Der Mangel an Poly - Coastwise Ventures Group Co., Ltd

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 2800 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Acinetobacter baumannii ist ein nosokomialer Krankheitserreger, der durch eine schnelle Modulation seiner antimedikamentösen Mechanismen gegen Antibiotika resistent werden kann. Der multiresistente A. baumannii gilt als einer der bedrohlichsten Krankheitserreger unserer Gesellschaft. Die Bildung von Biofilmen und persistierende Zellen innerhalb der Biofilmmatrix gelten als hartnäckige Probleme, insbesondere bei im Krankenhaus erworbenen Infektionen. Poly-β-1,6-N-acetyl-glucosamin (PNAG) ist einer der wichtigen Bausteine im Biofilm von A. baumannii. Hier entdecken wir eine Proteinphosphorylregulation der PNAG-Deacetylase AbPgaB1, in der der Rest Ser411 phosphoryliert wurde. Die Phosphorylregulierung auf AbPgaB1 moduliert die Produktumsatzrate, mit der deacetyliertes PNAG produziert wird, und spiegelt sich in der Biofilmproduktion wider. Wir haben außerdem herausgefunden, dass der PgaB-defiziente A. baumannii-Stamm die geringste Biofilmproduktion aufweist, aber eine hohe minimale Hemmkonzentration gegenüber den Antibiotika Colistin und Tetracyclin aufweist. Basierend auf bakteriziden Post-Antibiotika-Wirkungen und zeitabhängigen Abtötungstests mit antibakteriellen Arzneimitteln behaupten wir, dass sich das PgaB-defiziente A. baumannii in Colistin-tolerante Zellen umwandelt. Diese Studie nutzt ein biofilmunabhängiges Colistin-tolerantes Modell von A. baumannii, um dessen Eigenschaften und Mechanismen weiter zu untersuchen und die klinischen Ergebnisse besser zu verstehen.

In den letzten Jahrzehnten haben zunehmende Antibiotikaresistenzen zu einem erhöhten Risiko für nosokomiale pathogene Infektionen geführt. Carbapenem-resistenter Acinetobacter baumannii ist eine häufige Ursache oft lebensbedrohlicher opportunistischer Infektionen bei kritisch kranken Patienten. Die Expression von Carbapenemase ist der wichtigste Mechanismus zur Verleihung einer Carbapenem-Resistenz bei arzneimittelresistenten Krankheitserregern1,2. Hinweise wie der Verlust des Außenmembran-Porins3,4, die unterschiedliche Expression des Penicillin-bindenden Proteins5 und die Überproduktion von Effluxsystemen6 wurden ebenfalls als mit der Carbapenem-Resistenz bei A. baumannii in Zusammenhang gebracht. Die Bildung von Biofilmen ermöglicht es A. baumannii, sich in verschiedenen Umgebungen anzusiedeln, und ist normalerweise mit Virulenz verbunden7,8. Der erste Schritt zur Einleitung der Biofilmbildung besteht darin, dass Planktonzellen sich an biotische oder abiotische Oberflächen anheften müssen. Durch Zell-Zell-Adhäsions- und Zellproliferationsverfahren reifen Biofilmstrukturen heran und nehmen einen planktonischen Lebensstil wieder auf, wenn sie sich in neue Umgebungen ausbreiten. Mehrere Faktoren, die mit der Biofilmbildung in A. baumannii in Zusammenhang stehen, wurden identifiziert, darunter das CsuA/BABCDE-Pili-Usher-Chaperon-Assemblierungssystem9,10, das BfmS/BfmR-Zweikomponentensystem11, das Außenmembranprotein OmpA12,13 und das Biofilm-assoziierte Protein14,15 , Autoinduktionssynthase AbaI16 und der Proteinkomplex PgaABCD, der für die Synthese von Poly-Beta-1–6-N-Acetylglucosamin (PNAG) erforderlich ist17.

Teilweise deacetyliertes PNAG (dPNAG) gilt als erforderliches Exopolysaccharid zur Strukturierung von Biofilmen bei mehreren menschlichen Krankheitserregern wie A. baumannii17, Aggregatibacter spp.18, Bordetella pertussis19,20, Klebsiella pneumonia21, Staphylococcus aureus22 und S. epidermidis23. Das Exopolysaccharid dPNAG wird über das PgaABCD-System in A. baumannii polymerisiert und transloziert17. Das homologe System in E. coli zeigt, dass PgaC und PgaD für die PNAG-Polymerisation erforderlich sind24. Das polymerisierte PNAG wird durch PgaB teilweise deacetyliert und anschließend durch PgaA24 heraustransloziert. Die Biofilm-Nachweisergebnisse der E. coli-Knockout-Stämme zeigten, dass PgaA und PgaB für die PNAG-Translokation notwendig sind, während der PgaC-Deletionsstamm nicht nachweisbares polymerisiertes PNAG besaß17,24. Der PNAG-Transporter PgaA besaß mehrere negativ geladene Reste in seiner β-Barrel-Sekretionspore für die anfängliche Bindung an dPNAG25. Die ortsspezifische Mutation und der Biofilmnachweis ergaben, dass die negativ geladenen Reste in der PgaA-Sekretionspore dazu führen, dass sie bevorzugt mit positiv geladenem dPNAG25 interagieren. Daher wurde nicht davon ausgegangen, dass vollständig acetyliertes PNAG exportiert wird, um als biofilmunterstützendes Exopolysaccharid zu dienen25.

Die PNAG-N-Deacetylase PgaB spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des Acetylspiegels von PNAG und dient als Brücke für die dPNAG-Translokation durch PgaA26. Die N- und C-terminalen Domänen von PgaB sind beide erforderlich, um die PNAG-De-N-Acetylierung durchzuführen26. Die katalytische Region der De-N-Acetylierung befindet sich in der N-terminalen Domäne von PgaB, während die C-terminale Domäne eine Glykosylhydrolyseaktivität besitzt und für die PNAG-Exportierung von entscheidender Bedeutung ist20,26. Basierend auf der Kristallstrukturanalyse von EcPgaB wurde behauptet, dass eine spezifische β-Haarnadelschleife (Reste 610–623) für den Export mit PNAG/dPNAG interagiert26. PgaB zeigte eine kobalt- und nickelabhängige Aktivität zur teilweisen Deacetylierung von β-1,6-Glucosamin, nicht jedoch des β-1,4-Glucosamin-Oligomers27. Die spezifische De-N-Acetylierungsposition am Glucosaminpentasaccharid erfolgte am 2. oder 3. Monosaccharid vom nichtreduzierenden Terminus27. Obwohl die De-N-Acetylierungspositionen unter Verwendung von vollständig acetyliertem β-1,6-Glucosaminpentasaccharid in Verbindung mit der Behandlung mit Exoglycosidase SpHex27 bestimmt wurden, zeigte das aus Bakterien isolierte natürliche Exopolysaccharid PNAG immer noch eine große Längenvielfalt und seine deacetylierten Positionen.

Die Glycosylhydrolaseaktivität von Bordetella bronchiseptica PgaB (BbPgaB) entdeckt einen neuen Modulationsmechanismus in der PNAG-Produktion und demonstriert die Glycosidverdauung von deacetyliertem PNAG20. Die C-terminale Domäne von BbPgaB wurde in die Glycosidhydrolase-Familie 153 (GH153) eingeteilt und ist ortholog zu E. coli PgaB20. Die Deacetylierungsaktivität von PgaB erfordert sowohl N- als auch C-terminale Domänen, während die verkürzten C-terminalen Domänen von BbPgaB und EcPgaB dPNAG20 hydrolysieren können. Das für die Spaltung erforderliche Motiv des dPNAG-Polymers wurde als GlcN-GlcNAc-GlcNAc identifiziert, was zeigte, dass vollständig acetyliertes PNAG nicht als Substrat für die C-terminale Domäne von BbPgaB20 erkannt wurde.

Biofilmmatrizen gelten als physikalische Schutzmittel für Bakterien und führen zu einer höheren Antibiotikatoleranz. Proteom- und Mutagenesestudien zeigten, dass OmpA, Omp33, CarO, OprD-ähnliches Protein, mutmaßliches DcaP-ähnliches Protein und Histidin-Metabolismus für die Biofilmbildung essentiell sind21. Es gibt jedoch weniger Informationen über die Untersuchung der Arzneimittelresistenz bei A. baumannii, die einen Zusammenhang mit der PNAG-vermittelten Biofilmbildung herstellt. Frühere Vergleiche im Transkriptom klinischer A. baumannii-Stämme ergaben, dass das Transkriptionsniveau von PgaB (A1S_0938) in einem Colistin-resistenten Stamm signifikant höher war als in einem Colistin-empfindlichen Stamm28. Posttranslationale Proteinmodifikationen sind reversible Regulationen, die Proteinfunktionen als Reaktion auf verschiedene physiologische Reaktionen modulieren. Unsere vorherige Studie ergab, dass PgaB aus dem klinischen A. baumannii-Stamm SK17 phosphoryliert war29. Diese Studie bestätigte die Phosphoregulation der PgaB-vermittelten Biofilmproduktion in A. baumannii ATCC15151. Gemäß dem ortsspezifischen Mutations- und N-Deacetylierungsaktivitätstest zeigte die Phosphomodifikation am Rest Ser411 von PgaB eine deutlich höhere Umsatzrate, die zu einer höheren Produktion von dPNAG führte, das als Baustein für Biofilm dient. Wir stellten fest, dass das Ausmaß der PNAG-vermittelten Biofilmproduktion negativ mit der Colistinresistenz bei A. baumannii korreliert. Der PgaB-Deletionsstamm produzierte die geringste Menge an Biofilm, besaß jedoch eine deutlich höhere Colistin-Resistenz. Wir nehmen an, dass der PgaB-defiziente A. baumannii-Stamm PNAG am Periplasma ansammelt, was die Fähigkeit von Colistin beeinträchtigen könnte, auf die Zytoplasmamembran von A. baumannii abzuzielen.

In Pga-Operons besitzt N-Acetylglucosamin-Deacetylase PgaB die Fähigkeit, den Grad der Acetylierung von PNAG zu regulieren, was die Bindungsaffinität von PNAG an die PgaA-β-Barrel-Lumenstruktur direkt moduliert25. Teilweise deacetyliertes PNAG (dPNAG) wurde dann als extrazelluläres Polysaccharid über PgaA transportiert (Abb. 1a). Die TPR-Domäne von PgaA in E. coli war an der Protein-Protein-Wechselwirkung mit PgaB beteiligt, die für den Export von teilweise deacetyliertem PNAG entscheidend ist30. Basierend auf diesen Informationen stellten wir die Hypothese auf, dass die Biofilmbildung in A. baumannii durch N-Deacetylase PgaB reguliert werden könnte. Unter allen sequenzierten A. baumannii-Stämmen gibt es zwei Pga-Operons, A1S0938 bis A1S0940 und A1S2162 bis A1S2159 (Abb. 1a). Beide Kopien der N-Acetylglucosamin-Deacetylase (A1S0938 und A1S2161) wurden als PgaB annotiert und innerhalb der derzeit definierten Carbohydrate-Active Enzyme-Datenbank (CAZy) in die Kohlenhydratesterase-Familie (CE4-Familie) eingeteilt. Die kodierenden Proteine der Gene A1S0938 und A1S2161 wurden in dieser Studie als AbPgaB1 bzw. AbPgaB2 definiert. PgaB ist ein in der Außenmembran verankertes Protein, in dem die Reste S12 bis N194 von AbPgaB1 und H35 bis W70 von AbPgaB2 von TMRPres2D31 vorhergesagte Transmembranregionen sind (Abb. S1). AbPgaB1 teilt 35,68 % bzw. 41,64 % Sequenzidentitäten mit EcPgaB bzw. BbPgaB. Laut phylogenetischer Analyse steht AbPgaB1 (A1S0938) in der Nähe von B. bronchiseptica, das möglicherweise eine Glykosidhydrolyseaktivität an der C-terminalen Domäne aufweist (Abb. 1b). Obwohl AbPgaB1 und AbPgaB2 eine geringe Sequenzidentität aufweisen (32 %), sind sie immer noch in PgaB von Escherichia coli, Klebsiella pneumonia, B. bronchiseptica, B. pertussis und IcaB von Staphylococcus geclustert, nicht jedoch in der Polysaccharid-Deacetylase von Pseudomonas. (Abb. 1b).

Schematische Darstellung zweier PNAG-Syntheseoperons in A. baumannii. (a) Die kodierenden Gene A1S-0938 bis A1S-0940 und A1S-2162 bis A1S-2159 wurden als PNAG-Syntheseoperons in A. baumannii annotiert. Die Proteinkomplexe PgaC (braun) und PgaD (orange) befanden sich auf der Zytoplasmamembran und polymerisierten N-Acetylglucosamin. PgaB ist eine PNAG-Deacetylase, die an der Außenmembran verankert und im Periplasma lokalisiert ist. Das äußere Membrantransportprotein PgaA trug als Exopolysaccharid zum Transport von teilweise deacetyliertem PNAG bei. (b) Phylogenetische Analyse von Polysaccharid-Deacetylasen in der CE4-Familie der CAZy-Datenbank aus Bakterien basierend auf der Neighbor Joining Clustering-Methode.

Es wird angenommen, dass PgaB das Verhältnis der Acetylgruppe zu PNAG moduliert. Allerdings ist die Regulation von PgaB zur Produktion von differenziellem acetyliertem PNAG als Biofilmmatrix noch unklar. Für die Exopolysaccharidanalyse wurden Stämme von A. baumannii mit Einzelgen-Deletion (ΔAbpgaB1) und Doppelgen-Deletion (ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) konstruiert. Exopolysaccharide auf Acetylebene (einschließlich PNAG), extrahiert aus A. baumannii ATCC 15151 (Ab15151) und seinen abgeleiteten Mutantenstämmen, wurden auf der Grundlage einer Protonen-NMR-Analyse bestimmt (Abb. S2). Das Signal von acetyliertem PNAG wurde relativ quantifiziert, basierend auf der integralen Peakfläche bei 2,0 ppm in Protonen-NMR-Profilen (Abb. S2). Der Acetylierungsgrad der extrahierten Polysaccharide war gegenüber ΔAbpgaB1 leicht erhöht und wurde bei der doppelten Deletion weiter erhöht. Das extrahierte Exopolysaccharid aus dem pgaB-Doppeldeletionsstamm stellte Signale auf höherem Acetylniveau dar als Ab15151, was zeigte, dass die N-Deacetylaseaktivität von AbPgaB1 und AbPgaB2 das Acetylierungsniveau von PNAG in Ab15151 modulieren konnte.

Wir führten sowohl proteomische als auch phosphoproteomische Analysen durch, um die unterschiedlich exprimierten Proteine zwischen planktonischen und biofilmischen Lebensstilen von A. baumannii zu untersuchen. Mit einer Kombination proteomischer Daten konnten 1334 konstitutiv exprimierte Proteine sowohl aus dem Plankton- als auch dem Biofilm-Lebensstil von Ab15151 identifiziert werden (Abb. S3). Es gab 174 bzw. 226 einzigartige Proteine, die nur aus dem Plankton bzw. dem Biofilm von A. baumannii identifiziert wurden (Abb. S3). Unter diesen identifizierten Proteinen wurde AbPgaB1 (A1S0938) mittels Phosphoproteomanalyse unter Verwendung der in „Methoden“ beschriebenen Standardverfahren als zuverlässiges Phosphoprotein definiert. Das kodierende Gen von AbPgaB1 wurde konstruiert und zur Überexpression in Ab15151 transformiert und seine phosphorylierten Stellen (p-Stellen) wurden anhand von gereinigtem AbPgaB1 durch LC-MS/MS-Analyse bestätigt. Sieben eindeutige p-Stellen von vier phosphorylierten Peptiden (p-Peptiden) auf AbPgaB1 wurden identifiziert (Tabelle S1). Gemäß der Sekundärstrukturvorhersage des Proteins von AbPgaB1 durch Jpred432 befindet sich die p-Stelle H229 an der α-Helix 7 (α7) in der N-terminalen Domäne, während sich die p-Stellen T407, D408, S411 und D413 an Schleife 11 befinden in der C-terminalen Domäne (Abb. 2a). Es gab zwei weitere p-Stellen, Y482 und Y507, die sich bei α13 bzw. α14 in der C-terminalen Domäne befanden (Abb. 2a). Die Struktur von AbPgaB1 wurde von SWISS-MODEL basierend auf der E. coli-PgaB-Kristallstruktur als Vorlage (PDB: 4P7R)26 vorhergesagt. Den MS/MS-Daten zufolge wurden sieben p-Stellen auf AbPgaB1 auf den N- und C-Domänen markiert, denen jeweils PNAG-Deacetylaseaktivität und Glykosylhydrolyseaktivität zugeordnet wurden (Abb. 2b). Um die Regulation der Phosphorylmodifikation an AbPgaB1 herauszufinden, wurde das Tetrasaccharid von N-Acetylglucosamin (4-NAG) an die modellierte Struktur von AbPgaB1 angedockt (Abb. 2b). Die p-Stellen S411 und D413 lagen in der Nähe von 4-NAG in AbPgaB1, was zeigte, dass sie Kandidaten für die Untersuchung der Phosphorylregulation auf AbPgaB1 sein könnten. Die MS/MS-Spektren des p-Peptids „407TDPVSKDLVVTEQAK421“ in Schleife 11, das die p-Stellen T407, D408, S411 und D413 enthielt, sind in Abb. 2c dargestellt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Phosphorylregulation der C-terminalen Domäne von AbPgaB1, insbesondere der Reste S411 und D413, dessen Aktivität modulieren kann.

Die identifizierten phosphorylierten Stellen auf AbPgaB1 sind in der Sekundärstruktur und Tertiärstruktur markiert. (a) Die Sekundärstruktur von AbPgaB1 wurde von Jpred4 vorhergesagt. Alpha-Helix- und Beta-Faltblattstrukturen wurden in Lila bzw. Gelb markiert. Identifizierte p-Stellen wurden auf AbPgaB1-Sequenzen mit „p“ (rot) markiert. (b) Das Tetrasaccharid von PNAG, 4-NAG, das die Hauptkette in Stäbchen (grün) zeigte, wurde an die modellierte AbPgaB1-Struktur (Cartoon, vorhergesagt basierend auf der Vorlage PDB: 4P7R26 von SWISS-MODEL) angedockt, um die Position phosphorylierter Reste anzuzeigen (gelb) innerhalb der 3D-Struktur. Die modellierte Struktur wurde mit PyMOL bearbeitet. (c) MS/MS-Spektren des p-Peptids „407TDPVSKDLVVTEQAK421“ auf AbPgaB1. Jeder Peak zeigt das m/z der Fragmente nach der Tandem-Massenspektrometrie-Trennung und wird von MaxQuant verarbeitet. Die N-terminalen b-Ionen- und C-terminalen y-Ionen-Fragmente wurden blau bzw. rot hervorgehoben.

Gemäß der Modellstrukturanalyse stellten wir die Hypothese auf, dass die p-Stelle Ser411 für die Bindung und Freisetzung des dPNAG-Produkts von entscheidender Bedeutung ist. Der Rest Ser411 von AbPgaB1 wurde dann durch Ala oder Asp ersetzt, um nicht-phosphorylierte oder phosphorylierte Bedingungen nachzuahmen. Das AbPgaB1 und seine ortsdirekt mutierten Derivate wurden jeweils in den pABCLIIa-Expressionsvektor eingebaut, um C-terminale His-Tag-Fusionsproteine für die weitere Affinitätsreinigung zu erzeugen. Überexprimiertes AbPgaB1 und seine Derivate wurden für den Deacetylierungsaktivitätstest unter Verwendung von teilweise deacetyliertem PNAG als Substrat gereinigt. Kinetische Parameter der AbPgaB1-Deacetylaseaktivität zeigten, dass der Km-Wert um das 4,9-fache erhöht wurde, wenn Ser411 durch Asp ersetzt wurde (Tabelle 1). Andererseits wurde die maximale Geschwindigkeit von AbPgaB1 um das 8,4-fache erhöht, wenn Ser411 phosphoryliert wurde (Tabelle 1). Im Vergleich zu nicht phosphoryliertem S411A-mutiertem AbPgaB1 wies das phosphomimetische AbPgaB1 (S411D) eine deutlich höhere Umsatzzahl auf, was auf eine stärkere Produktion von deacetyliertem PNAG schließen lässt.

Um die Phosphoryl-vermittelte Regulation von AbPgaB1 herauszufinden, wurde die Modellstruktur der C-terminalen Domäne von AbPgaB1 (Reste 308–659, AbPgaB1308–659) auf der Grundlage der in das GlcNAc-Tetrasaccharid eingebauten EcPgaB (PDB: 4P7R)26-Kristallstruktur als Vorlage erstellt . Die Modellstruktur AbPgaB1308–659 wurde mit EcPgaB (PDB: 4P7R) und B. bronchiseptica PgaB (BbPgaB, PDB: 6AU1)20 abgeglichen, die hochkonservierte GlcNAc-Tetrasaccharid-wechselwirkende Reste aufwiesen (Abb. S4a, b). Gemäß der Kristallstrukturanalyse von EcPgaB bildet der Rest W552 eine enge Stapelwechselwirkung mit dem Pyranoidring und D472 Wasserstoffbrückenbindungen zu OH-3 und OH-4 von GlcNAc. Räumliche Umlagerungen der Reste W549 und D470 von AbPgaB1 und der Reste W561 und D480 von BbPgaB wurden in hohem Maße zu den Resten W552 und D472 in EcPgaB konserviert, was auf die Beteiligung dieser Reste an der GlcNAc-Tetrasaccharidbindung schließen lässt (Abb. S4a). Darüber hinaus war Rest D473 von AbPgaB1308–659 identisch mit Rest D475 in EcPgaB (PDB: 4F9J), von dem angenommen wurde, dass er zweizähnige Wasserstoffbrückenbindungen zum GlcNAc-Tetrasaccharid bildet27. Daher wurden benachbarte Reste wie W549, D470 und D473 in AbPgaB1308–659 als aktive Stellen definiert, die ein flexibles Andocken des GlcNAc-Tetrasaccharidliganden ermöglichen. Unter den verschiedenen Rotameren, die sich aus dieser Wechselwirkung ergeben, wurde dasjenige mit der niedrigsten Energie als GlcNAc-Tetrasaccharid ausgewählt, das in die modellierte Struktur von AbPgaB1308–659 eingebaut wurde (Abb. S4c).

Das reduzierende Ende des GlcNAc-Tetrasaccharids in der Modellierungsstruktur AbPgaB1308–659 wurde als + 1-Untereinheit definiert (Abb. S4c). In AbPgaB1308–659 ist der Rest W549 an der Stapelwechselwirkung mit dem Pyranoidring und seiner Wasserstoffbindung in der Hauptkette an die N-Acetyleinheit von + 2 GlcNAc beteiligt. Der Sauerstoff der Hauptkette am Rest Y430 bildete eine Wasserstoffbindungs-N-Acetyleinheit der + 1-Untereinheit von GlcNAc (Abb. S4c). AbPgaB1308–659 war durch ein Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerk, einschließlich der Seitenkette der Reste D413, R432, E472, S469, T467 und der Hauptkette von Y430, stark an + 1 GlcNAc koordiniert. Die einzelne CH-π-Wechselwirkung zwischen Rest E472 und + 1 GlcNAc trug ebenfalls zur Ligandenbindung bei (Abb. S4c). Die konservierte R432-E472-Salzbrücke (Abb. S4b) kann zur + 1 GlcNAc-Unterbringung beitragen und diese Schleifen bei der PNAG-Bindung stabilisieren (Abb. S4b, c). Daher würde das phosphorylierte Mimetikum Ser411 (S411D), das sich in der Nähe von R432 befindet, die bereits vorhandene R432-E472-Salzbrücke aufbrechen und eine teilweise Entfaltung der Schleifen auslösen27 (Salzbrücken-Konkurrenzmodell)33 (Abb. S4d, e). Dieses Ereignis würde sich wahrscheinlich auf das Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerk auswirken und eine +1 GlcNAc-Unterbringung ermöglichen. Darüber hinaus würde die Bulk-Phosphorylgruppe von S411D in AbPgaB308–659 im Vergleich zum modellierten Wildtyp-Komplex dazu führen, dass die räumliche Abstoßung von PNAG dessen Bindung behindert (Abb. S4d, e).

Um die Auswirkungen der phosphovermittelten Regulierung auf AbPgaB1 bei der Biofilmbildung zu untersuchen, wurden Ab15151 und seine abgeleiteten Mutantenstämme mit einem Rasterelektronenmikroskop (REM) beobachtet. Biofilme von Wildtyp-Ab15151 zeigten eine aggregierte Struktur und zellgebundenes Exopolysaccharid (Abb. 3a). Der AbPgaB1-Deletionsstamm (ΔAbpgaB1) zeigte aggregierte Zellen in der Biofilmmatrix ohne beobachtbares Exopolysaccharid (Abb. 3a). Dieses zellgebundene Exopolysaccharid wurde produziert, als AbpgaB1 komplementiert wurde. Darüber hinaus stellten wir fest, dass das komplementierte Phospho-Mimetikum AbPgaB1 (Δ + S411D) sowohl Zellaggregation als auch zellgebundenes Exopolysaccharid in der Biofilmstruktur zeigte. Im Gegensatz dazu wurde bei dem Stamm, der mit dem nicht-phosphomimetischen AbPgaB1 (Δ + S411A) komplementiert war, kein zellgebundenes Exopolysaccharid beobachtet (Abb. 3a). Das Ausmaß der Biofilmproduktion von Ab15151 und seinen abgeleiteten Mutantenstämmen wurde durch Kristallviolettfärbung quantifiziert. Alle quantifizierten Werte wurden basierend auf den Biofilmmengen von Ab15151 normalisiert. A. baumannii produziert weniger Biofilm (58 %), wenn sein AbpgaB1 ausgeschaltet wurde (Abb. 3b). Die Biofilmproduktion wurde auf 83 % von Ab15151 wiederhergestellt, wenn Wildtyp-AbpgaB1 mit dem AbpgaB1-Deletionsstamm ergänzt wurde (Abb. 3b). Es ist bemerkenswert, dass die relativen Biofilmmengen von Stämmen, die mit nicht phosphoryliertem AbPgaB1 (Δ + S411A) und phosphoryliertem AbPgaB1 (Δ + S411D) ergänzt wurden, 61 % bzw. 101 % betrugen (Abb. 3b). Es zeigte sich, dass der Grad der PNAG-Deacetylierung durch eine Phosphoryl-vermittelte Modifikation am Rest Ser411 auf AbPgaB1 reguliert wurde, was die Biofilmproduktion in A. baumannii widerspiegelte.

Beobachtung und Quantifizierung der Biofilmproduktion in A. baumannii ATCC15151 und den AbpgaB1-vermittelten Mutantenstämmen. (a) Beobachtung der Biofilmbildung in Ab15151 und seinen Derivaten mittels SEM. Das obere Feld zeigte die Ansicht mit 7.500-facher Vergrößerung und das untere Feld zeigte die Ansicht mit 10.000-facher Vergrößerung. Der Balken zeigte eine Skala von 1 µm an. (b) Biofilm wurde durch Kristallviolettfärbung quantifiziert und die Absorption bei 595 nm bestimmt. Die OD595-Werte von Ab15151 wurden als 100 % definiert, um die relativen Biofilmmengen aus seinen abgeleiteten Mutantenstämmen zu berechnen. Jeder Datenpunkt wurde aus mindestens 6 Wiederholungen gemittelt. *Zeigt einen signifikanten Unterschied zu Ab15151 an, dessen p-Wert des t-Tests weniger als 0,001 betrug.

Die Fähigkeit zur Biofilmproduktion bei A. baumannii zeigte im Verhältnis zu seiner Toxizität und Arzneimittelresistenz einen positiven Trend. Die obigen Beweise zeigen, dass die Biofilmproduktion in A. baumannii durch die Phosphorylmodifikation eines Restes an AbPgaB1 reguliert wird. Wir stellten außerdem die Hypothese auf, dass die Antibiotikaresistenz in A. baumannii abnehmen sollte, wenn AbPgaB1 am Rest Ser411 dephosphoryliert wird. Da A. baumannii über zwei Kopien von pgaB im Genom verfügt, haben wir Stämme mit einfacher und doppelter pgaB-Deletion für weitere Antibiotika-Empfindlichkeitstests konstruiert. Gemäß der Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) basierend auf der Brühenverdünnungsmethode gibt es keinen signifikanten Unterschied in den MHK-Werten gegenüber Imipenem, Ciprofloxacin, Apramycin und Vancomycin zwischen den getesteten A. baumannii-Stämmen (Tabelle 2). Es zeigte die Unabhängigkeit der Biofilmbildung und die Toleranz gegenüber diesen vier Antibiotika. Wir stellten fest, dass die MHK-Werte von A. baumannii-Stämmen gegenüber Colistin und Tetracyclin signifikant erhöht waren (Colistin 2,0 bis 16,0 mg/L und Tetracyclin 0,5 bis 16,0 mg/L), wenn sowohl AbpgaB1 als auch AbpgaB2 deletiert wurden (Tabelle 2, ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2, ΔΔ). Diese Daten widerlegen unsere Hypothese, dass der PgaB-Doppeldeletionsstamm in dieser Studie unter den A. baumannii-Stämmen die geringsten Mengen an Biofilm produzierte, aber die höchste Toleranz gegenüber den Antibiotika Colistin und Tetracyclin aufwies (Tabelle 2, Abb. S5). Colistin, auch bekannt als Polymyxin E, könnte Lipopolysaccharid (LPS) in Bakterien angreifen, um deren Zellmembranintegrität zu zerstören und Bakterien abzutöten. Sie gilt als letztes Mittel zur Behandlung einer Infektion mit multiresistenten Erregern. Nach unserem besten Wissen gibt es keine Belege für den Zusammenhang zwischen PNAG-Deacetylase PgaB und der Struktur von LPS. Interessanterweise hängt die Toleranz von A. baumannii gegenüber Colistin mit seiner PNAG-N-Deacetylase PgaB zusammen. Und es gibt Hinweise darauf, dass Colistin LPS in der Zytoplasmamembran beeinflusst34. Daher stellten wir weiterhin die Hypothese auf, dass der PgaB-Stamm mit doppelter Deletion einen PNAG-Pump-out-defizienten Stamm aufweist, bei dem sich acetyliertes PNAG im Periplasma ansammelt, um die Störung durch Colistin-Behandlung zu verhindern. Wir benötigen jedoch noch weitere Beweise, um den detaillierten Mechanismus der Colistin-Toleranz herauszufinden, wenn beide PgaBs gelöscht wurden.

Tetracyclin ist eine Art Antibiotikum zur Bindung von 30S-Ribosomen und führt zur Hemmung der Proteinsynthese. PgaB-Stämme mit doppelter Deletion hatten höhere Tetracyclin-MHK-Werte (Tabelle 2). Apramycin ist ein weiteres in dieser Studie verwendetes Antibiotikum. Apramycin zielt auf die Proteinsynthese ab, um Bakterien zu hemmen. Die MHK gegenüber Apramycin zeigte keinen Unterschied zwischen allen getesteten A. baumannii-Stämmen in dieser Studie (Tabelle 2). Daher gingen wir davon aus, dass die Tetracyclintoleranz von PgaB-Doppeldeletionsstämmen auf deren mangelnde Fähigkeit, in Bakterienzellen einzudringen, zurückzuführen ist. Es sind jedoch weitere Studien erforderlich, um diese Hypothese zu bestätigen. Gemäß der MHK von AbpgaB1-komplementierten Ab-Stämmen zeigten entweder WT-, S411A- oder S411D-mutiertes AbPgaB1 im ΔAbpgaB1- oder ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2-Hintergrund eine ähnliche Anfälligkeit gegenüber Colistin und Tetracyclin (Tabelle 2, Abb. S6). Dies deutete darauf hin, dass in beiden PgaB-Deletionsstämmen eine Colistin- oder Tetracyclin-Toleranz auftrat und dass diese durch AbpgaB1-Komplementierung wiederhergestellt werden konnte (Tabelle 2).

Um die Antibiotikaverträglichkeit unter Biofilmbedingungen herauszufinden, wenn AbpgaB1 und/oder AbpgaB2 gelöscht werden, wurden die minimalen Biofilm-Eradikationskonzentrationen (MBEC) untersucht (Tabelle 3). Der MBEC aller getesteten Stämme ist höher als der MHK, was darauf hindeutet, dass die im Biofilm eingebetteten Bakterienzellen höhere Antibiotikabelastungen überwinden können. Es gibt keinen signifikanten Unterschied in der MBEC des Stamms ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2 und der anderen getesteten Stämme. Die MBEC-Daten zeigen, dass die Colistin- und Tetracyclintoleranz im Stamm ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2 nicht durch die Biofilmproduktion verursacht wurde. Um zu bestätigen, dass die Arzneimitteltoleranz, die beim PgaB-Doppeldeletionsstamm auftrat, wiederholbar war, wurde die MHK antibakterieller Arzneimittel in 4 Passagen bestimmt. Wir stellten fest, dass die MHK des Stammes ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2 gegenüber Colistin und Tetracyclin erhöht war, als es von der 1. Passage zur 4. Passage übertragen wurde (Abb. S6). Dieses Phänomen konnte in mindestens drei unabhängigen Tests wiederholt werden. Dies veranlasste uns, die Hypothese aufzustellen, dass sich PgaB-defizientes A. baumannii in antibiotikatolerante Zellen umwandeln kann, um die bakterizide Wirkung von Colistin zu überwinden. Die persistenten Zellen zeigen eine Population von Bakterien, die die Exposition gegenüber einem bakteriziden Antibiotikum überleben35. Antibiotika-persistente Bakterien führen nicht zu einem Anstieg der MHK, werden jedoch weniger schnell abgetötet als nicht-persistente Zellen35. Die erhöhte MHK des Stammes ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2 gegenüber Colistin und Tetracyclin während 4 Passagen deutete darauf hin, dass sie nicht durch die Mengen an persistenten Zellen verursacht wird. Hungerstress ist der größte selektive Druck während der 4-Passagen-Inkubation. Es zeigte sich, dass der Mangel an PgaB in A. baumannii zu einer Entwicklung zur Überwindung von Antibiotika-Stress führen kann.

In dieser Studie wurden postantibiotische Wirkungen (PAE) von Colistin auf A. baumannii durchgeführt, um die Antibiotikatoleranz zwischen WT- und Mutantenstämmen zu untersuchen. Die über Nacht kultivierten Ab-Stämme wurden zur Colistin-Verabreichung auf eine OD600 von 0,1 verdünnt. Nach einer Stunde Colistin-Behandlung mit der getesteten Konzentration wurden alle getesteten Ab-Stämme seriell verdünnt und auf LB-Agarplatten getupft (Abb. 4a). Wir stellten fest, dass Ab15151, ΔAbpgaB1 und ΔAbpgaB2 alle anfällig für Colistin in einer Konzentration von 16,0–64,0 µg/ml waren (Abb. 4a). Der PgaB-Stamm mit doppelter Deletion (ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) zeigte jedoch die höchste Toleranz, wenn er 1 Stunde lang mit 16,0, 32,0 oder 64,0 µg/ml Colistin behandelt wurde (Abb. 4a). Um Antibiotika-Persistenz von Toleranz zu unterscheiden, wurde der Stamm ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2 in Gegenwart von 16,0 µg/ml Colistin für eine 0 bis 4-stündige Behandlung langsamer abgetötet als andere Stämme (Abb. 4b). Die Anfälligkeit des PgaB-Doppeldeletionsstamms wurde wiederhergestellt, wenn er mit AbpgaB1 ergänzt wurde (Tabelle 2, Abb. 4a, b). Sowohl dosisabhängige als auch zeitabhängige PAE zeigten, dass der pgaB-Doppeldeletionsstamm eine hohe Colistintoleranz besitzt. Dies stützt unsere Hypothese, dass die persistierenden Zellen von PgaB-defizientem A. baumannii nach einer Colistin-Behandlung die Fähigkeit haben könnten, sich in Colistin-tolerante Zellen umzuwandeln. Dies zeigt, dass die Evolution beim Stamm ΔpgaB1ΔpgaB2 möglicherweise schneller erfolgt als bei den anderen getesteten A. baumannii-Stämmen in dieser Studie. Das Tetracyclin-PAE zeigte in allen getesteten Dosen und Zeiträumen ähnliche Profile bei den Ab-Stämmen. (Abb. 4c,d). Es zeigte sich, dass die anfänglich beladenen Bakterienzellen (~ 106 KBE/ml) durch die Behandlung mit dem bakteriostatischen Arzneimittel Tetracyclin in einer Konzentration von 4,0, 8,0 oder 16,0 µg/ml für 1 Stunde (Abb. 4c) oder nach 8,0 nicht abgetötet wurden µg/ml Tetracyclin-Verabreichung für 4 Stunden (Abb. 4d). Wir stellten fest, dass die Antibiotika-Persistenz im PgaB-Doppeldeletionsstamm bei Verabreichung des bakteriziden Arzneimittels Ciprofloxacin oder des bakteriostatischen Arzneimittels Apramycin nicht beobachtet wurde (Abb. S7). Dies bedeutet, dass der PgaB-defiziente A. baumannii spezifisch gegen die Antibiotika Colistin und Tetracyclin resistent ist.

Zeitabhängige postantibiotische Wirkungen von Colistin und Tetracyclin auf A. baumannii-Stämme in dieser Studie. Die Übernachtkulturen wurden auf eine OD600 von 0,1 für Colistin bzw. 0,01 für Tetracyclinverabreichung verdünnt. Nach einer einstündigen Behandlung mit Colistin (a) oder Tetracyclin (c) wurden die Kulturen zehnfach seriell verdünnt, um sie auf der LB-Agarplatte zu verteilen. Mit der Verabreichung von 32 µg/ml Colistin (b) oder 8 µg/ml Tetracyclin (d) innerhalb von 4 Stunden wurden alle getesteten Stämme zehnfach verdünnt und über Nacht inkubiert, um ihre Überlebensrate zu bewerten.

Die spezifischen Merkmale der Antibiotika-persistenten Zellen bestehen darin, dass die Replikationsrate in Gegenwart von Antibiotika geringer war als in nicht-persistenten Zellen35. Um die antibiotikatoleranten Zellen von heteroresistenten Zellen zu unterscheiden, wurden zeitabhängige Abtötungstests von A. baumannii-Stämmen unter Antibiotikagabe durchgeführt. Alle getesteten A. baumannii-Stämme zeigten ohne Antibiotika-Gabe eine ähnliche Wachstumskurve, was zeigte, dass die pgaB-Deletion und die Komplementstämme in dieser Studie keinen Einfluss auf die Replikation hatten (Abb. 5). Die Kulturen von Ab-Stämmen mit 16,0 µg/ml Tetracyclin zeigten bei allen getesteten Stämmen ein stagnierendes Wachstum (Abb. 5). Die Wachstumskurven aller getesteten Ab-Stämme, denen 16,0 µg/ml Colistin verabreicht wurden, stagnierten ebenfalls, mit Ausnahme des PgaB-defizienten Stamms (ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) (Abb. 5). Die Replikation des Stammes ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2 wurde auch bei der Behandlung mit Colistin gehemmt, das Wachstum erholte sich jedoch nach einer gewissen Verzögerungszeit (Abb. 5). Wir gehen davon aus, dass sich die überlebenden Zellen im PgaB-defizienten Hintergrund in Colistin-tolerante Zellen umwandeln und während der Inkubation über Nacht heranwachsen können.

Zeitabhängige Abtötungstests von WT- und PgaB-vermittelten A. baumannii-Mutantenstämmen zeigten deren Colistin-Toleranz. In dieser Studie wurden die Übernachtkulturen von A. baumannii-Stämmen zur Bestimmung der Wachstumskurve auf OD600 0,05 verdünnt. Das Antibiotikum Colistin (rot) und Tetracyclin (blau) wurden mit der Endkonzentration von 16,0 µg/ml nach 2-stündiger Inkubation verabreicht. Während der 27-stündigen Inkubation wurde die optische Dichte jeder Kultur bei 600 nm mit einem Mikroplatten-Lesegerät bestimmt. Die schwarz gezeichnete Wachstumskurve stellte den Zustand ohne Antibiotikagabe als Kontrolle dar.

Die Konstruktion von pgaB-Mutantenstämmen in dieser Studie basierte auf ihrer homologen Rekombinationsregion, um AbpgaB1 oder AbpgaB2 im Ab15151-Genom auszuschalten. Um die polaren Mutationseffekte auf die nachgeschaltete pgaC- und pgaD-Expression auszuschließen, wurden die pgaBCD (A1S0938 ~ A1S0940) in den Expressionsvektor pABCLIIb konstruiert und dann in pgaB-deletiertes Ab15151 (ΔAbpgaB1 oder ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) als AbpgaB1-Komplementstämme (+ WT, + S411A) transformiert , oder + S411D). Die Tests zur Biofilmbildung zeigten, dass der AbpgaB1-Komplementstamm (Δ + WT) die Biofilmproduktion wiederherstellen kann (Abb. 3b). Die MHK-Bestimmung zeigte auch, dass die AbpgaB1-Komplementstämme (einschließlich S411A- oder S411D-mutiertes AbpgaB1) die Empfindlichkeit gegenüber Colistin und Tetracyclin im ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2-Hintergrund wiederherstellen könnten (Abb. S4). Nach unseren bisherigen Erfahrungen wird das durch IPTG bei der MHK-Bestimmung der Brühenverdünnung induzierte komplementäre Protein möglicherweise nicht konstitutiv exprimiert36. Wir bestätigten auch die PgaB1-Expression in MIC-Assays mit Brühenverdünnung, indem wir Western zum Nachweis von His-Tag-Fusionssignalen auf komplementiertem AbPgaB1 verwendeten (Abb. S8). Das ergänzte AbPgaB1 könnte die Biofilmproduktion im ΔAbpgaB1-Hintergrund wiederherstellen und die Anfälligkeit für Colistin und Tetracyclin im ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2-Hintergrund wiederherstellen. Unsere Daten belegen, dass es in unseren konstruierten Ab-Stämmen keine polaren Mutationseffekte gab.

In dieser Studie verwenden wir Ninhydrin, um das freie Amin zu quantifizieren, das freigesetzt wurde, als PNAG durch AbPgaB1 deacetyliert wurde. Das Substrat von AbPgaB1 ist PNAG, das aus dem klinischen Stamm SK17 von A. baumannii isoliert wurde. Da beide PGA-Operons in allen sequenzierten A. baumannii-Stämmen vorkommen, sollte PNAG eine der Komponenten in ihren Exopolysacchariden sein. Die spezifische De-N-Acetylierungsposition wurde durch die Verwendung des vollständig acetylierten Pentasaccharids PNAG als Substrat aufgedeckt27,37. Das aus Bakterien isolierte native PNAG zeigte immer noch eine große Vielfalt an Acetylierungsniveaus, deacetylierten Positionen und Molekulargewichten. Um die Phosphorylregulation am Rest Ser411 in AbPgaB1 herauszufinden, wurden die kinetischen Parameter zwischen AbPgaB1 und seinen ortsspezifischen mutierten Derivaten mithilfe von Ninhydrin-Assays mit nativ extrahiertem PNAG als Substrat bestimmt. Wir haben für alle Ninhydrin-Aktivitätstests in dieser Studie eine Charge nativ extrahierten PNAG geerntet, um die Variation zwischen verschiedenen Chargen nativ extrahierten PNAG zu begrenzen. Da das extrahierte PNAG bereits teilweise deacetyliert ist, lässt sich die spezifische Aktivität von AbPgaB1 in dieser Studie möglicherweise nicht mit anderen veröffentlichten Daten zum gleichen Ausgangswert vergleichen. Es ist jedoch angebracht, die kinetischen Parameter zwischen AbPgaB1 und seiner Mutante in dieser Studie zu vergleichen, indem aus derselben Charge isoliertes PNAG verwendet wird. Basierend auf Aktivitätstests von AbPgaB1 und der ortsspezifischen Mutante S411A oder S411D kommen wir zu dem Schluss, dass phosphoryliertes AbPgaB1 (S411D) eine höhere Produkt-dPNAG-Umsatzzahl aufweist als WT und nichtphosphoryliertes AbPgaB1 (S411A) (Tabelle 1). Es zeigt sich, dass AbPgaB1_S411D eine höhere Wirksamkeit bei der Deacetylierung von PNAG für das PgaA-Auspumpen als Biofilmbaustein aufweist. Dieses Ergebnis steht auch im Einklang mit der Biofilmquantifizierung und der SEM-Beobachtung bei Ab15151 und seinen Derivatstämmen (Abb. 3).

Nach unserem besten Wissen gibt es zwei PGA-Operons, die in allen sequenzierten A. baumannii-Stämmen hoch konserviert sind. Die posttranslationale Proteinphosphorylierung wurde eher in PNAG N-Deacetylase AbPgaB1 (A1S_0938) als in AbPgaB2 (A1S_2161) gefunden. Einzelne AbPgaB1- oder AbPgaB2-Deletionsstämme (ΔAbpgaB1 oder ΔAbpgaB2) und der PgaB-Doppeldeletionsstamm (ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) wurden konstruiert, um den Beitrag zur Biofilmproduktion und zur Toleranz gegenüber antibakteriellen Arzneimitteln aufzuklären. Der Ab15151-Stamm mit AbPgaB1-Deletion (ΔAbpgaB1) produziert weniger Biofilm, dessen Phänotyp in ΔAbpgaB1, komplementiert mit AbpgaB1_WT (Δ + WT) oder AbpgaB1, das eine phosphomimetische Mutante am Rest Ser411 (Δ + S411D) enthielt, umgekehrt war (Abb. 3). Ein hoher Acetylgehalt von PNAG scheint sich in geringerem Maße an PgaA zu binden, was den Export von Exopolysacchariden verhindert30, was die geringere Biofilmproduktion in ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2 widerspiegelt (Abb. S5). Der PgaB-defiziente Stamm (ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) besaß unter allen getesteten Stämmen eine hohe Toleranz gegenüber Colistin und Tetracyclin (Tabelle 2 und Abb. 4). Dieses Ergebnis zeigte eine Biofilm-unabhängige Strategie von A. baumannii zur Überwindung von Antibiotika-Stress. In der vorherigen Studie wurde erwähnt, dass PgaB-defiziente E. coli aufgrund der Ansammlung von PNAG im Periplasma keinen Biofilm bilden können24. Die Untersuchung von BbPgaB in B. bronchiseptica zeigte, dass BbPgaB und seine Deacetylierungsaktivität für die PNAG-Translokation nicht erforderlich sind38. Es gibt zwei Möglichkeiten, die zu einer BbPgaB-unabhängigen PNAG-Translokation in B. bronchiseptica führen38. Eine davon ist die kleinere TPR-Domäne in BbPgaA als in EcPgaA, die die Fähigkeit besitzt, mit PgaB zu interagieren, um dessen PNAG-Translokationsaktivität zu beeinflussen. Dies wurde durch weitere Untersuchungen der Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen der TPR-Domäne von PgaA und PgaB30 bestätigt. Die andere Möglichkeit besteht darin, dass die fehlenden Reste in der BbPgaA-TPR-Domäne dazu führen können, dass die Porinstruktur konstitutiv für die PNAG-Translokation geöffnet ist38. Die Sequenzausrichtung von AbPgaA (A1S-2162, 812 aa) und EcPgaA (807 aa) zeigt 55 % der Sequenzidentität, was auf die hochkonservierte TPR-Domäne und Porinstruktur zwischen AbPgaA und EcPgaA hinweist. Die von SWISS-MODEL mit PDB 4y25 als Vorlage erstellte AbPgaA-Modellierungsstruktur zeigt, dass die Porinstruktur von AbPgaA mehrere negativ geladene Reste besitzt (Abb. S9). Dieses Strukturmerkmal steht im Einklang mit der in der EcPgaA-Studie beschriebenen Hypothese, dass AbPgaA möglicherweise lieber deacetyliertes PNAG als acetyliertes PNAG transloziert. Wir gingen davon aus, dass der PgaB-defiziente Stamm (ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) in dieser Studie möglicherweise PNAG im Periplasma ansammelt, was Colistin daran hindert, LPS auf der Zytoplasmamembran zu neutralisieren, und zu einer höheren Colistin-Toleranz führt (Tabelle 2 und Abb. 4).

Aufgrund der Nephrotoxizität und Neurotoxizität von Colistin wird die Verwendung dieses antibakteriellen Arzneimittels immer seltener. Allerdings gilt Colistin immer noch als Antibiotikum der letzten Wahl gegen gramnegative Bakterien, insbesondere bei Infektionen mit Carbapenem-resistenten MDR-Erregern. In jüngsten Berichten wurde das Risiko der Nebenwirkungen von Colistin neu bewertet und seine Sicherheit und hohe Wirksamkeit gegen MDR-Infektionen mit gramnegativen Erregern nachgewiesen39,40,41,42. Der Anstieg isolierter klinischer Carbapenem-resistenter MDR-Krankheitserreger macht Colistin zu einem in Betracht zu ziehenden Antibiotikum der letzten Wahl. Derzeit gibt es immer mehr heteroresistente und therapeutische Misserfolge bei der Behandlung mit Colistin, was bedeutet, dass die Colistin-resistenten Mechanismen identifiziert werden müssen43,44,45. Die aktuellen Studien zur Colistin-Resistenz beziehen sich auf chromosomal vermittelte und plasmidvermittelte Forschung. Der Verlust genomischer Regionen mit mrkC, mrkD, modA, modB, modC, modD und ppk, die an der Biofilmproduktion beteiligt sind, wurde bei Colistin-resistenten A. baumannii-Stämmen beobachtet46. Es wurde über die Gene mcr-1 und mcr-2 berichtet, die die durch Plasmide übertragene Colistin-Resistenz vermitteln47,48. Die Zweikomponentensysteme PmrA/PmrB und PhoP/PhoQ sind mit der Regulierung der LPS-Modifikation verbunden40,42. Diese Berichte zeigten, dass sich die meisten Colistin-resistenten Mechanismen auf die LPS-Modifikation und die durch Pili-Assemblierung vermittelte Biofilmproduktion konzentrieren. In dieser Studie haben wir eine neue Möglichkeit entdeckt, dass A. baumannii Colistin überwinden kann, indem es den PNAG-Transport als Biofilmbaustein behindert. Und irgendwie könnte sich dieser Phänotyp von A. baumannii in Colistin-tolerante Zellen umwandeln, die überleben, wenn sie mit dem bakteriziden Antibiotikum Colistin stimuliert werden.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die PNAG-assoziierte Biofilmproduktion durch PNAG-Deacetylase, PgaB, reguliert wurde, die im Allgemeinen in A. baumannii vorkommt. An der Biofilmproduktion von A. baumannii sind zwei Kopien von PgaB beteiligt. AbPgaB1 wird am Rest Ser411 durch Phosphoryl reguliert, um die dPNAG-Umsatzzahl zu modulieren, und steht in direktem Zusammenhang mit der Biofilmproduktion. Sowohl die MHK-Bestimmung als auch die Tests zur Abtötung antibakterieller Arzneimittel ergaben in dieser Studie, dass der PgaB-defiziente A. baumannii-Stamm (ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) eine höhere Toleranz gegenüber den Antibiotika Colistin und Tetracyclin aufweist als Wildtyp- und andere abgeleitete Stämme. Abhängig von der MHK-Bestimmung während 4 Passagen gingen wir davon aus, dass der PgaB-defiziente A. baumannii-Stamm (ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) während der Subkultur für vier Passagen ohne Verabreichung eines antibakteriellen Arzneimittels leichter als andere dazu veranlasst wurde, sich in Colistin-tolerante Zellen umzuwandeln. Diese Studie entdeckt ein neues phänotypisches Modell, um den Übergang von Colistin-tolerantem A. baumannii herauszufinden. Denn die Produktion von PNAG kann bei verschiedenen A. baumannii-Stämmen unterschiedlich sein und manchmal trägt sie möglicherweise nicht dazu bei, das Niveau der Biofilmproduktion bei allen klinischen Stämmen zu erhöhen. Diese Studie könnte einen möglichen Mechanismus liefern, um die Colistin-Resistenz von A. baumannii in der klinischen Praxis herauszufinden.

Die Sequenzen von A1S-0938 und A1S-2161 wurden vom National Center for Biotechnology Information (NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) heruntergeladen und ihre Zugangsnummern waren ABO11370 bzw. ABO12588. Die Sequenzidentität wurde durch Needleman-Wunsch-Alignment auf NCBI analysiert. Polysaccharid-Deacetylase aus Bakterien wurde von ClustalW ausgerichtet und der phylogenetische Baum wurde basierend auf der Neighbor-Joining-Clustering-Methode unter Verwendung von Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0 (MEGA6)49 erstellt. Die anderen in dieser Studie verwendeten Zugangsnummern der Proteinsequenzen lauten wie folgt: pgaB aus E. coli (AWY89024), K. pneumonia (AUH99166), B. bronchiseptica (AUV49813), IcaB aus S. aureus (AAD52057), S. epidermidis (AAZ78359), Polysacchariddeacetylase aus P. aeruginosa (AAG04906), L. monocytogenes (NP_463944), B. subtilis (API95827) und C. difficile (AYD08208). Die Transmembranregion von A1S-0938 (AbpgaB1) und A1S-2161 (AbpgaB2) wurde durch das Tool „TransMembrane protein Re-Presentation in 2Dimensions“ (TMRPres2D)31 vorhergesagt.

Der A. baumannii-Stamm 15151 wurde regelmäßig bei 37 °C in LB-Medium unter Schütteln kultiviert. Um die pgaB-Deletions-Ab-Stämme zu konstruieren, enthielt das Fragment 600 bp stromaufwärts von A1S_0938 (einschließlich A1S_0937 voller Länge und des A1S_0938-Promotors) und 1300 bp stromabwärts von A1S_0938 (enthaltend A1S_0939 voller Länge) und wurde als dpgaB1 definiert. Das Fragment von dpgaB1 wurde in den pK18mobsacB-Vektor (ATCC87097™) kloniert. Das konstruierte Plasmid wurde dann zur Konjugation an den A. baumannii-Stamm 15151 in E. coli S17-1 transformiert. Das konstruierte dpgaB1 wurde auf der Grundlage einer homologen Rekombination mit einem Kanamycin-resistenten Gen als Selektionsmarker in das Chromosom integriert. Knockout-Mutanten wurden durch Züchten der Zellen auf einem Medium mit 10 % Saccharose ohne Antibiotikabehandlung selektiert. Sowohl die AbpgaB1- als auch die AbpgaB2-Ab-Stämme mit doppelter Deletion folgten einer ähnlichen Strategie wie bei der Konstruktion des AbpgaB2-Fragments (A1S_2161), und das Konjugationsziel war der Ab-Stamm mit AbPgaB1-Deletion (ΔAbpgaB1). Für die In-Trans-Komplementierung wurde das Fragment, das die Gene A1S_0938, A1S_0939 und A1S_0940 enthielt, in den von pABYM250 abgeleiteten Shuttle-Vektor pABCLIIc kloniert, um den AbpgaB1-Komplement-Ab-Stamm (Δ + WT) zu erzeugen. Mutanten, die phosphoryliertes und nicht phosphoryliertes AbPgaB1 nachahmen, wurden durch ortsspezifische Mutagenese unter Verwendung des AbpgaB1-Komplementstamms als Matrize erzeugt. Zur weiteren Affinitätssäulenreinigung wurden AbpgaB1 WT und seine abgeleiteten Mutanten in den Shuttle-Vektor pABCLIIa subkloniert, der aus LacI, LacO und 6 × His-Tag-Fusion am C-Terminus des Ziels bestand.

A. baumannii-Stämme (WT, ΔAbpgaB1 und ΔAbpgaB1ΔAbpgaB2) wurden in einem LB-Medium bei 37 °C unter Schütteln kultiviert. Insgesamt wurde 1 l Kulturen jedes Stammes geerntet und in 50 ml entionisiertem Wasser resuspendiert. Rohextrakte von extrazellulärem Polysaccharid (EPS) wurden in entionisiertem Wasser gelöst und dann wurden suspendierte Kulturen 30 Minuten lang bei 100 °C in doppelt gekochtem Wasser inkubiert. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde die unlösliche Matrix durch Zentrifugation mit 12.000 U/min für 1 Stunde bei 4 °C entfernt. Gesamtextrakte von EPS wurden mit einer Endkonzentration von 75 % Ethanol bei 4 °C über Nacht ausgefällt. Die Fällungsmittel wurden durch einstündige Zentrifugation bei 12.000 U/min bei 4 °C geerntet und in Puffer (25 mM Tris, pH 8,0, 5 mM MgCl2, 5 mM CaCl2) aufgelöst. Die Proben wurden 8 Stunden lang mit DNase (Roche) und RNase (Sigma) bei 37 °C und dann über Nacht mit Proteinase K (Bioscience) bei 37 °C behandelt, um kontaminierte Nukleinsäuren und Proteine zu entfernen. Die Gesamtextrakte wurden 30 Minuten lang in doppelt gekochtem Wasser bei 100 °C inkubiert, um alle möglichen verbleibenden Proteine zu denaturieren, und dann 1 Stunde lang bei 4 °C und 12.000 U/min zentrifugiert. Die Überstände wurden mittels einer 1-KDa-Membran bei 4 °C in das 100-fache Volumen entionisiertes Wasser dialysiert. Die Proben wurden zur weiteren Analyse lyophilisiert. Um den Acetylierungsgrad von EPS relativ zu quantifizieren, wurde das lyophilisierte EPS für die Protonen-NMR-Analyse in D2O aufgelöst (Bruker UltraShield, 600 MHz/54 mm, supraleitender Magnet mit 14,1 Tesla).

Der A. baumannii-Stamm 15151 wurde zur Proteom- und Phosphoproteom-Probenvorbereitung regelmäßig bei 30 °C und einer anfänglichen OD600 von 0,1 in LB-Medium kultiviert. Die Kultur wurde nach 6 Stunden geerntet, als die OD600 0,4 erreichte, was in dieser Studie als mittlere exponentielle Phase der Planktonzellen definiert ist. Biofilmzellen wurden nach 24-stündiger Subkultur geerntet, die flüssige Komponente verworfen und die an der Wand befestigten Biofilme dreimal mit PBS gewaschen. Die Biofilmzellen wurden durch Zugabe von PBS in die Vertiefungen und 15-minütiges Schütteln der Mikroplatte abgeschüttelt. Durch Ultraschallbehandlung wurden Gesamtextrakte sowohl der Plankton- als auch der Biofilmzellen gewonnen. Die Proteinkonzentrationen wurden basierend auf dem Bradford-Assay (Bio-Rad) quantifiziert.

Fünf Milligramm der extrahierten Proteine wurden mit Trypsin (1:40 w/w) sowohl in gelbasierten als auch gelfreien Verfahren verdaut51,52. Die tryptischen Peptide wurden zur weiteren proteomischen Analyse über SDB-XC StageTip entsalzt. Phosphopeptide aus Plankton- und Biofilmzellen wurden mit maßgeschneiderten HAMMOCK-Spitzen angereichert, die aus 0,5 mg TiO2-Kügelchen (GL Sciences) hergestellt wurden, verpackt in 10 μl C8-StageTips46. Die resultierenden Phosphopeptide wurden für die weitere Analyse mittels Flüssigchromatographie-Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS, Fusion) (Thermo Scientific) lyophilisiert. Die MS- und MS/MS-Rohdaten wurden mit der MaxQuant-Software (Version 1.5.1.2)50 basierend auf der Datenbank des A. baumannii-Stammes 1515153 analysiert. Die Falscherkennungsrate der Peptide, Proteine und Modifikationsstellen wurde auf 0,1 % festgelegt Der minimale MaxQuant-Score für Phosphorylierungsstellen betrug 40, mit einer Lokalisierungswahrscheinlichkeit von mindestens 75 %. Die Genontologie jedes identifizierten Proteins wurde basierend auf der Uniprot-Datenbank (www.uniprot.org) annotiert. Die MS-Proteomik- und Phosphoproteomik-Daten wurden im ProteomeXchange-Konsortium über das PRIDE54-Partner-Repository unter den Datensatzkennungen PXD010140 bzw. PXD010172 hinterlegt.

Die Proteinstruktur von AbPgaB1 in dieser Studie wurde mit der Software SWISS-MODEL mit der Vorlage PDB: 4f9j modelliert. Die Modellierungsstruktur wurde von PyMOL angezeigt. Man ging davon aus, dass die Modellierungsstruktur zuverlässige Informationen zwischen Liganden und Proteinen liefern könnte. Die in Discovery Studio 3.5 (Accelrys Software, Inc., San Diego, CA, USA) implementierten Skizzenmoleküle und Vorbereitungsligandenmodule wurden zum Aufbau der Molekülstrukturen aller Verbindungen verwendet. Die in der Docking-Analyse verwendeten Verbindungen wurden in drei Schritten hergestellt: (1) zweidimensionale Strukturen wurden in dreidimensionale Strukturen umgewandelt, (2) Ladungen wurden berechnet und (3) H-Atome wurden hinzugefügt. Molekulare Modellierung wurde verwendet, um die komplexe Struktur des AbPgaB1-PNAG-Komplexes zu reproduzieren. Die AbPgaB1-Reste V410, S411, K412, D413, L414, A422, G423, E424, H425, L426, W427, M428, G429, L431, R432, D444, T467, L468, S469, E472, W549 und Y550 wurden als Konstituenten definiert ing die Bindungsstelle beim flexiblen Protein-Ligand-Docking, das mithilfe des GOLD-Docking-Programms (Cambridge Crystallographic Data Center (CCDC), Version 5.1) mit der GoldScore-Bewertungsfunktion erreicht wurde. Die Seitenketten der Bindungsstellenreste wurden während der Docking-Analyse als flexibel eingestellt. Das konstruierte, energieminimierte N-Acetylglucosamin-Tetrasaccharid wurde gemäß den modifizierten Docking-Parametereinstellungen (Anzahl der Vorgänge = 1.600.000 und Populationsgröße = 1000; für die anderen Parameter wurden Standardeinstellungen verwendet) an die definierte Bindungsstelle angedockt. Die wahrscheinlichste Ausrichtung und die günstigste freie Energieposition wurden analysiert.

Eine einzelne Kolonie von A. baumannii 15151, die das Plasmid trägt, das die Überexpression von AbPgaB1, fusioniert mit dem C-terminalen His-Tag, ermöglicht, wurde in das LB-Medium inokuliert. Die Übernachtkulturen wurden in einem Verhältnis von 1:100 (v/v) in 1 l frischem LB-Medium verdünnt. Die AbPgaB1-Expression wurde durch die Zugabe von 0,5 mM IPTG induziert, als der A600 der Kulturen 0,7 erreichte. Nach 12-stündiger Inkubation wurden die Zellen geerntet und mit einem Hochdruckhomogenisator (Nanolyzer) aufgeschlossen, um Gesamtproteine zur weiteren Reinigung auf einem mit Nickel beladenen Affinitätsharz (GE Healthcare) gemäß Standardverfahren zu erhalten. Die gereinigten Proteine wurden mithilfe eines Amicon Ultra-Zentrifugalfilters konzentriert und ihre Konzentration anhand eines Bradford-Assays quantifiziert. Die gereinigten Proteine wurden durch SDS-PAGE auf einem 12 % Acrylamidgel (Tools, HR-Gradientengel, TFU-GG420) aufgetrennt.

In einer früheren Studie haben wir gezeigt, dass der Hauptbestandteil des Exopolysaccharids aus dem A. baumannii-Stamm SK17 teilweise deacetyliertes PNAG (dPNAG) war, das als Substrat von AbPgaB1 extrahiert wurde. Die De-N-Acetylierungsaktivität von AbPgaB1 wurde durch Ninhydrin-Assays55 durchgeführt. Kurz gesagt enthielt das De-N-Acetylierungs-Reaktionsgemisch 50 mM NaCl, 10 μM CoCl2 und 0–4,0 mg extrahiertes PNAG/ml, zubereitet in 50 mM HEPES-Puffer (pH 7,5). Die Reaktion (100 μL Endreaktionsvolumen) wurde durch Zugabe von AbPgaB1 oder seinen Derivaten gestartet. Nach einer einstündigen Inkubation bei 37 °C wurde die Reaktion durch eine 10-minütige Inkubation bei 100 °C beendet. Die Färbung wurde durch 10-minütige Inkubation von 50 µL Überstand mit 25 µL Ninhydrin (Sigma) bei 100 °C erreicht. Die Mischung wurde durch Zugabe von 125 μl 95 %igem Ethanol verdünnt und die Menge an freiem Amin (de-N-acetyliertem Glucosamin) wurde durch Messung der Absorption bei 570 nm und anschließendem Vergleich mit einer Glucosamin-Standardkurve nachgewiesen.

Übernachtkulturen wurden in einem LB-Medium mit 1 % Glucose verdünnt, um eine anfängliche OD600 von 0,05 zu erhalten. Nach 12-stündiger Inkubation bei 30 °C unter Schütteln mit 180 U/min wurde der resultierende Biofilm dreimal in Wasser gewaschen. Um die Biofilmbildung zu quantifizieren, wurden an den Vertiefungen einer Polypropylenplatte mit 96 Vertiefungen befestigte Biofilme 20 Minuten lang mit Kristallviolett (CV) angefärbt, dreimal in Wasser gewaschen und 10 Minuten lang mit 95 %igem Ethanol solubilisiert und ihre Absorption bei 595 °C gemessen nm wurde bestimmt. Für die Rasterelektronenmikroskopie (REM)-Beobachtung wurden unter den gleichen Bedingungen auf Deckgläsern gebildete Biofilme in einer 2,5 % Formaldehyd/4 % Glutaraldehyd-Lösung fixiert und dann dehydriert.

Die Übernachtkulturen von A. baumannii-Stämmen wurden mit frischer Mueller-Hinton-Brühe mit einer anfänglichen optischen Dichte von 0,005 bei 600 nm verdünnt. Die Antibiotika wurden zur Verabreichung an Ab-Stämme seriell verdünnt. Die beimpften Zellen mit seriell verdünnten Antibiotika wurden 16 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurde die optische Dichte der getesteten Kulturen bei 600 nm mit dem Mikroplatten-Lesegerät bestimmt. Während mehrerer Passagen der MHK-Bestimmungen wurden die über Nacht (16–20 Stunden) kultivierten Ab-Stämme im Verhältnis 1:1000 in LB-Medium übertragen. Der MHK-Nachweis von P. aeruginosa ATCC 27.853 wurde in diesem Test als Standardkontrolle durchgeführt.

Die minimalen Biofilm-Eradikationskonzentrationen von A. baumannii ATCC15151 und seinen AbpgaB1/AbpgaB2-vermittelten Mutantenstämmen wurden durch Protokoll56 bestimmt. Kurz gesagt, die Übernachtkulturen wurden mit Mueller-Hinton-Brühe auf OD600 0,005 verdünnt. Jeder Stamm wurde in Platten mit 96 Vertiefungen kultiviert, wobei in jede Vertiefung ein Stiftdeckel eingesetzt wurde. Nach 24-stündiger Inkubation wurde der Biofilm jedes Stammes mit Mueller-Hinton-Brühe, die eine zweifach verdünnte antimikrobielle Lösung enthielt, in die 96-Well-Platten überführt. Anschließend wurden die Platten 24 Stunden lang inkubiert, um sie mit Antibiotika zu stimulieren. Die Stöpseldeckel wurden dann in neue 96-Well-Platten mit frischer Mueller-Hinton-Brühe gelegt. Die im Biofilm eingebetteten Bakterienzellen jedes getesteten Stammes werden nach 1 Minute Beschallung in frisches Medium freigesetzt. Die 96-Well-Platten wurden weitere 24 Stunden lang inkubiert und dann wurde die niedrigste Konzentration an Antibiotika, die sichtbares Wachstum verhinderte, als MBEC definiert.

Um die Überlebenszellen zu untersuchen, wenn A. baumannii mit dem bakteriziden Medikament Colistin oder dem bakteriostatischen Medikament Tetracyclin behandelt wird, wurden die Kulturen der 3. Generation von A. baumannii-Stämmen auf OD600 0,1 (107 KBE/ml) und OD600 0,01 (106 KBE/ml) verdünnt. für die Verabreichung von Colistin bzw. Tetracyclin. Für die dosisabhängigen Tests zur Abtötung von Colistin wurden die Kulturen der Ab-Stämme 1 Stunde lang mit 16,0, 32,0 oder 64,0 μg/ml Colistin behandelt. Im Fall von Tetracyclin wurden die dosisabhängigen Abtötungstests mit 4,0, 8,0 oder 16,0 μg/ml Tetracyclin durchgeführt. Nach einer Stunde Behandlung wurden die Kulturen zehnfach seriell verdünnt und dann 2 μl auf die LB-Agarplatte getupft, um eine weitere Inkubation über Nacht bei 37 °C zu ermöglichen. Die zeitabhängigen Abtötungstests wurden mit 32,0 μg/ml Colistin oder 8,0 μg/ml Tetracyclin-Verabreichung über 4 Stunden durchgeführt. Während der Antibiotikastimulation wurden die Kulturen zu den Zeitpunkten 0, 2 und 4 Stunden zehnfach seriell verdünnt und zur Inkubation über Nacht auf LB-Agarplatten aufgetragen.

Um die Colistin-toleranten Zellen von heteroresistenten Zellen zu unterscheiden, wurde die 3. Generation der Ab-Stämme zur Bestimmung der Wachstumskurve mit MHB auf OD600 0,05 verdünnt. Die inokulierten A. baumannii-Zellen wurden 2 Stunden lang unter Schütteln bei 37 °C inkubiert und anschließend für eine weitere 25-stündige Inkubation mit 16,0 μg/ml Colistin oder Tetracyclin verabreicht. Als Kontrolle wurde der Wachstumszustand ohne Antibiotika bestimmt. Die optische Dichte bei 600 nm jeder Ab-Kultur wurde zu mehreren Zeitpunkten während der 27-stündigen Inkubation ermittelt.

Die detaillierte Liste der in dieser Studie identifizierten Phosphoproteine und Phosphopeptide wurde als Tabelle S2 bereitgestellt. Die MS-Proteomik- und Phosphoproteomik-Rohdaten wurden im ProteomeXchange-Konsortium über das PRIDE-Partner-Repository unter den Datensatzkennungen PXD010140 bzw. PXD010172 hinterlegt. Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem Manuskript und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten.

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Wir danken Yun-Ting Tseng und Chia-Yu Chen für ihre anfängliche Arbeit an diesem Projekt. Wir sind dankbar für die Unterstützung der SEM-Technologie durch das Institut für Biomedizinische Wissenschaften der Academia Sinica.

Wir sind dankbar für die finanzielle Unterstützung durch das Ministerium für Wissenschaft und Technologie (MOST 110-2320-B-039-058) und die Finanzierung durch die China Medical University (CMU110-MF-98; CMU110-N-31).

Graduierteninstitut für Biomedizinische Wissenschaften, China Medical University, Taichung, 404333, Taiwan

Shu-Jung Lai

Forschungszentrum für Krebsbiologie, China Medical University, Taichung, 404333, Taiwan

Shu-Jung Lai

Institut für Biologische Chemie, Academia Sinica, Taipei, 11529, Taiwan

I-Fan Tu & Shih-Hsiung Wu

Institut für Molekularbiologie, National Chung Hsing University, Taichung, Taiwan

Tien-Sheng Tseng

Institut für Molekulare Physiologie, Shenzhen Bay Laboratory, Shenzhen, 518132, China

Yu-Hsuan Tsai

Fakultät für Chemie, National Taiwan University, Taipei, 106, Taiwan

Shih-Hsiung Wu

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SJL und SHW konzipierten und leiteten die Forschung. SJL hat die Proteom- und Phosphoproteomstudie von A. baumannii entworfen. SJL und IFT konstruierten die A. baumannii-Mutantenstämme. IFT und TST haben die Modellierungsstrukturanalysen entworfen und berechnet. YHT berechnet und Analyse der NMR-Daten. SJL entwarf und führte alle anderen Experimente durch (z. B. Sequenzanalyse, Proteinexpression und -reinigung, Aktivitätstests, Biofilmquantifizierung, MHK-Bestimmung, Antibiotika-Abtötungstests und Wachstumstests). Abbildungen und Manuskripte wurden von SJL erstellt. Alle Autoren überprüften und genehmigten das endgültige Manuskript.

Korrespondenz mit Shu-Jung Lai oder Shih-Hsiung Wu.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Lai, SJ., Tu, IF., Tseng, TS. et al. Der Mangel an Poly-β-1,6-N-Acetylglucosamin-Deacetylase löst bei A. baumannii die Umwandlung in biofilmunabhängige Colistin-tolerante Zellen aus. Sci Rep 13, 2800 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-30065-5

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Eingegangen: 02. November 2022

Angenommen: 15. Februar 2023

Veröffentlicht: 16. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30065-5

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