelöscht (ergänzende Abbildung 2a). Wie zuvor beobachtet, wirkte sich nur die Deletion von CD1687 negativ auf die Biofilmbildung aus und die Komplementierung stellte den Phänotyp wieder her (ergänzende Abbildung 2bc). Interessanterweise wurden durch die Deletion von CD1686 TSS3, TSSa und TSSb entfernt, was darauf hindeutet, dass TSS1 und/oder TSS2 für die Transkription von CD1687 in Gegenwart von DCA ausreichen, was zur Bildung eines Biofilms führt.

Da CD1687 für die DCA-induzierte Biofilmbildung erforderlich ist und zuvor in der Zellwandfraktion lokalisiert war15, stellten wir die Hypothese auf, dass CD1687 ein DCA-empfindliches Protein ist. Um diese Hypothese zu testen, haben wir die Fähigkeit von CD1687 überprüft, mithilfe der Oberflächenplasmonresonanz direkt mit DCA zu interagieren. Wir haben gezeigt, dass CD1687 mit DCA interagieren kann (ergänzende Abbildung 3). Allerdings ist die Dissoziationskonstante hoch (Kd von 1,65 ± 0,58 mM) und die geschätzte Stöchiometrie der Wechselwirkung beträgt 5 ± 1 DCA-Moleküle für ein CD1687-Protein, was bedeutet, dass die Wechselwirkung nicht spezifisch ist.

Interessanterweise beobachteten wir eine Zunahme der Biofilmbildung in Gegenwart und bis zu einem gewissen Grad auch in Abwesenheit von DCA, wenn die ∆1687-Mutante mit einem induzierbaren, plasmidbasierten CD1687 (pDIA6920) ergänzt wurde (ergänzende Abbildung 2C). Obwohl der Anstieg nicht signifikant war, deutete dies darauf hin, dass CD1687 in Abwesenheit von DCA die Bildung von Biofilmen induzieren könnte. Um diese Hypothese zu testen, wurde pDIA6920 in den Wildtyp-Stamm eingeführt und seine Fähigkeit, in Abwesenheit von DCA einen Biofilm zu bilden, mit und ohne Zugabe des Induktors ATC bewertet. Bei Überexpression von CD1687 war nach 24 und 48 Stunden ein stärkerer Biofilm nachweisbar (Abb. 2). Zusammenfassend legen unsere Ergebnisse nahe, dass die CD1687-Expression für die Biofilmbildung entscheidend ist, für deren Aktivität kein DCA erforderlich ist.

Die Bildung von Biofilmen wurde 24 Stunden oder 48 Stunden nach der Inokulation in BHISG +/– ATC (100 ng/ml) mit dem Wildtyp-Stamm (630Δerm) getestet, der entweder einen leeren Kontrollvektor (pDIA6103) oder den Vektor enthielt, der die Expression von CD1687 ermöglichte der induzierbare Ptet-Promotor (pDIA6920). Jeder Datenpunkt stellt ein unabhängiges biologisches Replikat dar, das aus 2 bis 4 technischen Replikaten besteht. Das zur Darstellung quantitativer Daten verwendete Boxplot zeigt den Median, das Minimum, das Maximum sowie das obere und untere Quartil. Sternchen geben die statistische Signifikanz mit einem einfaktoriellen ANOVA-Test gefolgt von einem Tukey-Mehrfachvergleichstest an (ns: nicht signifikant; ****p < 0,0001).

Da CD1687 für die DCA-induzierte Biofilmbildung essentiell ist und seine Überexpression in Abwesenheit von DCA die Biofilmbildung auslösen kann, wollten wir Gene identifizieren, deren Expression in Gegenwart von CD1687 während des Biofilmbildungsprozesses verändert wird. Zu diesem Zweck führten wir zwei transkriptomische Analysen durch: eine zum Vergleich des Wildtyps und der ∆1687-Mutante, die 24 Stunden lang in Gegenwart von DCA gezüchtet wurde, und die zweite zum Vergleich des Wildtyps, der entweder das CD1687-induzierbare Plasmid (pDIA6920) oder einen leeren Vektor enthielt. beide wurden 24 Stunden lang in Abwesenheit von DCA und in Gegenwart von ATC als Induktor gezüchtet.

Insgesamt 527 Gene hatten eine signifikante unterschiedliche Expression mit einer fachen Veränderung von <0,5 oder >2 im Wildtyp-Stamm im Vergleich zur ∆1687-Mutante unter Biofilm-induzierenden Bedingungen (+DCA) (Abb. 3). In Gegenwart von DCA scheint CD1687 hauptsächlich die Zellwandvernetzung (vanY2Y3) sowie mehrere nicht charakterisierte Regulatoren herunterzuregulieren (ergänzende Abbildung 4, ergänzende Tabelle 3). Es scheint eine Verschiebung der Membrantransporter zu geben, die zu einem Anstieg des Imports von verzweigtkettigen Aminosäuren und Eisen sowie zu einer Veränderung des Zuckertransports führen kann (Ergänzungstabelle 3). Im Hinblick auf den Stoffwechsel verlagern sich die Zellen von der Nutzung von Succinat (CD2338-CD2344), dem Wood-Ljungdahl-Weg und der Biosynthese aromatischer Aminosäuren hin zur Fermentation von Acetoin, Leucin, verzweigtkettigen Aminosäuren und Glycin (Ergänzende Abbildung 4). , Ergänzungstabelle 3).

Venn-Diagramm der Gene, die in den beiden in dieser Studie durchgeführten Transkriptomik-Experimenten unterschiedlich reguliert wurden (Ergänzungstabelle 4).

Bei Überexpression von CD1687 wurden 809 Gene unterschiedlich exprimiert, 343 Gene wurden hochreguliert und 466 wurden herunterreguliert (Abb. 3). Wie in der ergänzenden Abbildung 4 beschrieben, weisen Veränderungen in der Genexpression auf eine Verschiebung der Transporter, des Stoffwechsels und der Regulation hin. Insbesondere wird die Expression mehrerer Zuckertransporter erhöht, während die Expression der Transporter für verzweigtkettige Aminosäuren, Methionin, Alanin und Glycin herunterreguliert wird (Ergänzungstabelle 3). Im Hinblick auf den Stoffwechsel sind Gene hochreguliert, die an der Acetoinverwertung, Stickland-Fermentationen mit aromatischen Aminosäuren oder Leucin, dem Wood-Ljungdahl-Weg und dem Pentosephosphatweg beteiligt sind, sowie diejenigen, die an der Biosynthese mehrerer Aminosäuren wie Histidin und Isoleucin beteiligt sind , Valin und Cystein (Ergänzungstabelle 3). Das dltABCD-Operon ist hochreguliert, was auf eine Zunahme der D-Alanylierung der Teichonsäuren (dltABCD) hindeutet. Interessanterweise stellten wir fest, dass der Gencluster, der das Flagellum und die mit der Sporulation verbundenen Gene kodiert, hochreguliert war.

Als wir beide transkriptomischen Analysen verglichen, überlappten sich nur wenige Gene zwischen beiden Analysen. Nur 69 Gene veränderten sich in die gleiche Richtung, während 47 Gene in die entgegengesetzte Richtung reguliert wurden (Abb. 3). Die verbleibenden 1220 Gene wurden nur unter beiden Bedingungen unterschiedlich exprimiert (Abb. 3). Zu den Genen, die unter beiden Bedingungen reguliert wurden, gehören diejenigen, die an der Cysteinsynthese (cysE, cysK), der Leucinverwertung in der Stickland-Fermentation (hadABCI), der Acetoin-Fermentation (acoABCL), Zellwandproteinen (cwp9, cwp12) und einigen Transportern (alsT, der Alanin transportiert) beteiligt sind oder Glycin, rbsK transportiert Ribose) und Regulierung (sinRR'). Insgesamt deutet dies darauf hin, dass CD1687 eine metabolische Reorganisation induziert, einschließlich derjenigen, die als Reaktion auf DCA auftreten und zur Bildung von Biofilmen führen23.

Diese Änderungen stimmen jedoch nicht vollständig mit unseren vorherigen Analysen überein23. Wir haben zuvor beobachtet, dass DCA die Hochregulierung von Genen verursacht, die an Butanoat-, Laktat- und Acetat-Fermentationen beteiligt sind, eine Verschiebung bei Stickland-Fermentationen von der Verwendung aromatischer Aminosäuren zur Verwendung verzweigtkettiger Aminosäuren und Glycin sowie die Herunterregulierung von Genen, die an der Glykolyse, der Glukoseaufnahme und der Sporulation beteiligt sind23. Diese Veränderungen wurden nicht beobachtet, als CD1687 überexprimiert wurde, was darauf hindeutet, dass CD1687 nicht an diesen Prozessen beteiligt ist oder nicht die unmittelbare Reaktion auf DCA vermittelt. CD1687 ist wahrscheinlich Teil der Downstream-Reaktion und kann mit anderen Proteinen interagieren, um diese Veränderungen zu fördern.

Da es sich bei CD1687 um ein Zellwandprotein15 handelt, das über keine Transmembrandomäne verfügt, aber wahrscheinlich über einen Myristoyl-Anker an der Zelloberflächenmembran verankert ist27, stellten wir die Hypothese auf, dass CD1687 Transkriptionsänderungen durch die Übertragung externer Signale durch Interaktion mit Membranproteinen induziert. Um diese potenziellen Proteine zu finden, führten wir einen Pulldown-Assay mit Rohextrakten von C. difficile-Zellen durch, die ein C-terminales Hexahistidin-markiertes CD1687 in BHISG ohne DCA überexprimierten (Ergänzungstabelle 5). Sie wurden mit Kontrollextrakten verglichen, die aus einer C. difficile-Mutante ∆1687 mit dem leeren Vektor unter den gleichen Bedingungen gesammelt wurden. Unter den 43 Proteinen, die nur in den Testproben und nicht in den Kontrollproben identifiziert wurden, zu denen auch das CD1687-Protein gehörte (Ergänzungstabelle 5), handelt es sich vermutlich um vier Membranproteine, die eine Komponente des Zuckertransporters (CD2667) und einen Natriumsymporter enthalten ( CD2693). Wir haben außerdem vier Proteine identifiziert, die zur großen Familie der Proteine zur Bindung gelöster Stoffe gehören, die mit ABC-Transportern und einer Nukleotid-Phosphodiesterase (CD0689) assoziiert sind. Diese fünf Proteine könnten am Signaltransport und der zellulären Reaktion beteiligt sein und zur Anpassung an verschiedene Umweltbedingungen führen28,29. Unter den Membranproteinen fanden wir auch ein mutmaßliches Lipoprotein (CD0747) und ein Protein der LCP-Familie (LytR-CpsA-Psr) (CD2766), die an der Zellwand-Polysaccharid-Assemblierung beteiligt sind30. Wir stellten fest, dass nur ein kodierendes Gen von Proteinpartnern (CD0037) in beiden Transkriptomen hochreguliert war (Ergänzungstabelle 5), das typischerweise im Zytoplasma lokalisiert ist. Da es sich bei den meisten der im Pulldown-Experiment identifizierten Membranproteine um Zellwandproteine handelt, die am Membrantransport beteiligt sind, ist es möglich, dass CD1687 den Transport verschiedener Nährstoffe direkt beeinflusst und mit dem beobachteten Effekt in unseren Transkriptomen übereinstimmt.

Da CD1687 in der Zellwandfraktion15 nachgewiesen wurde, fragten wir uns, ob CD1687 an der Zelloberfläche exponiert ist. Um dies zu überprüfen, führten wir eine epifluoreszenzmikroskopische Analyse des Stammes C. difficile 630Δerm und seiner Derivate unter Verwendung von gegen CD1687 gezüchteten polyklonalen Kaninchenantikörpern durch. Bei 48-stündigem Wachstum in BHISG mit oder ohne DCA wurde in der ∆1687-Mutante kein Signal beobachtet, was die Spezifität unseres Antikörpers bestätigt (Abb. 4 und ergänzende Abbildung 5). Für den Wildtyp-Stamm beobachteten wir ein schwaches Signal, wenn er ohne DCA gezüchtet wurde, was bestätigt, dass dieses Protein unter nicht biofilminduzierenden Bedingungen in geringen Mengen exprimiert wird. In Gegenwart von DCA war das Signal stärker, obwohl die Expression von CD1687 in der Population nicht homogen war. Im Gegensatz dazu ist das Signal für CD1687 in der Population des komplementierten Stammes ∆1687 homogen (Abb. 4 und ergänzende Abbildung 5). Da die Zellen während des Experiments nicht permeabilisiert wurden und PFA die Membranpermabilität nicht wesentlich beeinflusst31, kamen wir zu dem Schluss, dass CD1687 in die Zellwand exportiert und an der Zelloberfläche freigelegt wird.

Eine In-situ-Epifluoreszenzmikroskopieanalyse wurde an 48-Stunden-Biofilmen durchgeführt, die in BHISG + ATC (100 ng/ml) gezüchtet wurden, entweder in Gegenwart oder Abwesenheit von DCA (240 µM), wie angegeben. Bei den getesteten Stämmen handelte es sich um den Wildtyp-Stamm (630Δerm), der den Kontrollvektor pDIA6103 trug, und um den Stamm ∆1687, der das Plasmid mit einem induzierbaren CD1687 (pDIA6920) oder das Kontrollplasmid (pDIA6103) trug. Die DNA wird mit DAPI (blau) gefärbt und CD1687 wird mit spezifischen Anti-CD1687-Kaninchen-Antikörpern markiert, die mit einem TexasRed-konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper (rot) nachgewiesen werden. Die Bilder sind repräsentativ für drei biologische Replikate und wurden mit einem inversen Nikon Eclipse Ti-Mikroskop (Nikon, Japan) aufgenommen. Maßstabsleiste: 10 µm.

Basierend auf der zellulären Lokalisierung von CD1687 fragten wir uns, ob die Zugabe der Anti-CD1687-Antikörper während des Wachstums die DCA-induzierte Biofilmbildung verhindern könnte. Wie in Abb. 5a gezeigt, hemmte die Zugabe der polyklonalen Anti-CD1687-Antikörper zu Zellen, die unter Biofilm-induzierenden Bedingungen (BHISG + 240 µM DCA) gezüchtet wurden, die Biofilmbildung dosisabhängig stark. Es wurde keine hemmende Wirkung beobachtet, wenn ein unveröffentlichter unspezifischer Antikörper in der höchsten Konzentration von Anti-CD1687 verwendet wurde, der die Biofilmbildung hemmte (Daten nicht gezeigt). Darüber hinaus wurde das Bakterienwachstum durch die Antikörper nicht beeinflusst, unabhängig von der in den Biofilmtests verwendeten Konzentration (Abb. 5b). Daher verhindert die Hemmung der extrazellulären Funktion von CD1687 die Bildung von Biofilmen, was darauf hindeutet, dass CD1687 an der Zelloberfläche exponiert ist und dass seine Anwesenheit an der Oberfläche der Zellwand für die DCA-induzierte Biofilmbildung von entscheidender Bedeutung ist.

a Die Biofilmbildung des Stammes 630Δerm wurde 48 Stunden lang in BHISG mit DCA-Kulturen (240 µM) in Gegenwart unterschiedlicher Konzentrationen von Anti-CD1687-Kaninchen-Antikörpern (0,05 mg/ml bis 0,2 mg/ml) getestet. b Wachstumskinetik (OD600nm) des WT (630Δerm) in BHISG-Medium mit PBS oder DCA, ergänzt mit unterschiedlichen Konzentrationen von Anti-CD1687-Kaninchen-Antikörpern (0,05 mg/ml bis 0,2 mg/ml). Ab: Antikörper; nsAb: unspezifischer Antikörper. c Die von alphafold2 vorhergesagte Struktur von CD1687 zeigt ein N-terminales Signalpeptid S (rot), das über ein Linkerpeptid (grün) mit der α-Beta-Domäne (lila) verbunden ist, mit einer weiteren ähnlichen β-Beta-Domäne (gelb) in der C-terminalen Region . d 48 h Biofilme bilden sich durch verschiedene Δ1687-Stämme, die mit einem leeren Vektor (pDIA6103) oder Plasmiden ergänzt sind, die das CD1687 in voller Länge (pDIA6920) oder das verkürzte CD1687, dem eine der beiden entfernten Domänen (pDIA7242 und pDIA7243, Ergänzungstabelle 1) fehlt, überexprimieren BHISG mit ATC (100 ng/ml) und DCA (240 µM). Jeder Datenpunkt stellt ein unabhängiges biologisches Replikat dar, das aus 2 bis 4 technischen Replikaten besteht. Die zur Darstellung quantitativer Daten verwendeten Boxplots zeigen den Median, das Minimum, das Maximum sowie das obere und untere Quartil. Sternchen zeigen die statistische Signifikanz mit einem einfaktoriellen ANOVA-Test gefolgt von einem Dunnett-Mehrfachvergleichstest (a) (ns: nicht signifikant; **p < 0,01) oder einem Tukey-Mehrfachvergleichstest (d) (ns: nicht signifikant; ***) an. *p < 0,001).

Um Einblicke in die Strukturfunktion von CD1687 zu erhalten, haben wir die Software AlphaFold232 verwendet, um die 3D-Proteinstruktur von CD1687 vorherzusagen. Wie in Abb. 5c gezeigt, verfügt CD1687 über ein N-terminales Alpha-Helix-Signalpeptid und zwei mutmaßliche Beta-Domänen. Um nach möglichen Funktionen der Beta-Domänen zu suchen, wurde die mutmaßliche Struktur von CD1687 in der Ekhidna-Datenbank über den Dali-Server33 analysiert, es wurde jedoch keine Funktion festgestellt. Da die Funktion von CD1687 einer der beiden Beta-Domänen zugeordnet werden konnte, ergänzten wir die ∆1687-Mutante, indem wir CD1687 überexprimierten, wobei eine der beiden Domänen entfernt wurde, und diese Stämme unter Biofilm-induzierenden Bedingungen (BHISG + 240 µM DCA) wachsen ließen. Komplementierung des Mutanten wurde nicht beobachtet, was darauf hinweist, dass C. difficile beide Beta-Domänen von CD1687 benötigt, um DCA-induzierte Biofilme zu bilden (Abb. 5d).

Da wir keine potenzielle Funktion der CD1687-Struktur identifiziert haben, wollten wir herausfinden, ob CD1687 eine DNA-bindende Aktivität aufweist, wie sie für Staphylococcus aureus-Lipoproteine beobachtet wird, die die eDNA-abhängige Biofilmbildung fördern34. Da die C. difficile-Biofilmmatrix hauptsächlich aus eDNA15 besteht, haben wir die Fähigkeit von CD1687, an DNA zu binden, mithilfe eines Elektromobilitäts-Shift-Assays (EMSA) getestet. Als das gereinigte CD1687-Protein mit dem E. coli-DNA-Plasmid pUC9 oder einem PCR-generierten Amplikon, das aus C. difficile-DNA (aus einer Sequenz in der Region von CD1438) hergestellt wurde, inkubiert wurde, beobachteten wir, dass die Migration der DNA durch das verschoben wurde Das Vorhandensein von CD1687 und eine steigende CD1687-Konzentration korrelieren mit einer stärkeren Retention (Abb. 6a, b). Allerdings beobachteten wir keine Verschiebung, wenn CD1687 hitzeinaktiviert wurde oder wenn BSA als Kontrolle bei der höchsten CD1687-Konzentration verwendet wurde, die DNA-Fragmente verschiebt. Um zu testen, ob CD1687 die Verankerung der Bakterien an eDNA ermöglicht, führten wir ein DNA-Bindungsexperiment mit ganzen C. difficile-Bakterien durch (Abb. 6d). Wir haben dasselbe Amplikon, das in EMSA verwendet wurde (Abb. 6b), kovalent mit einer Microarray-Platte verknüpft, bevor wir den Stamm ∆1687 pDIA6920 (Ergänzungstabelle 1) hinzugefügt haben, der CD1687 produziert oder nicht. Anschließend zählten wir die an DNA gebundenen Bakterien, nachdem wir DNAse I in die Vertiefungen gegeben hatten (Abb. 6d). Wir fanden heraus, dass Bakterien stärker an der DNA in den Vertiefungen hafteten, wenn CD1687 produziert wurde, als wenn DNA oder CD1687 fehlten (Abb. 6c). Aus diesem Experiment und den EMSA-Ergebnissen schließen wir daher, dass CD1687 auf unspezifische Weise an eDNA binden kann. Diese Bindungsaktivität ermöglicht es C. difficile wahrscheinlich, sich an der eDNA im Biofilm zu verankern.

Der Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) wurde mit einem E. coli-Plasmid pUC9 oder b C. difficile-DNA (450 bp PCR-Amplikon) durchgeführt, gemischt mit verschiedenen Konzentrationen von CD1687 (bis zu 16 µM), mit 16 µM hitzeinaktiviertem ( HI) CD1687 oder BSA als Kontrollen verwendet. c C. difficile-KBE, gemessen anhand des Adhäsionstests. Der Stamm Δ1687 pDIA6920 wurde verwendet, der CD1687 als Reaktion auf ATc exprimierte oder nicht, wie in (d) beschrieben. Schema des Adhäsionstests. Wir verglichen die Adhäsion von Bakterien, die entweder CD1687 exprimierten oder nicht, in Vertiefungen, die kovalent gebundene DNA enthielten oder nicht. Dieses Schema wurde mit biorender.com erstellt. Das zur Darstellung quantitativer Daten verwendete Boxplot zeigt den Median, das Minimum, das Maximum sowie das obere und untere Quartil. Jeder Datenpunkt stellt ein unabhängiges biologisches Replikat dar. Sternchen geben die statistische Signifikanz mit einem einfaktoriellen ANOVA-Test gefolgt von Dunnetts Mehrfachvergleichstest an (**p < 0,01; ***p < 0,001). Die Blots in a und b stammen aus denselben Experimenten und wurden nicht verarbeitet.

In dieser Studie haben wir bestätigt, dass nur CD1687 im CD1685-CD1689-Cluster für die DCA-induzierte Biofilmbildung erforderlich ist und dies die Lokalisierung von CD1687 an der Zelloberfläche erfordert.

Tatsächlich wird dieses Protein sowohl in der Zellwand15 als auch auf der Zelloberfläche nachgewiesen (Abb. 4 und 5a), es wurde jedoch als membranverankertes Lipoprotein27 nachgewiesen und beschrieben. Die geringe Größe des Proteins und seine vorhergesagte Struktur legen nahe, dass dieses Protein näher an der Membran als an der Oberfläche der Zellwand liegen sollte. Da CD1687 leicht aus der Zellwandfraktion gewonnen werden kann, deutet dies darauf hin, dass es möglicherweise noch unbeschriebene posttranslationale Modifikationen an CD1687 gibt, die seinen Myristoyl-Anker spalten und es dem Protein ermöglichen würden, an die Zellwand zu binden. Wir stellten fest, dass es eine signifikante Heterogenität als Reaktion auf DCA hinsichtlich der Expression und Lokalisierung von CD1687 an der Zelloberfläche in der Population gibt, wie durch Mikroskopie beobachtet (Abb. 4 und ergänzende Abbildung 5). Dies würde das relativ niedrige Transkriptionsniveau des CD1685-CD1689-Genclusters auf Bevölkerungsebene erklären15. Interessanterweise ist der gebildete Biofilm umso größer, je homogener CD1687 in der Zellpopulation exprimiert wird (Abb. 4, ergänzende Abbildung 2c). Nach unserem Kenntnisstand wurde bei C. difficile noch nicht über die Expressionsheterogenität kritischer Biofilmkomponenten berichtet. Die phänotypische Heterogenität in Biofilmen ist bei mehreren anderen Bakterienarten gut charakterisiert, was zu einer phänotypischen Diversifizierung und Arbeitsteilung in einer klonalen Bakterienpopulation führt35. Beispielsweise synthetisiert eine Subpopulation von Zellen die Exopolysaccharidmatrix während der Biofilmbildung in B. subtilis36. In Planktonzellen von C. difficile wurde eine phänotypische Heterogenität beschrieben, die sich auf die Expression des Flagellums und der Toxine auswirkte37. In diesem Fall wird die Heterogenität durch ein spezifisches DNA-Rekombinationsereignis gesteuert, das durch RecV38 und den Rho-Faktor39 vermittelt wird. Darüber hinaus unterliegt die Koloniemorphologie von C. difficile auch einer phänotypischen Heterogenität, die zu Veränderungen in der bakteriellen Physiologie und Pathogenese führt. Dies geschieht durch Phasenvariation der Expression des CmrRST-Signaltransduktionssystems40,41.

Angesichts der Tatsache, dass CD1687 ein Operon mit einem Zweikomponenten-Regulationssystem (CD1688-1689) bildet und dass CD1687 ein Zellwandprotein ist, stellten wir zunächst die Hypothese auf, dass CD1687 an der Signaltransduktion beteiligt war, die als Reaktion auf DCA zu Transkriptionsmodifikationen führte. CD1687 band jedoch kein DCA, was die mutmaßliche Rolle von CD1687 als DCA-empfindliches Protein ausschließt. Darüber hinaus weisen die von CD168842 regulierten Gene mit Ausnahme der Sporulation nur begrenzte Überlappungen auf, was darauf hindeutet, dass CD1687 möglicherweise nicht Teil der CD1688-CD1689-Signalkaskade ist. Dies steht im Einklang mit der Abwesenheit von CD1689 und CD1688 in unserem Pulldown-Assay. Allerdings wurden in einem Pull-Down-Assay mehrere gelöste bindende Proteine und Transporter-assoziierte Proteine isoliert. Dies und die Transkriptionsanalyse liefern Hinweise darauf, dass CD1687 den Metabolismus von C. difficile beeinflusst. Um dies zu untermauern, wurden Regulatoren (Spo0A, CodY und SinRR'), die die Stoffwechselprioritäten während der Wachstumsphasen steuern, unterschiedlich reguliert, wenn CD1687 überexprimiert wurde43,44,45. Darüber hinaus wurde auch die Expression des für das Toxin kodierenden Gens und derjenigen, die an der Sporulation beteiligt sind, beeinflusst, und es ist bekannt, dass diese Prozesse vom Stoffwechselzustand von C. difficile abhängen. Als wir die Gene, die in Abwesenheit von CD1687 unter DCA-induzierenden Bedingungen unterschiedlich reguliert wurden, mit denen verglichen, die unterschiedlich reguliert wurden, wenn CD1687 in Abwesenheit von DCA überexprimiert wurde, gab es nur 69 gemeinsame Gene, darunter Gene, die an verschiedenen Stoffwechselwegen und Transporten beteiligt waren. Diese Veränderungen in stoffwechselassoziierten Genen überschnitten sich jedoch nicht mit unseren früheren Analysen zur Genexpression während der DCA-induzierten Biofilmbildung23, was darauf hindeutet, dass CD1687 nicht Teil der unmittelbaren Reaktion auf DCA ist und wahrscheinlich eine Rolle bei der nachgeschalteten Reaktion spielt. Zusammengenommen deuten unsere Daten darauf hin, dass CD1687 dabei hilft, die Stoffwechselprioritäten als Reaktion auf DCA neu zu organisieren. Diese Hypothese allein erklärt jedoch nicht die Rolle von CD1687 bei der Biofilmbildung ohne DCA. Daher kann CD1687 zusätzliche Rollen haben.

Interessanterweise interagieren viele Proteine, die sich auf der Oberfläche der Bakterienzellen befinden, mit der eDNA, die sich in der Biofilmmatrix befindet, und tragen so zur Organisation und strukturellen Stabilität des Biofilms bei46. Es wurde bereits gezeigt, dass Membranlipoproteine direkt mit eDNA interagieren und an der Biofilmarchitektur beteiligt sind. Bei S. aureus wurde festgestellt, dass mehrere membrangebundene Lipoproteine, die mit der eDNA der Biofilmmatrix interagieren, die Bildung von S. aureus-Biofilmen fördern34. Hier haben wir bestätigt, dass CD1687 in vitro mit DNA auf unspezifische Weise interagiert, sowohl mit dem gereinigten Protein als auch mit den Bakterien, die CD1687 produzieren, dessen Produktionsniveau ausreicht, um die bakterielle Adhäsion an eDNA zu erhöhen. Diese Ergebnisse stützen die Hypothese, dass CD1687 während der Biofilmbildung als eDNA-bindendes Protein fungiert, indem es Ankerpunkte für eDNA auf der Zelloberfläche schafft. Ähnlich wie bei unserer Beobachtung mit CD1687 führte die Überexpression von eDNA-bindenden Proteinen in S. aureus zu einer erhöhten Retention von Oberflächen-eDNA und einer erhöhten Biofilm-Biomasse. Allerdings hatte die Löschung der S. aureus-Lipoproteine nur minimale Auswirkungen auf die Biofilmbildung, aber die Porosität des Biofilms nahm zu, was darauf hindeutet, dass Wechselwirkungen des Lipoproteins mit eDNA zur gesamten Biofilmstruktur beitragen. Im Gegensatz zum in S. aureus gefundenen Lipoprotein verhinderte eine Deletion oder Inaktivierung von CD1687 die Biofilmbildung34. Die Interaktion von CD1687 mit eDNA scheint ein wesentlicher Bestandteil der DCA-induzierten Biofilmbildung zu sein. Andere Strukturen können ebenfalls mit eDNA interagieren. Kürzlich wurde gezeigt, dass zwei kleinere Untereinheiten (PilW und PilJ) des C. difficile T4P direkt mit eDNA interagieren, um die Biofilmbildung zu fördern47. Keine der Untereinheiten weist ein vorhergesagtes DNA-Bindungsmotiv auf, wie es bei CD1687 beobachtet wurde. Das T4P ist eine Struktur, die die Biofilmbildung in Abwesenheit48,49 oder Anwesenheit von DCA23 fördert. In Gegenwart von DCA wird PilW hochreguliert, ist aber für die Biofilmbildung nicht erforderlich15,23. Darüber hinaus wurde das pilW-Gen in unserem Transkriptom unterschiedlich reguliert; im WT im Vergleich zu Δ1687 mit DCA-Analyse hochreguliert (deutlich, aber unter dem Schwellenwert) und im überexprimierten CD1687 im Vergleich zum WT ohne DCA-Analyse herunterreguliert. Daher könnten CD1687 und T4P eine komplementäre Rolle spielen und die fehlende eDNA-Bindung durch eine dieser Komponenten könnte das Verhalten von C. difficile während der Biofilmbildung verändern.

Trotz der möglichen Rolle von CD1687 als eDNA-bindendes Protein und im Stoffwechsel können wir nicht ausschließen, dass die Überexpression von CD1687 die Eigenschaften der Zellwand durch die Wechselwirkungen von CD1687 mit anderen Membranproteinen und Transportern verändert (Ergänzungstabelle 5). Diese Wechselwirkungen könnten von verschiedenen Sensoren erfasst werden, die eine Rückkopplungsschleife aktivieren würden, um die Zellwand und die Zusammensetzung der Zelloberflächenproteine zu verändern. Beispielsweise wurde das dltABCD-Operon hochreguliert, als CD1687 in Abwesenheit von DCA überexprimiert wurde. Die DltABCD-Proteine sind für die D-Alanylierung von Teichonsäuren verantwortlich, die die elektrischen Ladungen der Zellwand und -oberfläche verändert50. Die Überexpression von CD1687 beeinflusste auch die Zellmorphologie; Als Reaktion auf DCA zeigen Zellen, die hohe Mengen an CD1687 exprimieren, eine verringerte Größen- und Formverzerrung (Abb. 4 und ergänzende Abbildung 5). Insgesamt kann die Überexpression von CD1687 nachgelagerte Auswirkungen auf die Physiologie von C. difficile haben und diese Veränderungen können zur Biofilmbildung beitragen.

Schließlich ist unsere Hypothese, dass der Mechanismus der Biofilmbildung in Gegenwart von DCA ein anderer ist als der Mechanismus, wenn DCA fehlt und CD1687 überexprimiert wird. Wir wissen, dass C. difficile in Gegenwart von DCA eine metabolische Neuorganisation durchläuft23 und basierend auf unseren Daten würde CD1687 bei der Festlegung metabolischer Prioritäten für die langfristige Anpassung helfen. Sobald genügend eDNA vorhanden ist, würde CD1687 mit der eDNA-Bindung interagieren und als Ankerpunkt dienen. Wenn CD1687 unabhängig von DCA überexprimiert wird, erhöht es die Homogenität der CD1687-Oberflächenlokalisierung in der Population und dient als mehrere Verankerungsstellen für eDNA, was zu einem stark anhaftenden Biofilm führt. Wie bei S. aureus beobachtet, können andere Lipoproteine eDNA in C. difficile binden und einige werden als Reaktion auf DCA23 hochreguliert. Im Gegensatz zu den in S. aureus charakterisierten Lipoproteinen hat das Lipoprotein CD1687 wahrscheinlich eine entscheidende Funktion im Stoffwechsel als Reaktion auf DCA und andere Lipoproteine bieten keine funktionelle Redundanz. Dies unterstreicht die Bedeutung von CD1687 für die Förderung der Biofilmbildung. Weitere Forschung ist erforderlich, um die Rolle und den Beitrag dieser anderen Lipoproteine zum Biofilm zu verstehen.

Die in dieser Studie verwendeten Bakterienstämme und Plasmide sind in der Ergänzungstabelle 1C aufgeführt. difficile-Stämme wurden anaerob (5 % H2, 5 % CO2, 90 % N2) in TY-Medium (30 g/L Trypton, 20 g/L Hefeextrakt) oder in BHISG-Medium (BHI mit 0,5 % (Gew./Vol.) Hefe) gezüchtet Extrakt, 0,01 mg/ml Cystein und 100 mM Glucose) und bei Bedarf mit Cefoxitin (250 μg/ml), D-Cycloserin (8 μg/ml) und Thiamphenicol (15 μg/ml) ergänzt. Zusätzlich wurden 100 ng/ml Anhydrotetracyclin (ATC) zugegeben, um den Ptet-Promotor von pRPF185-Vektorderivaten in C. difficile zu induzieren. E. coli-Stämme wurden in LB-Brühe, ergänzt mit Chloramphenicol (15 µg/ml) und Ampicillin (100 µg/ml), gezüchtet.

Über Nacht gezüchtete C. difficile-Kulturen in TY-Medium mit geeigneten Antibiotika wurden auf 1/100 mit frischem BHISG verdünnt, das die gewünschten Zusätze enthielt (240 µM DOC, 100 ng/ml ATC oder beides). Abhängig vom Assay wurden die verdünnten Kulturen dann entweder mit 1 ml pro Vertiefung in 24-Well-Platten (Polystyrol-Gewebekultur-behandelte Platten, Costar, USA) oder mit 200 µL in 96-Well-Platten (Polystyrol-Schwarz-Gewebekulturplatten) aliquotiert. behandelte Platten, Greiner Bio One, Österreich). Die Platten wurden 48 Stunden lang bei 37 °C in einer anaeroben Umgebung inkubiert. Die Biofilmbiomasse wurde in den 24-Well-Platten mit einer etablierten Methode gemessen15. Für Biofilm-Assays in 96-Well-Platten, die für die Mikroskopie verwendet werden, wurde verbrauchtes Medium vorsichtig durch Pipettieren entfernt und 200 µL PBS, ergänzt mit 4 % Paraformaldehyd (PFA), hinzugefügt. Die Platten wurden eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert und das Medium dann vorsichtig durch Pipettieren entfernt, bevor 48 Stunden lang bei 4 °C PBS hinzugefügt wurde. In allen Tests wurde steriles Medium als Negativkontrolle und Blindwert für die Tests verwendet.

Die Gendeletion in C. difficile wurde wie in Peltier et al.51 beschrieben durchgeführt. Regionen stromaufwärts und stromabwärts der interessierenden Gene wurden unter Verwendung der in der Ergänzungstabelle 1 beschriebenen Primerpaare PCR-amplifiziert. PCR-Fragmente und linearisiertes pDIA675451 wurden unter Verwendung von Gibson Assembly (NEB, Frankreich) gemischt und zusammengesetzt und durch Hitzeschock in E. coli NEB 10β transformiert Beanspruchung. Die Plasmidkonstruktionen wurden durch Sequenzierung verifiziert und Plasmide mit den richtigen Sequenzen wurden in E. coli HB101 (RP4) transformiert. Die resultierenden Stämme wurden als Spender in einem Konjugationstest mit den relevanten C. difficile-Stämmen verwendet. Anschließend wurden Deletionsmutanten mithilfe einer Gegenselektion erhalten, wie in Peltier et al.51 beschrieben.

C. difficile-Stämme wurden 48 Stunden lang in 20 ml BHISG-Kulturen mit ATC in Röhrchen anaerob gezüchtet. Zellen und Biofilme wurden durch Zentrifugation (10 min; 14.000 × g; 4 °C) geerntet und in einem kalten Phosphatpuffer (50 mM; pH = 7,0; 4 °C) gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in 1 ml desselben Phosphatpuffers resuspendiert, der die gereinigte katalytische Domäne des Endolysins CD27L (3 µg/ml) enthielt, und die Suspension wurde 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert, um die Bakterienzellen zu lysieren. Die Gesamtextrakte wurden dann 1 Minute lang gevortext und für den Pulldown-Assay mit Ni-NTA-Kügelchen verwendet, wie unten beschrieben, zur CD1687-Reinigung aus der E. coli-Expression. Im Pulldown-Assay wurden fünf biologische Replikate jeder Bedingung verwendet (Ergänzungstabelle 5).

Der E. coli-Stamm Bli5, der ein von pET20 abgeleitetes Plasmid enthält, das das CD1687-Gen trägt (Ergänzungstabelle 1), wurde verwendet, um Hexa-Histidin-markiertes CD1687-Protein ohne sein Signalpeptid zu überexprimieren. Die Zellen wurden über Nacht bei 37 °C in LB gezüchtet, ergänzt mit Glucose (1 % w/v) und Antibiotika (Ampicillin 100 µg/ml und Chloramphenicol 15 µg/ml). Die Übernachtkultur wurde (1/100) in 1 l des gleichen Mediums überführt und bei 37 °C inkubiert. Sobald die Kultur eine OD600nm von 0,5 erreichte, wurde IPTG zugegeben (Endkonzentration 0,1 mM) und die Kultur weitere 3 Stunden lang inkubiert. Anschließend wurden die Zellen durch Zentrifugation (5000 × g, 10 min, 4 °C) geerntet und das Pellet mit kaltem PBS gewaschen. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand verworfen und das resultierende Pellet bei –20 °C eingefroren. Das Pellet wurde dann in 15 ml Lysepuffer (50 mM Natriumphosphat, pH = 8,0; 300 mM NaCl) resuspendiert und mit Ultraschall behandelt. Nach der Zentrifugation (5000 × g, 10 min, 4 °C) wurde der Überstand gesammelt und mit Ni-NTA-Perlen gemischt und eine Stunde bei 4 °C inkubiert. Die Perlen wurden dann auf eine Elutionssäule übertragen und mit Waschpuffer (50 mM Natriumphosphat pH = 8,0; 300 mM NaCl; 10 mM Imidazol) gewaschen. Die Proteine wurden mit 2 ml Natriumphosphatpuffer (50 mM, pH = 8,0), ergänzt mit 300 mM NaCl, und einem Imidazolgradienten im Bereich von 50 mM bis 500 mM eluiert. Eluierte Proteine wurden durch Western-Immunblotting analysiert und Fraktionen, die CD1687 enthielten, wurden in TAE-Puffer (Tris-Base (20 mM); Essigsäure (10 mM); EDTA (0,5 mM); pH = 8,5) unter Verwendung von Slide-A-Lyzer-Dialyseeinheiten dialysiert (Thermo Fisher Scientific, USA). Um polyklonale Anti-CD1687-Antikörper zu züchten, wurden zwei weiblichen Kaninchen (New Zealand White) viermal 50 µg gereinigtes CD1687(His6) (0,5 ml Antigen mit 0,5 ml komplettem Freund-Adjuvans) am Tag 0, 14, 28 und 42 injiziert ) mit der Firma Covalab (Frankreich). Die Antikörper wurden am Tag 53 der Immunisierung gereinigt.

Alle Experimente wurden auf einem Biacore T200-Gerät (Cytiva, USA) durchgeführt, das bei 25 °C in Puffer TAE (20 mM Tris-Base, 10 mM Essigsäure, 0,5 mM EDTA, pH = 8,5) äquilibriert war. CD1687(His6) (100 µg/ml) wurde 600 s lang bei 2 µl/min auf einem NiCl2-beladenen NTA-Sensorchip eingefangen und erreichte eine Oberflächendichte von 1000–1200 RU (Resonanzeinheiten; 1RU ≈ 1 pg/mm2). DCA (16–2000 µM) wurde dann 120 s lang mit 10 µl/min gleichzeitig auf die CD1687-Oberfläche und auf einen leeren Referenzchip injiziert, von dem unspezifische Signale subtrahiert wurden.

Die Proteine wurden mit 5 mM TCEP 30 Minuten lang bei Raumtemperatur reduziert. Die Alkylierung der reduzierten Disulfidbrücken wurde mit 10 mM Iodacetamid 30 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln durchgeführt. Die Proteine wurden dann in zwei Schritten verdaut, zunächst mit 250 ng r-LysC Mass Spec Grade (Promega) für 4 Stunden bei 30 °C, dann wurden die Proben mit 100 mM Tris HCl pH 8,5 und 500 ng Sequencing Grade Modified Trypsin auf unter 2 M Harnstoff verdünnt wurde für den zweiten Aufschluss über Nacht bei 37 °C zugegeben. Die Proteolyse wurde durch Zugabe von Ameisensäure (FA) in einer Endkonzentration von 5 % gestoppt. Die resultierenden Peptide wurden mit AssayMAP C18-Kartuschen auf der AssayMAP Bravo-Plattform (Agilent) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Die Peptide wurden zur Trockne konzentriert und kurz vor der LC-MS-Injektion in 2 % Acetonitril (ACN) und 0,1 % FA resuspendiert.

Die LC-MS/MS-Analyse wurde mit einem Q ExactiveTM Plus-Massenspektrometer (Thermo Fisher Scientific) in Verbindung mit einem Proxeon EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific) durchgeführt. 500 ng Peptide wurden auf eine selbstgebaute 37-cm-C18-Säule (1,9 μm Partikel, 100 Å Porengröße, ReproSil-Pur Basic C18, Dr. Maisch GmbH, Ammerbuch-Entringen, Deutschland) injiziert. Säulenäquilibrierung und Peptidbeladung erfolgten bei 900 bar in Puffer A (0,1 % FA). Die Peptide wurden mit einem mehrstufigen Gradienten von 3 bis 6 % Puffer B (80 % ACN, 0,1 % FA) in 5 Minuten, 6 bis 31 % Puffer B in 80 Minuten, 31 bis 62 % Puffer B in 20 Minuten bei a getrennt Flussrate von 250 nL/min. Die Säulentemperatur wurde auf 60 °C eingestellt. MS-Daten wurden mit der Xcalibur-Software unter Verwendung einer datenabhängigen Methode erfasst. MS-Scans wurden mit einer Auflösung von 70.000 und MS/MS-Scans (feste erste Masse 100 m/z) mit einer Auflösung von 17.500 erfasst. Das AGC-Ziel und die maximale Injektionszeit für die Vermessungsscans und die MS/MS-Scans wurden auf 3E6, 20 ms bzw. 1E6, 60 ms eingestellt. Eine automatische Auswahl der 10 intensivsten Vorläuferionen wurde aktiviert (Top 10) mit einem dynamischen Ausschluss von 30 s. Das Isolationsfenster wurde auf 1,6 m/z eingestellt und die normalisierte Kollisionsenergie für die HCD-Fragmentierung auf 27 festgelegt. Wir haben ein Unterfüllungsverhältnis von 1,0 % verwendet, was einem Intensitätsschwellenwert von 1,7E5 entspricht. Nicht zugewiesene Ladungszustände der Vorläuferionen sowie die Ladungszustände 1, 7, 8 und > 8 wurden abgelehnt und die Peptidübereinstimmung wurde deaktiviert.

Die erfassten Rohdaten wurden mit der MaxQuant-Softwareversion 2.1.1.052 und der Andromeda-Suchmaschine53,54 analysiert. Die MS/MS-Spektren wurden anhand der C.difficile 630-Datenbank (3957 Einträge) durchsucht.

Alle Suchen wurden mit der Oxidation von Methionin und der N-terminalen Acetylierung des Proteins als variable Modifikationen und der Cysteincarbamidomethylierung als feste Modifikation durchgeführt. Trypsin wurde als Protease ausgewählt, was bis zu zwei fehlende Spaltungen ermöglichte. Die minimale Peptidlänge wurde auf 7 Aminosäuren festgelegt und die Peptidmasse auf maximal 4600 Da begrenzt. Die Falscherkennungsrate (FDR) für die Peptid- und Proteinidentifizierung wurde auf 0,01 festgelegt. Die Hauptsuchpeptidtoleranz wurde auf 4,5 ppm und die MS/MS-Übereinstimmungstoleranz auf 20 ppm festgelegt. Zweite Peptide wurden aktiviert, um Cofragmentierungsereignisse zu identifizieren. Auf Peptid- und Proteinebene wurde ein Grenzwert für die Falscherkennungsrate von 1 % angewendet. Die Massenspektrometrie-Proteomikdaten wurden über das PRIDE-Partner-Repository mit der Datensatzkennung PXD038282 beim ProteomeXchange-Konsortium hinterlegt. Die statistische Analyse der Proteomikdaten wurde wie zuvor beschrieben55 durchgeführt. Kurz gesagt, pro Zustand wurden vier biologische Replikate erworben. Um deutlich unterschiedlich häufig vorkommende Proteine zwischen zwei Bedingungen hervorzuheben, wurden Differenzanalysen über die folgende Datenanalyse-Pipeline durchgeführt: (1) Löschen der umgekehrten und potenziell kontaminierenden Proteine; (2) nur Proteine mit mindestens zwei quantifizierten Werten unter einem der beiden verglichenen Bedingungen zu behalten, um Fehlidentifizierungen zu begrenzen und ein Minimum an Reproduzierbarkeit sicherzustellen; (3) log2-Transformation der verbleibenden Proteinintensitäten; (4) Normalisieren der Intensitäten durch mittlere Zentrierung innerhalb der Bedingungen dank der normalisierten Funktion des R-Pakets DAPAR56, (5) Entfernen von Proteinen ohne Wert in einem der beiden verglichenen Bedingungen: da sie in einem Zustand quantitativ vorhanden sind und in einem anderen fehlen , werden sie als unterschiedlich häufig vorkommende Proteine betrachtet und (6) eine statistische Differenzanalyse an ihnen durchführen, indem eine minimale 2-fache Änderung zwischen den Bedingungen erforderlich ist und ein LIMMA-t-Test57,58 in Kombination mit einer adaptiven Benjamini-Hochberg-Korrektur der p-Werte verwendet wird dank der Adjust.p-Funktion des R-Pakets cp4p59. Die robuste Methode von Pounds und Cheng wurde verwendet, um den Anteil echter Nullhypothesen im Satz statistischer Tests zu schätzen60. Die Proteine, die mit einem angepassten p-Wert unter einem FDR-Wert von 1 % assoziiert sind, wurden als signifikant unterschiedlich häufig vorkommende Proteine angesehen. Schließlich sind die Proteine von Interesse, die aus dieser statistischen Analyse hervorgehen, ergänzt durch diejenigen, die bei einem Zustand quantitativ fehlen und bei einem anderen vorhanden sind.

Die Zellen wurden in Platten mit 24 Vertiefungen gezüchtet und 10 Vertiefungen pro Platte wurden verwendet, um ein Replikat für eine Bedingung herzustellen. Für Biofilmbedingungen wurde der Überstand durch Umdrehen der Platte entfernt und die Biofilme wurden zweimal sorgfältig gewaschen und dann in 3 ml PBS resuspendiert. Unter anderen Bedingungen wurde die gesamte Bakterienpopulation gesammelt und die Zellen durch Zentrifugation (10 min, 8000 × g, 4 °C) geerntet und in 1 ml PBS resuspendiert. Zellsuspensionen in PBS wurden abschließend zentrifugiert (10 min, 8000 × g, 4 °C) und die Pellets bis zur weiteren Verwendung bei –80 °C eingefroren. Die Extraktion der Gesamt-RNA aus den Bakterien und der qRT-PCR-Assay wurden wie in Saujet et al.43 beschrieben durchgeführt.

Die Transkriptomanalyse für jede Erkrankung wurde unter Verwendung von 4 unabhängigen RNA-Präparaten durchgeführt. Bibliotheken wurden mit dem Kit Illumina Stranded Total RNA Prep Ligation with RiboZero Plus (Illumina, USA) erstellt. Der Ribodepletionsschritt wurde unter Verwendung spezifischer Sonden durchgeführt, die speziell für ribosomale Zielsequenzen von C. difficile synthetisiert wurden (Ergänzungstabelle 1). Nach der Ribodepletion wurden die Bibliotheken gemäß den Empfehlungen des Lieferanten vorbereitet. Die RNA-Sequenzierung wurde auf der Illumina NextSeq 2000-Plattform mit 67 Basen für ein Ziel von 10 M Reads pro Probe durchgeführt.

In diesen Tests wurde nur frisch gereinigtes CD1687 aus E. coli verwendet. CD1687 (von 0,5 µM bis 16 µM) wurde mit DNA (pUC9 oder PCR-Produkt) in 10 µl Natriumphosphatpuffer (50 mM; pH = 8,0) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben wurden geladen und 90 Minuten lang bei 100 V auf TAE-gepufferten Agarosegelen (1 % w/v) migriert. Die Kontrollen wurden vor dem Test 15 Minuten lang mit CD1687 durchgeführt, das bei 100 °C denaturiert wurde. Die Gele wurden mit Ethidiumbromid gefärbt und Bilder wurden mit einem Amersham ImageQuant 800 (Cytiva) aufgenommen. Das pUC9-Plasmid wurde aus E. coli-Stamm unter Verwendung des Nucleospin-Plasmid-Kits (Macherey-Nagel, Deutschland) hergestellt und das verwendete PCR-Amplikon wurde unter Verwendung von C. difficile 630Δerm als DNA-Matrize und Primern, die auf die Region von CD1438 abzielen, generiert (Ergänzungstabelle 1). . gDNA wurde mit dem DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Niederlande) aus der Zellkultur extrahiert.

Ein 5'RACE wurde unter Verwendung des 5'RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, Kit Version 2.0 (Invitrogen, USA) durchgeführt. Kurz gesagt, cDNA wurde durch reverse Transkription aus dem Gesamt-RNA-Extrakt und anschließendem Abbau der RNA erzeugt. Dann wurde mit der cDNA ein dC-Tailing durchgeführt und die resultierende dC-tailed DNA wurde als Matrize in der PCR verwendet, wie in den Kit-Anweisungen beschrieben. Die PCR-Produkte wurden mittels Agarosegelelektrophorese (1 % Agarose in TAE-Puffer) analysiert. Um die Transkriptionsstartstellen zu identifizieren, wurden PCR-Produkte wie vom Hersteller (Promega, USA) beschrieben in das pGEM-T-Easy-Vektor-Kit eingefügt. Anschließend wurden die Inserts PCR-amplifiziert und die resultierenden PCR-Produkte sequenziert.

Für die Mikroskopie wurden 48-Stunden-Biofilme in Platten mit 96 Vertiefungen (schwarz, Greiner) wie oben beschrieben erzeugt, gewaschen und dann 50 μl der in PBS verdünnten polyklonalen Anti-CD1687-Antikörper (400 ng/ml) in jede Vertiefung gegeben und inkubiert über Nacht bei 4 °C. Die Vertiefungen wurden zweimal sorgfältig mit PBS gewaschen, gefolgt von der Zugabe einer Lösung, die DAPI (1/1000 Verdünnung) und sekundäre Antikörper (Ziegen-Anti-Kaninchen konjugiert mit Texas Red; 1/5000 Verdünnung; Invitrogen, Katze: T-2767) enthielt PBS. Die Platten wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Vertiefungen sorgfältig mit PBS gewaschen und 200 μl frisches PBS zur Datenerfassung hinzugefügt. Die Bilder wurden mit dem Umkehrmikroskop Nikon Eclipse Ti (Nikon, Japan) aufgenommen.

Ein 433 bp großes Amplikon, das an einem Ende mit einem C6-Amin modifiziert war und der Region des CD1438-Gens entsprach, wurde verwendet, um eine DNA-BIND Surface 96-Well-Platte (Corning, USA) gemäß den Richtlinien des Herstellers kovalent zu beschichten. Kurz gesagt, 100 µL einer 250 nM Lösung von Amplikon, hergestellt im Bindungspuffer (50 mM Natriumphosphatpuffer pH = 8,5; 1 mM EDTA), wurden in die Vertiefungen gegeben und die Platte wurde über Nacht bei 4 °C inkubiert. Kontrollvertiefungen wurden nur unter Verwendung des Bindungspuffers hergestellt. Anschließend wurden die Vertiefungen dreimal mit 200 µL PBS gewaschen und die Platte in die anaerobe Kammer gestellt. In BHISG und geeigneten Antibiotika mit oder ohne ATc-Induktor gezüchtete Exponentialphasenkulturen des Stammes Δ1687pDIA6920 (Ergänzungstabelle 1) wurden auf eine OD (600 nm) von 0,5 verdünnt und 200 µl dieser Bakteriensuspensionen in die DNA-Vertiefungen gegeben -beschichtete Platte. Die Platte wurde 20 Minuten lang anaerob bei 37 °C inkubiert und dann zweimal mit BHISG gewaschen, bevor 200 µL BHISG mit 25 µg DNAse I in jede Vertiefung gegeben wurden. Die Platte wurde 20 Minuten lang anaerob bei 37 °C inkubiert und die Bakterien wurden aus der Suspension auf BHI-Agarplatten gezählt. Die PCR-Amplifikation zum Erhalt des modifizierten Amplikons wurde mit chromosomaler DNA des C. difficile 630Δerm mit Primern durchgeführt, die auf die Region von CD1438 abzielten (Ergänzungstabelle 1).

Die Biofilmtests, der Bakterien-DNA-Bindungstest und die RT-qPCR wurden mithilfe eines Einweg-ANOVA-Tests analysiert, gefolgt von einem Tukey-Mehrfachvergleichstest oder einem Dunnett-Mehrfachvergleichstest.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten RNA-Seq-Daten sind im NCBI-GEO unter der Zugangsnummer GSE218475 verfügbar. Die Massenspektrometrie-Proteomikdaten wurden über das PRIDE-Partner-Repository mit der Datensatzkennung PXD038282 beim ProteomeXchange-Konsortium hinterlegt.

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Diese Arbeit wurde vom Institut Pasteur, der „Integrative Biologie neu auftretender Infektionskrankheiten“ (LabEx IBEID) im Rahmen des „Programme Investissements d'Avenir“ der französischen Regierung und der ANR DifBioRel AAPCE5 finanziert. EA ist Doktorand der Université Paris-Cité. LH ist Doktorand der Sorbonne Université.

Institut Pasteur, Universität Paris-Cité, UMR-CNRS 6047, Labor für Pathogenese anaerober Bakterien, F-75015, Paris, Frankreich

Emile Auria und Bruno Dupuy

Institut Pasteur, Universität Paris-Cité, INSERM UMR1222, Abteilung für Antikörper in Therapie und Pathologie, Paris, Frankreich

Lise Hunault

Universität Sorbonne, INSERM, CNRS, Zentrum für Immunologie und Infektionskrankheiten (CIMI-Paris), F-75013, Paris, Frankreich

Lise Hunault

Plattform für molekulare Biophysik, Institut Pasteur, CNRS UMR3528, Paris, Frankreich

Patrick England

Biomics Technology Platform, Institut Pasteur, Paris, Frankreich

Marc Monot & Juliana Pipoli Da Fonseca

Proteomische Plattform, Institut Pasteur, Paris, Frankreich

Mariette Matondo & Magalie Duchateau

Abteilung für Biochemie, Mikrobiologie und Immunologie, University of Saskatchewan, Saskatoon, SK, Kanada

Yannick DN Tremblay

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EA und BD entwarfen die Studie und Experimente; EA, LH, PE, JPF, MD und BD führten Experimente durch; M.Monot und M.Matondo leisteten Unterstützung bei den transkriptomischen bzw. proteomischen Analysen; EA und BD haben das Manuskript entworfen und bearbeitet; PE, M.Monot, MD, M.Matondo und YDT halfen beim Schreiben und Bearbeiten; Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Bruno Dupuy.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Auria, E., Hunault, L., England, P. et al. Das Zellwand-Lipoprotein CD1687 fungiert als DNA-bindendes Protein während der Desoxycholat-induzierten Biofilmbildung in Clostridioides difficile. npj Biofilms Microbiomes 9, 24 (2023). https://doi.org/10.1038/s41522-023-00393-5

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Eingegangen: 06. Dezember 2022

Angenommen: 27. April 2023

Veröffentlicht: 11. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41522-023-00393-5

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