Entwicklung eines ternären Cyclodextrins - Coastwise Ventures Group Co., Ltd

Kommunikationsbiologie Band 5, Artikelnummer: 1234 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Entwicklung nützlicher Funktionalitäten in klinisch validierten, alten Antibiotika verspricht die wirtschaftlichste Lösung für den weltweiten Mangel an wirksamen Antibiotika zu sein, der zweifellos eine ernsthafte Gesundheitsgefahr darstellt. Hier zeigen wir, dass die Verwendung der Oberflächenchemie des Cyclodextrinzyklus (βCD) und Arginin (arg) als Linker einen stabileren ternären Antibiotikakomplex (βCD-arg-cpx) ergibt. Im Gegensatz zu klassischen, weniger stabilen Einschlusskomplexen, die nur die Löslichkeit von Antibiotika verändern, ist der hier vorgestellte ternäre Komplex stabiler und kontrolliert die Wirkstofffreisetzung. Die Komponenten des Komplexes intensivieren die Wechselwirkungen mit Bakterienmembranen und erhöhen die Verfügbarkeit des Arzneimittels in Bakterienzellen, wodurch seine antimikrobielle Wirksamkeit und sein Sicherheitsprofil verbessert werden. Multifunktionale Antibiotika, die per se als Arzneimittelabgabesysteme formuliert sind, die das Arzneimittel an den Wirkungsort bringen, seine Wirksamkeit maximieren und eine optische Nachweisbarkeit ermöglichen, gelten als die Zukunft im Kampf gegen Infektionen. Ihre Rolle als Werkzeug gegen multiresistente Stämme bleibt eine interessante Herausforderung für weitere Forschung.

Der Rückgang wirksamer antimikrobieller Mittel stellt in der modernen Welt eine sehr ernste Bedrohung für die globale Gesundheit dar, wie die Weltgesundheitsorganisation kürzlich betonte1. In den letzten Jahrzehnten sind nur wenige neuartige Antibiotika auf den Markt gekommen, und seit 1980 wurde keine völlig neue Klasse von Antibiotika entdeckt2. Angesichts der enormen Kosten und des unvorhersehbaren und kurzfristigen Nutzens hat die Entdeckung neuer Antibiotika keine große Priorität die Pharmaindustrie2,3. Die Neuverwendung, Neuprofilierung oder Wiederverwendung klinisch zugelassener Arzneimittel hat gegenüber der Entdeckung neuer Arzneimittelkandidaten erhebliche Zeit- und Kostenvorteile, insbesondere in sich abzeichnenden Situationen wie Pandemien4,5. Die entscheidenden Vorteile sind unter anderem ein vorhersehbares Sicherheitsprofil, Vorkenntnisse über Herstellungsverfahren, etablierte Testprotokolle, einfachere behördliche Anforderungen und kürzere Markteinführungszeiten6,7. Daher ist es nicht verwunderlich, dass etwa ein Drittel aller im letzten Jahrzehnt zugelassenen Medikamente zweckentfremdete Altmedikamente waren, die 25 % des Umsatzes der Pharmaindustrie ausmachen7,8. Ein Großteil der Anstrengungen in der aktuellen präklinischen Antibiotika-Pipeline konzentriert sich auf die Modifizierung alter Antibiotika, um ihre Wirksamkeit zu erhöhen, insbesondere in Synergie mit anderen Arzneimitteln oder nichtmedikamentösen Hilfskomponenten9,10. Die größten wissenschaftlichen Herausforderungen bei der Erreichung dieses Ziels sind die begrenzte Penetration, Efflux und Toxizität, die mit der Behandlung mit hohen Dosen verbunden sind9,10.

Ein einfacher und sehr effektiver Ansatz zur Neugestaltung alter Antibiotika besteht in der Bildung instabiler Komplexe, die Eigenschaften wie Löslichkeit, Stabilität, Bioverfügbarkeit und Permeabilität verändern und so deren therapeutisches Ergebnis direkt beeinflussen. In diesem Zusammenhang sind Cyclodextrine (CDs) besonders geeignet11,12. Mit einer kegelstumpfförmigen Struktur haben sie eine hydrophile Hülle (mit 7 primären Gruppen, die zur schmalen Kante hin ausgerichtet sind, und 14 sekundären Zuckerhydroxylgruppen, die zur breiteren Kante des Kegels hin ausgerichtet sind, im Fall von β-CD) und einen hydrophoben Kern (mit ein Kohlenstoffgerüst aus 7 Glucopyranose-Einheiten, die die Struktur von β-CD bilden), das für Wechselwirkungen mit Arzneimittelmolekülen verfügbar ist11,13,14. Am häufigsten werden Antibiotika als Einschlusskomplexe formuliert, bei denen der hydrophobe Teil des Arzneimittels mit dem hydrophoben inneren Kernbereich des CD interagiert, was folglich seine Löslichkeit um ein Vielfaches erhöht11. Dieser Ansatz wurde auf verschiedene Antibiotika (β-Lactame, Mikrolide, Fluorchinolone, Sulfonamide, Tetracycline und Aminoglycoside) angewendet und ihre minimalen Hemmkonzentrationen (MICs) wurden um Faktoren von 2 auf mehr als 10011 reduziert. Es handelt sich um einen Enthalpie-gesteuerten Ansatz Prozess, und der Wirt-Gast-CD-Wirkstoffkomplex befindet sich im Gleichgewicht mit dem freien Wirkstoff ohne chemische Bindung12. Dieser Ansatz wird noch effektiver, wenn der CD-Hilfsstoff mit speziell ausgewählten Hilfskomponenten (wie hydrophilen Polymeren, Aminosäuren oder Hydroxylsäuren) kombiniert wird, um ternäre Komplexe zu bilden15,16,17,18. Der hydrophobe Teil des Arzneimittels bildet einen CD-Wirkstoff-Einschlusskomplex, während der hydrophile Teil gleichzeitig eine Säure-Base-Reaktion mit der Hilfskomponente eingeht, um ein Salz zu bilden.

Ein gutes Beispiel ist Arginin, eine basische Aminosäure, die mit sauren Arzneimitteln (z. B. Naproxen, Zoloprofen, Oxaprozin) Salze bildet und mit CD16,17,18 komplexiert. Dadurch wird eine deutliche Steigerung der Stabilitätskonstante und der Komplexierungseffizienz erreicht. Daher wird erwartet, dass die Kombination eines Antibiotikums mit CD und Arginin zu einem ternären Komplex dessen antimikrobielle Aktivität stark beeinflussen könnte. Bisher wurden jedoch nur wenige Untersuchungen solcher Komplexe durchgeführt, darunter eine Studie zu Cefuroxim, die eine drastisch erhöhte Löslichkeit nach der Bildung ternärer Komplexe mit CD und Arginin zeigte19.

Anstelle der weniger stabilen Einschlusskomplexe, die normalerweise zur Erhöhung der Arzneimittellöslichkeit gebildet werden, haben wir einen stabileren ternären antibiotischen β-Cyclodextrin-Arginin-Ciprofloxacin-Komplex (βCD-arg-cpx) entwickelt, bei dem Ciprofloxacin (cpx) an die hydrophile Oberfläche gebunden ist βCD über einen Arginin (arg)-Linker. Unser Ziel war es bei diesem Ansatz nicht einfach, wie üblich, die Löslichkeit des Arzneimittels zu erhöhen. Hier ist unser synthetisiertes komplexes System vor allem stabiler, um die Freisetzung von Antibiotika zu kontrollieren, verbesserte Wechselwirkungen mit der Zellwand und den Membranen der Bakterien zu ermöglichen und eine höhere Permeabilität und Verfügbarkeit innerhalb der Bakterien zu gewährleisten, wodurch die Wirksamkeit der antibakteriellen Behandlung verbessert wird. Neben einer verbesserten antimikrobiellen Wirksamkeit wurde auch eine erhebliche Verbesserung des Sicherheitsprofils nachgewiesen.

Der βCD-arg-cpx-Komplex fügt sich zu gut organisierten 3D-Strukturen (Abb. 1a) in Form von nur wenige Mikrometer langen Stäben (Abb. 1b) mit hochgeordneten, radialen Strukturen zusammen, die aus seitlich verbundenen Platten mit einer Dicke von einigen zehn Nanometern bestehen (Abb. 1c). Ein genauerer Blick auf die einzelnen Platten und das zugehörige Elektronenbeugungsmuster (Abb. 1d) zeigt ihre einkristalline Natur. Morphologisch unterscheiden sich diese Anordnungen von βCD-cpx, und βCD-arg-Komplexe wurden als unregelmäßig geformte, nicht zusammengesetzte Partikel nachgewiesen (Abb. 1e – g).

Darstellung der Struktur mit einem arg-cpx-Kristallkern und βCD an der Oberfläche (a). SEM-Morphologie zeigt lange, ausgerichtete, stäbchenförmige Strukturen des βCD-arg-cpx-Komplexes (b) mit scharfen, nanodicken Kanten (c). Stärker vergrößertes TEM-Bild der βCD-arg-cpx-Stäbchen (d) und EDS-Muster, das ihre kristalline Natur zeigt (Einfügung in (d)). TEM-Strukturen zeigen Unterschiede zwischen βCD-arg-cpx (e), βCD-cpx (f) und βCD-arg (g).

Die Elementarkartierung in einem Einzelstab-βCD-Arg-Cpx-Komplex (Abb. 2a1) detektierte C- (Abb. 2a2), F- (Abb. 2a3), N- (Abb. 2a4) und O- (Abb. 2a5) Elemente, die homogen entlang des Komplexes verteilt waren große Fläche eines Kristalls. Eine weitere XPS-Analyse der Oberflächenzusammensetzung wurde an der cpx-Arzneimittelreferenz sowie am βCD-arg-cpx-Komplex vor und nach dem Weichätzen mit Ar-Ionen durchgeführt. Da N sowohl im Antibiotikum als auch im Arginin (nicht in CD) vorhanden ist, während F nur in cpx vorhanden ist, war das höhere N/F-Verhältnis in einem Komplex im Vergleich zu cpx auf die Argininbindung zurückzuführen. Andererseits bestätigten abnehmende C/F- und O/F-Verhältnisse von der Oberfläche zur Masse des βCD-arg-cpx-Komplexes βCD an der Oberfläche. Da die F-Seite von cpx nicht in die Komplexierung einbezogen wird, bleibt das Maximum bei 687,5 eV im F1s-Spektrum (entsprechend CF-Bindungen)20 für alle drei untersuchten Systeme unverändert (Abb. 2b2). Andererseits zeigen N1s (mit zwei Maxima bei 401,1 eV und 399,7 eV, entsprechend CNC- und C-NH-Bindungen20, Abb. 2b4) einen erhöhten Anteil hauptsächlich an Aminen im Komplex als im cpx-freien Arzneimittel, was auf die Bindung von Arginin zurückzuführen ist Teil. Ihr Anstieg ist im Großteil des Komplexes zu beobachten. Das C1s-Spektrum (mit Maxima bei 287 eV, 285,8 eV und 284,8 eV entsprechend C=O, CN bzw. CC)20 und O1s (mit Maxima bei 533,1 eV und 531,5 eV, entsprechend CO und (C=O)- OH)20) zeigen eine Abnahme der Intensitäten der zu CO- und CN-Gruppen gehörenden Maxima in einem Komplex im Vergleich zur freien cpx-Referenz, was auf ihre Beteiligung an der Komplexierung zurückzuführen ist.

STEM-Bild (a1) mit Elementkartierungsanalyse entsprechend Kohlenstoff (C) (a2), Sauerstoff (O) (a3), Stickstoff (N) (a4) und Fluor (F) (a5); XPS-Analyse der Oberfläche und des Volumens (erhalten nach Weichätzen) des βCD-arg-cpx-Komplexes im Vergleich zu unberührten cpx-Referenzspektren – C1s (b1), F1s (b2), O1s (b3) und N1s (b4) hochauflösende Spektren .

Die βCD-arg-cpx-Komplexanordnungen mit hohem Aspektverhältnis sind hochkristallin, was durch ihre scharfen polykristallinen Beugungsmaxima angezeigt wird (ergänzende Abbildung 1a). Die detektierte Kristallstruktur ähnelt der des grundlegenden deprotonierten cpx (wie in Lit. 21 beobachtet), mit verschobenen Beugungsmaxima und dem Auftreten neuer Peaks. Es unterscheidet sich auch geringfügig von der Struktur, die für den βCD-NaOH-cpx-Komplex (eine Referenz, die durch Ersetzen von arg durch NaOH ausgefällt wurde) ermittelt wurde, und stimmt genau mit der Struktur von arg-cpx (eine Referenz, die dem Ciprofloxacin-Arginin-Salz entspricht) überein (ergänzende Abbildung). 1a), das aus der Säure-Base-Reaktion zwischen cpx und arg, der Bildung des Salzes und seiner Kristallisation resultiert. Im Gegensatz dazu ist die Kristallisation der getrennten cpx- und arg-Komponenten in βCD-cpx- und βCD-arg-Komplexaggregaten gering, was zu geringer Intensität und breiten Beugungsmaxima führt (ergänzende Abbildung 1a). Aufgrund des Fehlens der Anordnung ist die Kristallordnung in diesen Strukturen deutlich verringert. Daher bestand der kristalline Teil von βCD-arg-cpx aus arg-cpx-Salz mit einer an der Kristalloberfläche assoziierten amorphen βCD-Komponente.

Große strukturelle Unterschiede zwischen den verschiedenen Komplextypen waren insbesondere in ihren FTIR-Spektren zu beobachten (ergänzende Abbildung 1b). Das FTIR-Spektrum des Einschluss-βCD-Arg-Komplexes (ergänzende Abbildung 1b) zeigte typische βCD-Banden mit breiter OH-Streckung bei 3300 cm–1 und OH-Biegung bei 1640 cm–1 und CH-Streckung bei 2925 cm–1 sowie Ringvibration Banden als asymmetrische COC- und CC-Streckschwingungen bei 1152 cm-1, 1026 cm-1 und 932 cm-1 17,22,23 und Guanidin-CN-Streckschwingungsmodi von Arginin bei 1554 cm-1 (weitere Einzelheiten in der ergänzenden Abbildung 2) 24. Die Intensität der OH-Streck- und Biegemodi von βCD wurde im βCD-Arg-Spektrum verändert, es wurden jedoch keine zusätzlichen Banden beobachtet (ergänzende Abbildung 2). Im βCD-cpx-Komplex wurden leichte Positionsverschiebungen für die Banden beobachtet, die aromatischen Ringschwingungen von cpx und βCD entsprechen, die durch den Einbau des Moleküls in den βCD-Kegel entstehen, was typisch für Einschlusskomplexe ist (ergänzende Abbildung 3)25 ,26. Darüber hinaus deutete die Carboxyl-C=O-Schwingungsbande von cpx bei 1708 cm−1 auf eine neutrale Molekülform25,26 hin. Der βCD-cpx-Komplex zeigte keine zusätzlichen Banden (ergänzende Abbildung 3).

Eine völlig andere Situation wurde für den βCD-arg-cpx-Komplex beobachtet (ergänzende Abbildung 1b). Der Carbonyl-C=O-Streckschwingungsmodus, der bei 1708 cm−1 in βCD-cpx und auch in einer physikalischen Mischung aus βCD-, arg- und cpx-Komponenten nachgewiesen wurde, fehlt in den Spektren beider Komplexe, βCD-arg-cpx und βCD-NaOH- cpx, während die asymmetrische Carboxylatschwingung der Komplexe (die im Fall einer physikalischen Mischung und βCD-cpx fehlte) bei 1578 cm-1 erscheint, was beides auf Zwitterion-cpx-Formen innerhalb von βCD-arg-cpx und βCD-NaOH-cpx hinweist (Ergänzende Abbildungen). 3 und S4). Im Gegensatz zum Spektrum des Einschlusskomplexes βCD-cpx und dem Spektrum einer physikalischen Mischung von Komponenten des Komplexes fehlte in βCD-arg-cpx die cpx-OH-Streckschwingung bei 3526 cm−1, ein weiterer Hinweis auf dessen Deprotonierung bilden sich innerhalb des Komplexes. Darüber hinaus traten im Spektrum von βCD-arg-cpx typische Schwingungsbanden auf, die in früheren Komplexen beobachtet wurden, mit höherer Intensität, veränderten Intensitätsverhältnissen und höherer Auflösung, was auf eine Zunahme der strukturellen Ordnung und Kristallinität hinweist (wie bei Schwingungen von Carbonylgruppen in Formulierungen mit beobachtet). teilkristallines cpx)26. Insbesondere im Fingerabdruckbereich wurden neuartige Schwingungsbänder festgestellt (ergänzende Abbildung 4), die nicht zu einer der einzelnen Komponenten des Komplexes gehörten (separat und in ihrer physikalischen Mischung), sondern eine Folge der neuen komplexen Struktur waren. Es war interessant zu beobachten, dass die meisten der neuen Banden, die für βCD-arg-cpx erhalten wurden, auch in arg-cpx und βCD-NaOH-cpx nachgewiesen wurden, die mit Arginin oder NaOH auf den gleichen pH-Wert eingestellt wurden, was zusätzlich die ähnliche Struktur von bestätigte Komplexe, die unter Verwendung dieser beiden Säuremodulatoren gebildet werden. Das Vorhandensein von Arginin in βCD-arg-cpx beeinflusste jedoch die Schwingungen des βCD-Zyklusrings, was sich in der Abwesenheit der βCD-typischen Schwingungen bei 1079 und 996 cm−1 und der zusätzlichen Schwingungsfreiheit, die durch die neue Bande bei 1178 cm−1 festgestellt wurde, bemerkbar machte , was in βCD-NaOH-cpx nicht nachgewiesen wurde. Diese neuen Wechselwirkungen innerhalb von βCD-arg-cpx könnten eine Quelle für eine bessere Komplexstabilität sein, was später gezeigt wird. Untersuchungen der optischen Eigenschaften der βCD-Komplexe ermöglichten weitere Einblicke in ihre strukturellen Eigenschaften. Die Fluoreszenzemissionsspektren der βCD-arg-cpx- und arg-cpx-Komplexe (ergänzende Abbildung 1c) zeigten eine bathochrome Verschiebung, wenn die βCD-Komponente an das arg-cpx-Salz gebunden war. In beiden Fällen wurde eine Verschiebung beobachtet, wenn βCD an den βCD-arg-cpx- oder βCD-NaOH-cpx-Komplex gebunden war (ergänzende Abbildung 1c). Indirekt bestätigte diese Beobachtung das Vorhandensein dieser amorphen Komponente auf deprotonierten cpx-Kristallen (nachgewiesen im XRD und weiter aufgedeckt im FTIR) und lieferte Hinweise auf die Bindungsposition. Die beobachtete Fluoreszenz wurde dem Antibiotikamolekül mit Piperazinyl-Elektronendonor- und 4-Oxochinolin-3-carbonsäure-Elektronenakzeptorgruppen zugeordnet27. In ähnlicher Weise ist cpx im vorliegenden Fall über arg an βCD über eine Piperazinylgruppe mit Elektronendonatorcharakter gebunden. Die Bindung des cpx-Moleküls über den Arginin-Linker an βCD (oder direkt an das βCD-Molekül) begrenzt seine intramolekularen Bewegungen und eliminiert nichtstrahlende Relaxationen, wodurch eine im Vergleich zur freien Arzneimittelform verschobene Fluoreszenz bei λmax ermöglicht wird.

Die Überwachung des pH-Werts und des Zeta-Potenzials und der Ersatz von Arg durch NaOH als pH-Modifikator zeigten entscheidende Schritte zur Komplexbildung (Abb. 3). Ursprünglich hatte die Reaktionsmischung einen pH-Wert von 7,5, bei dem βCD über verfügbare OH-Gruppen verfügt, arg in Zwitterionenform mit einer kationischen Ladung an Guanidin- und deprotonierten Carboxylgruppen vorliegt und cpx ein kationisches Amin an Piperazinyl- und deprotonierten Carboxylgruppen aufweist (wie in Abb . 3a). Die Bildung des βCD-arg-Cpx-Komplexes beginnt mit einer säurebasierten Reaktion, bei der die Carboxylgruppen in arg mit dem kationischen Amin auf der Piperazinyl-cpx-Seite interagieren und ein arg-cpx-Salz bilden (Abb. 3b). Der Fällungskristallisationsschritt ermöglicht die Bildung langer Stabstrukturen. Auf der Oberfläche der gebildeten Kristalle stehen freie Guanidingruppen zur Bindung amorpher βCD-Komponenten und zum Aufbau des endgültigen CD-Arg-Cpx-Komplexes zur Verfügung (Abb. 3b). Amine in der Guanidin-Funktionsgruppe in Arginin haben eine sehr hohe Affinität zur Wasserstoffbrückenbindung, mit der Möglichkeit, bis zu fünf Bindungen zu bilden, an denen sowohl protonierte als auch nicht protonierte Amine beteiligt sind28. Daher spielt Arginin im gebildeten Komplex die Rolle eines Linkers, der kationische Guanidingruppen verwendet, um βCD an die Oberfläche zu binden, und ionische Carboxylgruppen, um cpx zu binden. Das Zetapotential von βCD (anfänglich bei pH = 6) ändert sich nach der Zugabe von Arginin (Tabelle in Abb. 3), was auf Wechselwirkungen zwischen kationischen Guanidin-Rückgratgruppen und OH-Gruppen an der hydrophilen Außenseite von βCD hinweist.

Molekülstrukturen der Vorläufermischung vor der Fällung (pH 7,5), Änderung des Zetapotentials für verschiedene komplexe Komponenten und Fällung nach 2 h Mischen im Fall der pH-Einstellung mit Arginin (und deren Verzögerung, wenn arg durch NaOH ersetzt wird (βCD-NaOH- cpx)) (a). Fällung (pH 6,5) mit Bildung eines arg-cpx-Salzes und βCD-Bindung, gefolgt von Kristallisation und Zusammenbau (b).

Die gebildete CD-Arg-Cpx-Komplexstruktur erscheint innerhalb von zwei Stunden nach dem Mischen aller Komponenten als glänzender opalweißer Niederschlag. Wenn βCD ohne Zugabe von Arginin direkt mit cpx gemischt wird, bleibt die Lösung klar und es kommt zu keiner Ausfällung. Die Messung des Zetapotentials des lyophilisierten Pulvers ergibt neutrale Werte, die instabilen βCD-cpx-Komplexaggregaten entsprechen. Wie bereits beobachtet, entsteht der βCD-cpx-Einschlusskomplex durch Einbau der hydrophoben 4-Oxochinolin-3-carbonsäure-Einheit des cpx-Moleküls in den hydrophoben Kegel von βCD29. Wenn der Säuregehalt der anfänglichen Reaktionsmischung durch Verwendung von NaOH (anstelle von Arginin) angepasst wurde, verlief die Ausfällung von βCD-NaOH-cpx als arg-freiem Komplex viel langsamer und fand nicht nach zwei Stunden Mischen statt, wie im Fall Fall von βCD-arg-cpx (dargestellt in Fotos in Abb. 3a), verzögerte sich jedoch in den folgenden 24 Stunden. βCD-NaOH-cpx ist ein pH-angepasster βCD-cpx-Komplex und weist nicht die für βCD-arg-cpx beobachtete Stabilität auf.

Die βCD-arg-cpx-Anordnungen emittierten intensives blaues Fluoreszenzlicht, das zusammen mit ihren stäbchenförmigen Strukturen erschien (Abb. 4a). Eine ähnliche Fluoreszenz wurde auch für βCD-cpx (das der unregelmäßig geformten Struktur des komplexen Aggregats folgt) beobachtet (Abb. 4b), jedoch nicht für βCD-arg (das ebenfalls unregelmäßige Aggregate bildet) (Abb. 4c). Bei Ciprofloxacin-Derivaten in Form sphärischer Nanoaggregate, die Perfluoraryl- und Phenylringe enthalten, die durch Amidinbindungen an die Piperazinylgruppe von Ciprofloxacin gebunden sind, wurde bereits früher beobachtet, dass sie eine aggregationsinduzierte Emission (AIE) zeigen27. Nach unserem Kenntnisstand wurde AIE in βCD-haltigen Ciprofloxacin-Komplexen jedoch bisher nicht nachgewiesen.

Blaue Fluoreszenz von cpx-haltigen (βCD-arg-cpx und βCD-cpx) Komplexen (nicht nachgewiesen für βCD-arg) (a). Fluoreszenzspektren von βCD-arg-cpx und freiem cpx (und vergleichbarem βCD-cpx-Komplex) vor und nach dem Auflösen in Wasser, die unterschiedliche Auflösungsmechanismen bestätigen (gelöster Komplex vs. gelöster freier Wirkstoff) (b). Nachweis von βCD-arg-cpx und von Bakterien (100 μg/ml des Komplexes nach 10-minütiger Exposition gegenüber P. aeruginosa PAO1, gefärbt mit Propidiumiodid (PI, rote Fluoreszenz, Nachweis toter Bakterien) (c).

Unterschiede wurden auch in den Fluoreszenzspektren von βCD-arg-cpx- und βCD-cpx-Komplexen beobachtet, insbesondere vor und nach dem Auflösen in Wasser (Abb. 4b). In festen Pulvern waren die Fluoreszenzspektren von βCD-arg-cpx und freiem cpx nicht gleich, was eine Blauverschiebung im Spektrum der Arginin-komplexierten Struktur erkennen ließ. Beim Auflösen in Wasser blieb das Spektrum von βCD-arg-cpx das gleiche wie das der festen Komplexform, während die Spektren des freien Wirkstoffs und des weniger stabilen βCD-cpx-Einschlusskomplexes rotverschoben waren und genau die gleiche Fluoreszenzform aufwiesen maximal. Eine weitere Analyse der in Wasser gelösten Komponenten ergab freies cpx (und seine in MS-Spektren identifizierten Dimere und Trimere, ergänzende Abbildung 5a), während der Komplex im Fall von βCD-arg-Cpx während der Alterung in wässriger Umgebung freies cpx freisetzte. cpx-arg, arg und βCD (Ergänzende Abbildung 5b).

Intensive blaue Fluoreszenz verleiht βCD-arg-cpx zusätzliche Detektionsfunktionen. Nach einer kurzen Exposition gegenüber dem βCD-arg-cpx-Komplex wurde die Lebensfähigkeit der Bakterien stark beeinträchtigt, was durch die rote Fluoreszenz von Propidiumiodid in einem hohen Anteil der Zellen, die tote Bakterien darstellen, nachgewiesen werden konnte. Wir konnten auch blaue Fluoreszenz der stabförmigen βCD-arg-cpx-Anordnungen nachweisen, die den Komplex mit starker antimikrobieller Aktivität freisetzte (Abb. 4c).

Auch im quantitativen Kontext unterschied sich βCD-arg-cpx vom klassischen βCD-cpx-Komplex (Abb. 5a). Wie anhand der UV-Vis-Spektren des verbleibenden cpx in der Lösung nach der Komplexbildung bestimmt, enthielt βCD-arg-cpx den dreifachen cpx-Gehalt von βCD-cpx ohne Arginin. Das Vorhandensein von Arginin und seine Rolle bei der Komplexbildung beeinflussten den Wirkstoffgehalt im Komplex. Es wurde ein 1,5-facher Unterschied im cpx-Gehalt für βCD-cpx und βCD-NaOH-cpx (Abb. 5b) beobachtet, was zeigt, dass ein Unterschied im pH-Wert den Gehalt des im Komplex enthaltenen Arzneimittels beeinflusste. Im Fall von βCD-arg-cpx war der Effekt jedoch nicht nur auf den Beitrag des pH-Werts während der Komplexbildung zurückzuführen, da die Verwendung von Arginin zur Modifizierung des pH-Werts auf das gleiche Niveau wie für NaOH im βCD-NaOH-cpx-Komplex zur Folge hatte ein doppelt so hoher cpx-Gehalt in βCD-arg-cpx.

Cpx in Überständen, die nach der Komplexsynthese erhalten wurden (und berechnete cpx-Gehalte in βCD-Komplexen) (aus dem CD-Arg-Cpx-Komplex freigesetztes Arzneimittel blau angezeigt, aus dem CD-NaOH-Cpx-Komplex in Orange und aus CD-Cpx in Schwarz) (a ) und vergleichende Arzneimittelfreisetzungskinetik von βCD-cpx (schwarz), βCD-arg-cpx (dunkelgrau) und βCD-NaOH-cpx (lithgrau) (b); n = 3; Fehlerbalken beziehen sich auf die Standardabweichung der Arzneimittelfreisetzung.

Neben seinem Beitrag zur Bildung, zum Zusammenbau und zum eingebauten Wirkstoffgehalt beeinflusste Arginin auch die Freisetzung des Wirkstoffs aus dem Komplex. In einem klassischen Einschluss-βCD-cpx-Komplex, einem weniger stabilen dynamischen Gleichgewicht zwischen dem Arzneimittel und dem hydrophoben βCD-Kegel, erfolgt die cpx-Freisetzung schnell (Abb. 5b). Nach Inkubation bei 37 °C in PBS-Puffer wurden nach 10-minütiger Inkubation mehr als 60 % des Arzneimittels freigesetzt. Die vollständige Zersetzung des Komplexes und die Freisetzung aller eingebauten cpx erfolgte innerhalb der ersten 24 Stunden. Die Freisetzungskinetik war im Fall von βCD-NaOH-cpx etwas langsamer (Abb. 5b): Die anfängliche Freisetzung betrug etwa 40 %, und am Ende von 24 Stunden setzte der Komplex bis zu 70 % des eingebauten Arzneimittels frei.

In Arzneimittelabgabesystemen (wie eingekapselten Polymerkügelchen) hängt die Arzneimittelfreisetzung von den Eigenschaften des Arzneimittelträgers ab (z. B. Abbau der Polymermatrix, Schwellung, T-/pH-abhängige Reaktion), was die physikalische Freisetzung oder Desorption des eingeschlossenen Arzneimittels ermöglicht. Im vorliegenden Fall ist das Arzneimittel als Teil des Komplexes Teil des Arzneimittelabgabesystems und seine Freisetzung hängt von der Stabilität und Löslichkeit des Komplexes ab. Aufgrund des unterschiedlichen Aufbaus war der βCD-arg-cpx-Komplex stabiler als der Einschlusskomplex aus βCD-cpx und der pH-modifizierte βCD-NaOH-cpx-Komplex und zeigte die langsamste Freisetzung (Abb. 5b). Es ist bekannt, dass die Selbstorganisation der natürlichen CDs und Wirkstoffkomplexe deren Löslichkeit beeinflusst12. Anfänglich setzte dieser Komplex nur 20 % des aufgenommenen Wirkstoffs frei, und die Freisetzung setzte sich langsam fort, wobei nach 24 Stunden bis zu 30 % des Wirkstoffs freigesetzt wurden. Die Anwendung von βCD als Hilfsstoff oder die Anwendung von Arginin zur Bildung eines Arzneimittelsalzes innerhalb von βCD-Wirkstoffkomplexen ist eine praktische Möglichkeit, die Löslichkeit des Arzneimittels zu verbessern. Im Gegensatz dazu zerfällt der neuartige βCD-arg-cpx-Komplex langsam, verringert die Arzneimittelauflösung und ermöglicht die Kontrolle über die Arzneimittelfreisetzung. Der beobachtete Beitrag zur Arzneimittellöslichkeit ist eine Folge der unterschiedlichen Bindung des Arzneimittels an die beiden anderen Komponenten (wie in Abb. 3 dargestellt). Anstatt den hydrophoben Teil des Arzneimittels in den βCD-Kegel einzubauen und Arginin an seinen hydrophilen Teil zu binden, der normalerweise außerhalb des βCD-Kegels verbleibt, wird das Arzneimittel über einen Arginin-Linker an die βCD-Oberfläche gebunden, wodurch die gesamte Struktur stabiler wird Auflösung. Darüber hinaus tragen die Kräfte, die die langen stabartigen Anordnungen von βCD-arg-cpx zusammenhalten, auch zu einer langsameren Zerlegung bei und sorgen für eine Freisetzungskontrolle. Im Gegensatz zu allen verfügbaren CD-assoziierten Plattformen zur Modifikation von Antibiotika wurde unseres Wissens nach noch nie die Möglichkeit der Verwendung von Arginin zur Schaffung eines langsam freisetzenden Antibiotika-Arzneimittelabgabesystems aus βCD eröffnet.

Nachdem wir die unkonventionelle verringerte Löslichkeit und verlangsamte Antibiotikafreisetzung aus der βCD-Arg-Cpx-Anordnung beobachtet hatten, untersuchten wir als nächstes die Wirkung des Komplexes bei der Prüfung der antimikrobiellen Wirksamkeit und Toxizität. Zunächst wurden die Anfälligkeit und die minimalen Hemmkonzentrationen (MICs) der βCD-arg-cpx- und βCD-cpx-Komplexe und ihrer Vorläuferkomponenten βCD, βCD-arg und cpx gegen mehrere Bakterienstämme, einschließlich gramnegativer E. coli, untersucht MG1655 (ATCC 47076) und P. aeruginosa PAO1 (ATCC 15692) und grampositiver S. aureus Rosenbach (ATCC 12600), wie in Tabelle 1 zusammengefasst. Keiner der untersuchten Bakterienstämme zeigte eine Anfälligkeit für βCD oder βCD-arg. Für βCD-cpx fanden wir MHK-Werte von 0,056 μM für E. coli und 0,21 μM für P. aeruginosa und S. aureus (Tabelle 1). Wenn wir den cpx-Gehalt von 19 Gew.-% in βCD-cpx und eine Wirkstofffreisetzung von bis zu 70 % während einer 24-stündigen Inkubation bei 37 °C berücksichtigen (Abb. 5b), entsprechen die MHKs 0,0074 μM und 0,028 μM freiem Wirkstoff Äquivalente. Im Vergleich zur cpx-Referenz führte der βCD-cpx-Einschlusskomplex bei allen getesteten Bakterienstämmen zu etwa 28-fachen Steigerungen der antimikrobiellen Aktivität. Die antibakterielle Wirksamkeit von βCD-arg-cpx war höher als die der anderen mit MHK-Werten von 0,0045 μM für E. coli, 0,018 μM für P. aeruginosa und 0,060 μM für S. aureus. Bei einem cpx-Gehalt von 58 Gew.-% und einer Wirkstofffreisetzung von bis zu 30 % (Abb. 5b) betrug die MHK 0,0008 μM, 0,003 μM bzw. 0,010 μM freie cpx-Äquivalente. Dementsprechend hatte βCD-arg-cpx im Vergleich zur cpx-Referenz eine 260-fach, 260-fach bzw. 78-fach erhöhte antimikrobielle Aktivität für die getesteten Bakterienstämme.

Die Zytotoxizität in Säugetierzellen wurde anhand von Lungenepithelzellen (A549) bewertet (Tabelle 1 und Abb. 6a). Der βCD-arg-cpx-Komplex wurde als ungiftig charakterisiert (mit einem hohen CC50-Wert von 2000 μg/ml (1220 μM)). Nur hohe Konzentrationsdosen (> 1000 μg/ml (610 μM)) von βCD-arg-cpx zeigten eine dosisabhängige Verringerung der Lebensfähigkeit der Zellen (Abb. 6b), was etwa 100.000–800.000-mal höheren MHK-Werten entsprach. Die Komplexierung von cpx an βCD verringert die Toxizität (Tabelle 1). Darüber hinaus ist es wichtig zu beachten, dass der Selektivitätsindex (SI) in den verschiedenen Bakterientests im Vergleich zu dem von löslichem cpx anstieg (13-fach für E. coli, 17-fach für P. aeruginosa und 42-fach für S. aureus) ( Tabelle 1). Mit anderen Worten: Während nanomolare Konzentrationen eine effiziente antimikrobielle Aktivität zeigten, waren für toxische Wirkungen millimolare Konzentrationen erforderlich, was ein umfangreiches therapeutisches Fenster für eine sichere Anwendung des Komplexes darstellte und die mögliche In-vivo-Wirksamkeit im Vergleich zu löslichem kommerziellem cpx erhöhte.

Zytotoxizität von βCD-arg-cpx und seinen Komponenten gegenüber Lungenepithel-A549-Zellen (a). Das Diagramm zeigt den Prozentsatz der Lebensfähigkeit der A549-Zellen nach Inkubation mit verschiedenen Konzentrationen von βCD-Komplexen (0 mg/ml (schwarz), 0,5 mg/ml (gemustert), 1 mg/ml (hellgrau), 1,5 mg/ml (dunkelgrau). ) und 2 mg/ml (schwarzer Rand). DMSO wurde als Positivkontrolle für Toxizität verwendet, während unbehandelte A549-Monoschichten als Negativkontrolle für Zytotoxizität verwendet wurden; n = 3; Fehlerbalken beziehen sich auf die SD der Lebensfähigkeit im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Vergleich des Wachstums von P. aeruginosa PAO1 (weiß) in Gegenwart von βCD-arg-cpx (0,03 μg/ml oder 0,020 μM) (lila), βCD-NaOH-cpx (0,2 μg/ml oder 0,132 μM) (grün). ), βCD-cpx (0,2 μg/ml oder 0,140 μM) (blau), βCD-arg (0,03 μg/ml oder 0,0023 μM) (orange) und βCD (0,03 μg/ml oder 0,0026 μM) (rosa) (b) ; n = 3; Fehlerbalken beziehen sich auf die optische Dichte SD.

Als nächstes untersuchten wir die antimikrobielle Aktivität, indem wir die MHK-Werte und die Kinetik des Bakterienwachstums analysierten, wie in Abb. 6b für den Fall von P. aeruginosa dargestellt. Weitere Einzelheiten zum Mikroverdünnungstest für βCD-arg-cpx- und βCD-cpx-Komplexe, CD-arg- und CD-Hilfskomponenten sowie zum direkten Vergleich des βCD-arg-cpx mit dem freien cpx-Arzneimittel sind in der ergänzenden Abbildung 6 dargestellt Die komplexen Komponenten βCD und βCD-Arg veränderten das Bakterienwachstum nicht. Andererseits verlangsamten βCD-cpx und βCD-NaOH-cpx (als βCD-cpx-Version, erhalten in alkalischem Medium) (mit molaren Konzentrationen von 0,140 μM bzw. 0,132 μM) bei 0,2 μg/ml das Bakterienwachstum mit klarem Bakteriostatika Wirkungen, während βCD-arg-cpx bakterizide Wirkungen bei 0,03 μg/ml (0,018 μM) ermöglichte. Diese Ergebnisse lieferten klare Beweise dafür, dass die Verbesserung der antimikrobiellen Aktivität für βCD-arg-cpx keine Folge des pH-Werts ist, bei dem der Komplex gebildet wird (obwohl βCD-NaOH und βCD-arg-cpx ähnliche Strukturen aufweisen). Darüber hinaus spiegelt es direkt die besondere Rolle von Arginin als Linker wider. Die Abnahme der MHK zwischen dem klassischen, weniger stabilen βCD-cpx-Einschlusskomplex und der stabileren βCD-arg-cpx-Anordnung kann eine Folge davon sein, wie sie sich freisetzen und zerlegen. Aufgrund schwacher Wechselwirkungen zwischen Antibiotika und βCD im Einschlusskomplex zersetzt sich der Komplex bei deren Auflösung und ermöglicht die Freisetzung des freien Arzneimittels. Wenn andererseits Arginin βCD und cpx verbindet, sind die Bindungskräfte stärker, und die Zerlegung der stäbchenförmigen Strukturen führt zu einer allmählichen Freisetzung von freiem cpx und auch von cpx-Arg als aktiverer Arzneimittelform.

In einem morphologischen Kontext beobachteten wir nach cpx- und βCD-arg-cpx-Behandlung von gramnegativen Bakterien (E. coli und P. aeruginosa) eine bakterielle Filamentierung (Abb. 7 bzw. 8). Dies war ein Beweis dafür, dass der primäre antibakterielle Mechanismus von cpx nicht verändert wurde, und es wurde auch beobachtet, wenn sich das Arzneimittel innerhalb der βCD-Arg-cpx-Komplexanordnung befand. Es ist bekannt, dass Cpx die DNA-Replikation beeinflusst, indem es auf DNA-Gyrase abzielt, die die Zellteilung von Bakterien hemmt30,31. Unter Antibiotika-induziertem Stress setzen Bakterien, die die Zellteilung stoppen, ihr Wachstum fort, indem sie die Zellteilung hemmen, ihre Länge erhöhen und lange Filamente bilden32. Abhängig von den Stressbedingungen können Bakterien in den Filamenten überleben oder sterben30. Wenn einzelne Zelleinheiten, die innerhalb eines Filaments verbunden sind, lebensfähig bleiben und lange vielzellige Ketten bilden, kommt es zu einem Stressabbau im sich entwickelnden antibiotikaresistenten Stamm31. In diesem Zusammenhang induzieren subinhibitorische cpx-Konzentrationen die Filamentierung stäbchenförmiger Bakterien als Übergangsschritt zu ihrer Entwicklung zu cpx-resistenten Stämmen32. Nach der Behandlung mit sehr niedrigen, subinhibitorischen cpx-Konzentrationen, 0,003 μg/ml (0,008 μM) in E. coli und 0,03 μg/ml (0,08 μM) in P. aeruginosa, beobachteten wir eine sehr intensive und lange Filamentierung in E. coli (Abb. 7b, e, h) (im Vergleich zur unbehandelten Referenz (Abb. 7a, d, g), während P. aeruginosa nur eine Zellverlängerung mit wenigen Fällen sehr langer Filamente zeigte (Abb. 8b, e, h) (was nicht in Referenz nachgewiesen (Abb. 8a, d, g)). Verbundene Teilungssepten, die in REM-Bildern beobachtet wurden, resultierten aus einer bakteriellen Hemmung der Zellteilung. Nur einige filamentierte Zellen waren tot, wie durch Lebend-/Tot-Färbung gezeigt wurde, während die Mehrheit blieb am Leben und überlebte den durch die niedrige cpx-Konzentration verursachten Stress (Abb. 7e, 8e). Die bakterielle Zellmembran blieb intakt (wie durch Anfärben mit FM464 nur an der Oberfläche gezeigt) und zeigte deutlich mehrere Nukleosomen entlang der Filamente (angefärbt mit). DAPI) (Abb. 7h, 8h). Wir beobachteten auch normal große Bakterien, die mit den Enden der Filamente verbunden waren (Abb. 7h), was auf eine Fehlersuche und die mögliche Bildung antibiotikaresistenter Stämme hindeutet.

Morphologie und Oberfläche von E. coli-Zellen vor (a) und nach Exposition gegenüber niedriger cpx-Konzentration (0,003 μg/ml oder 0,008 μM) (b) und Äquivalent von cpx in βCD-arg-cpx (0,003 μg/ml oder 0,002 μM) (C); Lebende E. coli, gefärbt mit lebenden/toten Farbstoffen (d) und Fraktion lebensfähiger E. coli-Zellen, behandelt mit 0,003 μg/ml (0,008 μM) cpx (e) und βCD-arg-cpx (0,002 μM) (f). Membranstruktur von Wildtyp-E. coli, gefärbt mit FM464/DAPI-Farbstoffen (g), und Bakterien, die mit 0,003 μg/ml reinem cpx (0,008 μM) (h) und CD-Arg-cpx-Komplex (0,002 μM) (i) behandelt wurden.

Morphologie und Oberfläche von PAO1-Zellen vor (a) und nach Exposition gegenüber niedriger cpx-Konzentration (0,03 μg/ml oder 0,08 μM) (b) und äquivalentem cpx in βCD-arg-cpx (0,03 μg/ml oder 0,02 μM) (c) . Lebendes P. aeruginosa PAO1, gefärbt mit lebenden/toten Farbstoffen (d) und Fraktion lebensfähiger Zellen, behandelt mit 0,03 μg/ml cpx (0,08 μM) (e) und βCD-arg-cpx (0,02 μM) (f). Membranstruktur von Wildtyp-P. aeruginosa PAO1, gefärbt mit FM464/DAPI-Farbstoffen (g) und Bakterien, behandelt mit 0,03 μg/ml reinem cpx (0,08 μM) (h) und βCD-arg-cpx-Komplex (0,02 μM) (i) .

Eine völlig andere Situation zeigte sich bei der Behandlung mit den gleichen Konzentrationen des βCD-arg-cpx-Komplexes wie bei löslichem cpx (Abb. 7, 8). In E. coli stoppte eine sehr niedrige cpx-Konzentration (0,003 μg/ml (0,002 μM) des βCD-arg-cpx-Komplexes effektiv das Bakterienwachstum und verringerte die Anzahl der filamentierten Zellen (Abb. 7c). Die Filamente enthielten intakte Zellmembranen und Multinukleosomeneinheiten (Abb. 7i). Am wichtigsten ist, dass alle nachgewiesenen Bakterien, normal groß und filamentös, als tot bestätigt wurden (Abb. 7f). Ein ähnliches Ergebnis wurde für P. aeruginosa erhalten, das einer niedrigen cpx-Konzentration ausgesetzt war (0,03 μg/ml (0,02 μM)) des βCD-arg-cpx-Komplexes. Obwohl die Anzahl der gebildeten Filamente zunahm, zeigte ein genauerer Blick auf ihre Oberfläche starke Schäden, während in ihrer Umgebung nach der Zersetzung viele Zellfragmente verblieben waren (Abb. 8c). Eine ähnliche Zersetzung von P. aeruginosa wurde nach Exposition gegenüber einer hohen cpx-Dosis (0,2 μg/ml (0,52 μM)) festgestellt, was zu einer erhöhten Membranvesikelbildung führte, die durch einen explosiven Zelllysemechanismus induziert wurde30. Wie bei E. coli beobachtet, alle filamentösen P. aeruginosa waren tot (Abb. 8f). FM646/DAPI zeigten ihre mehrkernige Struktur und Membranverformung zu Vesikeln (Abb. 8i). Die Verformung der Membran, die Vesikelbildung und die Zellschädigung durch explosive Zelllyse verliefen fortschreitend und hingen von der Konzentration des βCD-arg-cpx-Komplexes ab (ergänzende Abbildung 7). Bei niedrigeren Konzentrationen (0,03 μg/ml (0,02 μM)) wurden sowohl Filamente als auch normal große Zellen nachgewiesen. Sie alle hatten beschädigte Zellwände mit kleinen Löchern und waren teilweise in Vesikel (200 nm groß) zerlegt. Bei einem höheren βCD- arg-cpx-Konzentration (0,1 μg/ml (0,06 μM)) wurden keine Filamente mehr nachgewiesen und alle verbleibenden normalgroßen Zellen wurden vollständig in vesikelartige Zellwandfragmente mit einer Größe von etwa 100 nm lysiert. Eine fortschreitende Zellschädigung wurde angezeigt ihre Reaktion auf den zunehmenden Stress, der durch das im Komplex geladene cpx induziert wird. Ähnliche Veränderungen, einschließlich intensiver Verformungen in der Membran, Schädigung der Zellstruktur und schließlich antimikrobieller Aktivität, wenn der βCD-arg-cpx-Komplex in viel niedrigeren Konzentrationen verwendet wurde als das freie cpx-Arzneimittel wurden auch für S. aureus, einen grampositiven Stamm, beobachtet (ergänzende Abbildung 8).

Die In-vivo-Toxizität und Wirksamkeit des βCD-arg-cpx-Komplexes wurden an Galleria mellonella-Würmern (Abb. 9) als Tiermodell untersucht, das zuvor zur Bewertung der antibakteriellen Wirksamkeit und Toxikologie optimiert wurde33,34. Die Toxizität wurde bei hohen Konzentrationen des Komplexes (bis zu 2421 mg/kg) untersucht und bei allen untersuchten Konzentrationen wurde eine 100-prozentige Überlebensrate beobachtet. Für die antibakterielle Wirksamkeitsstudie wurden Würmer mit P. aeruginosa PAO135 vorinfiziert. Ohne jegliche Behandlung kam es nach 24 Stunden zu 100 % zum Tod. Die Behandlung nach der Infektion mit βCD-arg-cpx in Konzentrationen von 5 mg/kg (3,3 mM) und 10 mg/kg (6,6 M) führte zu einem Überleben von 100 %. Als Referenz führte die Behandlung mit 5 mg/ml (13,3 mM) freiem cpx nur zu einer Überlebensrate von 20 %. Die bessere Wirksamkeit der Behandlung mit dem βCD-arg-cpx-Komplex im Vergleich zum freien Arzneimittel wird außerdem durch die Tatsache gestützt, dass der Komplex nur 58 Gew.-% cpx enthält, das langsam aus den zusammengesetzten Strukturen freigesetzt wird (wie in Abb. 5 dargestellt). .

Die Toxizität des βCD-arg-cpx-Komplexes zeigt eine sehr hohe Überlebensrate der Larven im gesamten getesteten Konzentrationsbereich (bis zu 2421 mg/kg) (a). Vergleichende antibakterielle Wirksamkeitsstudie an Larven, die mit PAO1 (dunkelblau) infiziert und mit dem βCD-arg-cpx-Komplex (hellgrün und braun) und freiem cpx-Wirkstoff (dunkelgrün und violett) behandelt wurden (äquivalenter cpx-Gehalt von 5 und 10 mg cpx/ kg Larve), die ein höheres Überleben der vorinfizierten Würmer nach Behandlung mit dem Komplex (b) zeigt. Sternchen: statistisch signifikante Unterschiede zur P. aeruginosa PAO1-Kontrolle in einem Log-Rank-Test (**p-Wert < 0,01); n = 5. Diese Abbildung stellt das gleiche Experiment dar, das mehrmals wiederholt wurde und jedes Mal identische Ergebnisse lieferte.

Der grundlegende zugrunde liegende Mechanismus der antimikrobiellen Wirkung im zusammengesetzten βCD-Arg-cpx-komplexierten Arzneimittel bleibt derselbe wie der seines Arzneimittels in freier Form. Der βCD-arg-cpx-Komplex verfügt über die gleiche Fähigkeit, den Zellteilungsfortschritt zu hemmen, der typischerweise mit freiem cpx erreicht wird, und ähnliche stressbedingte Veränderungen in Bakterien hervorzurufen, wie z. B. Filamentierung und explosive Lyse, die durch Membranvesikelbildung hervorgerufen werden. Obwohl diese beiden Arzneimittelformen den gleichen Wirkmechanismus nutzen, ist ein Unterschied in ihrer Wirksamkeit offensichtlich, der auf eine unterschiedliche Bioverfügbarkeit zurückzuführen sein könnte. Das Vorhandensein der βCD-Komponente mit der bekannten Fähigkeit, die Wechselwirkungen mit Zellwandkomponenten zu verstärken12, fördert sicherlich den Arzneimitteltransfer durch die Membranen und erhöht folglich die antimikrobielle Wirksamkeit bei verfügbaren Konzentrationen innerhalb der Bakterienzelle. Wie jedoch nach einem direkten Vergleich von weniger stabilen βCD-arg-Einschlüssen und stabileren βCD-arg-cpx-Komplexen gezeigt wurde, kann der Effekt nicht ausschließlich auf die Anwesenheit von βCD zurückgeführt werden. Aufgrund der reversiblen Natur der Bindung in Einschlusskomplexen sorgt die Solubilisierung dafür, dass die freie Arzneimittelform im Gleichgewicht mit den βCD-Molekülen steht. Diese Art des Gleichgewichts verbessert den Arzneimitteltransfer durch die Membran, ist jedoch als stabilere Form des βCD-arg-cpx-Komplexes weitaus weniger wirksam. Stabileres βCD-arg-cpx, bei dem βCD und cpx über einen Arginin-Linker verbunden sind, ermöglicht es βCD, als Baukomponente des Arzneimittelmoleküls zu fungieren. Neben βCD wird die Übertragung des Arzneimittels durch die Membran auch durch das Vorhandensein von Arginin und dessen Bindung an das Arzneimittelmolekül beeinflusst.

Folglich wurde komplexiertes cpx effektiver auf sein Ziel (DNA-Gyrase) übertragen und konnte das gleiche Maß an Stress auslösen wie viel höhere Konzentrationen an freiem cpx. Wenn die Komplexkonzentrationen hoch genug waren (immer noch viel niedriger als die wirksamen Konzentrationen des freien Arzneimittels), reichten die Wechselwirkungen von βCD und Arginin, die an das Arzneimittel gebunden sind, mit Komponenten der Bakterienwand aus, um die bakterielle Zellstruktur aufzulösen und einen explosiven Lyseprozess auszulösen. All diese Fakten deuten darauf hin, dass Stress, der bei sehr geringen Konzentrationen von βCD-arg-cpx induziert wird, eine wichtige Steigerung der antimikrobiellen Aktivität ermöglicht. Detaillierte Untersuchungen des Potenzials der komplexierten Arzneimittelform zur Verhinderung adaptiver Evolutionsprozesse, die resistente Stämme produzieren, bleiben eine interessante Herausforderung für die Zukunft.

Diese innovative Art von βCD-Komplexen, bei denen Linker verwendet werden, um stabilere Verbindungen zwischen βCD und einem Medikament herzustellen, birgt das Potenzial, die Wirksamkeit zuvor zugelassener, klinisch eingesetzter Antibiotika zu verbessern. Solche Komplexe werden mithilfe sehr einfacher, technologisch anspruchsloser und äußerst wirtschaftlicher Chemie hergestellt und könnten vielversprechende Werkzeuge für die Umnutzung, Neuprofilierung oder Wiederverwendung verschiedener Arzneimittel sein. Zukünftige Forschung in diesem Bereich sollte sich auf die Erforschung aller verfügbaren Möglichkeiten konzentrieren, die durch die Verbesserung der Bioverfügbarkeit von Arzneimitteln innerhalb dieser Art von Komplex entstehen, einschließlich ihrer Fähigkeit, antibiotikaresistente Stämme zu entwickeln und zu beeinflussen, Arzneimitteltoxizität zu mildern und die Biokompatibilität zu verbessern. Solche Komplexe können zusätzliche Optionen in der Antibiotika-Pipeline bieten und die Pharmaindustrie dazu ermutigen, wirksamere Formen alter Antibiotika zu erforschen und sich aktiv an der Lösung des weltweiten Mangels an wirksamen Antibiotika als anhaltendem und sehr ernstem Gesundheitsproblem der Neuzeit zu beteiligen.

Der Komplex wurde unter Verwendung von L-Arginin (arg, L-2-Amino-5-guanidinopentansäure, C16H14N4O2, Sigma–Aldrich, Deutschland), Ciprofloxacin-Hydrochlorid (cpx, Cayman Chemical Company) und β-Cyclodextrin (βCD, Sigma–) gebildet. Aldrich C4805, Deutschland). Alle verwendeten Chemikalien und Reagenzien waren von analytischer Qualität. Alle Experimente wurden mit im Labor hergestelltem ultradestilliertem Wasser durchgeführt.

Vor der Bildung des Komplexes wurden Arginin (50 ml, 0,4 mg/ml) und Cyclodextrin (50 ml, 2 mg/ml) unter kontinuierlichem Rühren (200 U/min) 15 Stunden lang bei Raumtemperatur in Wasser gelöst. Die vorgemischten Lösungen wurden zu einer wässrigen Ciprofloxacin-Lösung (0,8 mg/ml) gegeben und das Rühren (200 U/min) wurde für die nächsten 24 Stunden fortgesetzt. Der weiße Niederschlag erschien 2 Stunden nach der Zugabe von Ciprofloxacin. Nach 24-stündigem Mischen wurde der Überstand durch Zentrifugation (8000 U/min) abgetrennt und der Niederschlag in 5 ml destilliertem Wasser redispergiert. Die Dispersion wurde in Trockeneis eingefroren (für 3 Stunden) und gefriergetrocknet (24 Stunden, Christ Alpha 1–4, Martin Christ). Kontrollproben wurden nach dem gleichen Protokoll gebildet, jedoch mit Ersatz von Arginin durch eine wässrige NaOH-Lösung, um βCD-NaOH-cpx zu bilden, und mit Ersatz von Arginin durch destilliertes Wasser, um βCD-cpx zu bilden. Aufgrund mangelnder Ausfällung in den Kontrollproben wurde das Gesamtvolumen der Mischung eingefroren und gefriergetrocknet. Alle Pulver wurden in abgedeckten Glasbehältern aufbewahrt und für weitere Tests unter Umgebungsbedingungen gelagert.

Pulverröntgenbeugungsanalysen (pXRD) wurden im 2Θ-Bereich von 2–70° mit einer Schrittweite von 0,02° und einer Aufzeichnung von 2 s pro Schritt unter Verwendung eines Bruker AXS D4 Endeavour-Diffraktometers durchgeführt. Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie-Untersuchungen (FTIR) wurden mit einem Perkin Elmer Spectrum 400 MIR-Spektrophotometer unter Verwendung der DRIFT-Technik durchgeführt. Die Spektren wurden in Pulvern aufgezeichnet, die durch Mischen von 5 mg Proben mit 80 mg KBr erhalten wurden. Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) wurde mit der Versaprobe 3 AD (Phi, Chanhassen, USA) unter Verwendung einer monochromatischen Al-Kα-Röntgenquelle durchgeführt. Für jede Messung wurden Spektren mit einer Punktgröße von 200 µm bei eingeschaltetem Ladungsneutralisator aufgenommen, während die Pellets auf ein nicht leitendes Doppelband gelegt wurden. Übersichtsspektren wurden bei einer Durchgangsenergie von 280 eV und einer Schrittweite von 1 eV gemessen, während hochauflösende Spektren bei einer Durchgangsenergie von 27 eV und einer Schrittweite von 0,025 eV gemessen wurden. Da Ladungsneutralisierung verwendet wurde, wurde die Energieskala der XPS-Spektren korrigiert, indem der C1s-Peak von Kohlenstoff auf eine Bindungsenergie von 284,8 eV verschoben wurde. XPS-Daten wurden mit der PHI Multipak-Software analysiert. Um die Oberflächenschicht des Pellets zu entfernen und die darunter liegende Oberfläche zu untersuchen, wurde die Probe mit Argonclustern zerstäubt. Die Probe wurde 1 Minute lang bei 5 kV und 20 nA über eine Fläche von 2 × 2 mm gesputtert, gefolgt von einer hochauflösenden Punktanalyse bei 200 µm. Lösungsprodukte wurden mittels Massenspektrometrie identifiziert. Die Messungen wurden mit einem hybriden Orthogonalbeschleunigungs-Flugzeit-Massenspektrometer Q-Tof PremierTM (Waters-Micromass, Manchester, UK) durchgeführt, das mit Atmosphärendruckionisationsquellen (API) ausgestattet und mit einem Ultra-Performance-Flüssigkeitschromatographen (TOF MS/ UpLC). Der Nachweis erfolgte über eine Elektrospray-Ionisationsquelle (ESI) im positiven Modus. Für die morphologische Rasterelektronenmikroskopie (REM, Nova NanoSEM) wurden Pulver in Wasser dispergiert und auf 50-nm-Filtermembranen abgeschieden, die auf Kohlenstoffband aufgeklebt und mit 5-nm-Kohlenstoff beschichtet waren. Strukturelle Transmissionselektronenmikroskopie-Analysen (TEM, Tecnai Spirit 120 kV) wurden an in Wasser dispergierten und auf Kupfergittern abgeschiedenen Proben durchgeführt. STEM-Bilder wurden mit dem Rasterelektronenmikroskop (REM) Verios 4 G HP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) im STEM-Modus aufgenommen. Für die EDS-Kartierung wurde ein energiedispersives Röntgenspektroskopiesystem (EDXS) mit Ultim Max 65-Detektor und AZtec-Software (Oxford Instruments Abingdon, Vereinigtes Königreich) verwendet. Die Fluoreszenzbildgebung wurde an wasserdispergierten Pulvern durchgeführt, die auf Objektträger getropft wurden, unter Verwendung eines inversen Nikon-Fluoreszenzmikroskops ECLIPSE Ti-S/L100 (Nikon) in Verbindung mit einer DS-Qi2-Nikon-Kamera. Zetapotentiale wurden mit einem Mavern Nanosizer gemessen.

Die antibakteriellen Tests wurden mit Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076), Pseudomonas aeruginosa PAO1 (ATCC 15692) und Staphylococcus aureus Rosenbach (ATCC 12600) durchgeführt. Die Stämme wurden über Nacht bei 37 °C in flüssigem Wachstumsmedium (Luria Bertani, LB) (Scharlab, Spanien) für E. coli und P. aeruginosa und tryptischer Sojabrühe (TSB) (Scharlab, Spanien) für S. aureus kultiviert. Bakterienproben wurden 30 s lang mit Ultraschall im Wachstumsmedium dispergiert (A = 18 %, W = 250 W, Ein:Aus = 2:1 s), um 2 mg/ml-Stammlösungen zu bilden, die weiter auf die getesteten Konzentrationen verdünnt wurden. Mikrotiterplattenvertiefungen (96-Well-Testplatte, mit Gewebekultur behandeltes Polystyrol; Costar 3595, Corning Inc., Corning, NY) wurden mit 100 μl Bakterien (OD550 = 0,05) und 100 μl der spezifischen Reihenverdünnungen der getesteten Bakterien beimpft Proben. Zu den Kontrollen gehörten Wachstumsmedium und Bakterien ohne Behandlung. Die Inkubation wurde in einem Multimode-Mikroplattenlesegerät Infinite M200 Pro (Tecan) bei 37 °C für 14 Stunden unter kontinuierlichem Orbitalschütteln durchgeführt. Das Bakterienwachstum wurde durch Messung der optischen Dichte bei 550 nm alle 15 Minuten beurteilt. Alle Konzentrationen wurden wiederholt in drei Wiederholungen getestet (n = 3).

Um die Lebensfähigkeit der Bakterien zu beurteilen, wurden die getesteten Proben 30 s lang in LB- oder TSB-Wachstumsmedium dispergiert (A = 18 %, W = 250 W, Ein:Aus = 2:1 s) und mit Bakterien auf ein Endvolumen von 1 ml gemischt (OD550 = 0,3). Nach 12-stündiger Inkubation wurden 100 μl 5 Minuten lang bei 6000 U/min zentrifugiert und der Überstand durch 25 μl Live/Dead BacLight Bacterial Viability Test (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) ersetzt, der SYTO9 und Propidiumiodid (PI) in 1X enthielt phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) im Verhältnis 1:1 und einer Konzentration von 3 × 10−6 mg/ml. Es folgte eine 15-minütige Inkubation im Dunkeln, um die Bakterien anzufärben. Fluoreszierende Bakterien wurden mit einem inversen Nikon-Fluoreszenzmikroskop ECLIPSE Ti-S/L100 (Nikon) in Verbindung mit einer DS-Qi2-Nikon-Kamera (Nikon) sichtbar gemacht.

Zur Beurteilung der Membranintegrität wurden die getesteten Proben 30 s lang in LB- oder TSB-Wachstumsmedium dispergiert (A = 18 %, W = 250 W, Ein:Aus = 2:1 s) und mit Bakterien auf ein Endvolumen von 1 ml gemischt (OD550 = 0,3). Nach 12-stündiger Inkubation wurden 100 μl 5 Minuten lang bei 6000 U/min zentrifugiert und der Überstand durch 50 μl FM 464 (N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl) ersetzt )Hexatrienyl)pyridiniumdibromid, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific)/DAPI (Diamidino-2-phenylindol (DAPI; Biotium, Fremont, CA) in Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) (enthaltend 0,4 μl 5 mg ml-1 FM 464 und 1 μl 125x DAPI. Die Proben wurden 15 Minuten lang unter Lichtschutz in Eis gefärbt und anschließend mit einem Nikon-Fluoreszenzmikroskop ECLIPSE Ti-S/L100 analysiert.

Morphologische Analysen der vom untersuchten Komplex betroffenen Bakterienzellen wurden mit FEISEM (Nova NanoSEM) durchgeführt. Einhundert Mikroliter Bakterien, die 12 Stunden lang mit dem Komplex inkubiert wurden, wurden 5 Minuten lang bei 6000 U/min zentrifugiert und fixiert, nachdem das Wachstumsmedium durch 50 μl Glutaraldehyd (3 Gew.-%) ersetzt wurde. Der Fixierungsschritt wurde 3 Stunden lang bei Raumtemperatur durchgeführt. Fixierte Bakterien wurden durch Filtration unter weichem Vakuum auf porösen Membranen abgeschieden, dreimal mit PBS gewaschen (jeweils 15 Minuten lang) und in seriell verdünntem Ethanol (30, 50, 70, 90 und 100 Gew.-%, 30 Minuten lang) dehydriert jede Konzentration). Die Proben wurden an kritischen Stellen getrocknet.

Die Tests wurden an menschlichen Lungenepithel-A549-Zellen (ATCC® CCL-185™) durchgeführt. Die Zellen wurden in DMEM/F-12 (Gibco, Thermo Fisher Scientific) kultiviert, ergänzt mit 1 % (v/v) Penicillin-Streptomycin (Gibco, Thermo Fisher Scientific) und 10 % (v/v) dekomplementiertem fötalem Rinderserum (Gibco, Thermo Fisher Scientific) und in einem befeuchteten Inkubator (Memmert) bei 37 °C und 5 % (v/v) CO2 gezüchtet. Der getestete Komplex wurde 30 s lang in DMEM mit Ultraschall dispergiert (A = 18 %, W = 250 W, Ein:Aus = 2:1 s), um eine Stammlösung (2 mg/ml) zu bilden. In einer 96-Well-Platte bis zur Konfluenz gewachsene Zellen wurden mit Reihenverdünnungen des Komplexes behandelt und 24 Stunden lang bei 37 °C in 5 % CO2 inkubiert. Der Zytotoxizitätstest wurde durchgeführt, indem 20 μl 10 x Presto blueTM Cell Viability Reagent (Molecular Probes, Invitrogen, Thermo-Fisher Scientific) pro Vertiefung zugegeben, 30 Minuten lang inkubiert und die Fluoreszenz bei Anregung λ = 560 nm und Emission λ = 590 nm aufgezeichnet wurde . Zu den Referenzen gehörten der Komplex ohne Zellen in DMEM, der reine Farbstoff in DMEM, Zellen ohne Komplex (als Negativkontrolle) und Zellen mit DMSO (als Positivkontrolle). Alle Konzentrationen wurden wiederholt in dreifacher Ausfertigung getestet (n = 3). Die Lebensfähigkeit wurde auf Zellen ohne Behandlung normalisiert (Lebensfähigkeit % gegenüber der Negativkontrolle).

Galleria mellonella-Larven, die als In-vivo-Modell35 verwendet wurden, wurden bei 34 °C bis zu einem Gewicht von 200–250 mg gezüchtet. Der untersuchte Komplex wurde während der Toxizitätsstudie mittels Ultraschall (30 s, A = 18 %, W = 250 W, Ein:Aus = 2:1 s) in PBS dispergiert, um eine 5 mg/ml-Stammlösung zu bilden. Ein 10 μl Inokulum der komplexen Dispersion (in unterschiedlichen Konzentrationen) wurde mit einer Hamilton 22-Gauge-Spritze in den oberen rechten Prolegbereich der Larven injiziert. Jede Konzentration des Komplexes wurde fünf Larven pro Testgruppe (n = 5) injiziert. Die Kontrollgruppe wurde auf die gleiche Weise mit 10 μl 1x PBS (Fisher Scientific) geimpft. Nach der Inokulation wurden die Larven bis zu 72 Stunden bei 37 °C gehalten. Die Larvensterblichkeit wurde alle 16–24 Stunden beobachtet. Die Tests wurden wiederholt durchgeführt. Die Überlebenskurven wurden mithilfe der Kaplan-Meier-Analyse aufgezeichnet und statistisch signifikante Unterschiede wurden mithilfe des einseitigen Log-Rank-Tests (GraphPad 9.0 Software) ermittelt.

Während der Wirksamkeitsstudie wurden G. mellonella-Larven 10 μl einer infektiösen Dosis von P. aeruginosa (PAO1) (6,4 × 103 KBE/ml) in den oberen rechten Prolegbereich vorinjiziert. Eine Stunde nach der Infektion wurde ein 10 μl Inokulum, das unterschiedliche Konzentrationen des getesteten Komplexes dispergiert in PBS enthielt, in das obere linke Probein injiziert. Das folgende Verfahren war das gleiche wie für die Toxizitätsstudie. Bei den Kontrollen handelte es sich um Larven, denen 1x PBS injiziert worden war (negative Kontrolle), und um Larven, denen 10 mg/kg Ciprofloxacin (ohne Komplex) injiziert worden war (positive Kontrolle). Jede getestete Gruppe enthielt fünf Larven (n = 5).

Die Experimente wurden mindestens dreifach durchgeführt und 2–3 Mal wiederholt (je nach Experiment). Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SD dargestellt. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden durch den einseitigen Log-Rank-Test (GraphPad 9.0 Software) bewertet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten. Die Quelldateien hinter den Abb. 2, 4, 5, 6 und 9 werden jeweils in den Supplementary Data 1–5-Dateien dargestellt. Die Quelldateien hinter den ergänzenden Abbildungen. 1–4 und 6 sind jeweils in den Supplementary Data 6–10-Dateien enthalten.

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Die Autoren danken Angel Blanco Blanes und Dr. Samuel Sanchez von der Gruppe „Smart Nano-Bio-Devices“ am Institut für Bioingenieurwesen Kataloniens für Zetapotentialmessungen sowie Dr. Dušan Žigon vom Zentrum für Massenspektrometrie am Jozef-Stefan-Institut für ToF-MS-Analyse. Die Europäische Kommission hat diese Arbeit im Rahmen des Marie Skłodowska-Curie Actions COFUND-Programms von Horizon 2020 (Finanzhilfevereinbarung Nr. 712754) und durch das Severo Ochoa-Programm des spanischen Ministeriums für Wissenschaft und Wettbewerbsfähigkeit (Finanzhilfe SEV-2014-0425 (2015–2019)) finanziert. ). ET wurde durch Zuschüsse des spanischen Ministerio de Economia y Competitividad (MINECO/FEDER) (RTI2018-098573-B-100), der Generalitat de Catalunya (2017SGR-1079 und CERCA-Programm), der katalanischen Mukoviszidose-Verbände und der La Caixa Foundation unterstützt . Zusätzliche finanzielle Unterstützung erhielt MV durch Zuschüsse der Slowenischen Forschungsagentur (ARRS) (Zuschüsse J2-8169, N2-0150 und P2-0091).

Abteilung für fortgeschrittene Materialien, Jozef-Stefan-Institut, Jamova 39, Ljubljana, Slowenien

Marija Vukomanovic, Lea Gazvoda, Mario Kurtjak & Blaž Jaklic

Internationale Postgraduiertenschule von Jozef Stefan, Jamova 39, Ljubljana, Slowenien

Marija Vukomanovic, Lea Gazvoda & Blaž Jaklic

Zentrum für elektronische Mikroskopie und Mikroanalyse (CEMM), Institut Jozef Stefan, Jamova 39, Ljubljana, Slowenien

Jitka Hrescak

Bakterielle Infektionen: Antimikrobielle Therapien, Institut für Bioingenieurwesen Kataloniens (IBEC), Institut für Wissenschaft und Technologie, Baldiri Reixac 15-21, 08028, Barcelona, Spanien

Laura Moya-Andérico, Maria del Mar Cendra & Eduard Torrents

Abteilung für Mikrobiologie, Abteilung für Genetik, Mikrobiologie und Statistik, Fakultät für Biologie, Universität Barcelona, 643 Diagonal Ave., 08028, Barcelona, Spanien

Eduard Torrents

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MV-Forschungskonzept, Synthese und Charakterisierung, Verfassen des ersten Entwurfs; LG XRD- und FTIR-Analysen, MK TEM- und EDS-Analysen, JH STEM- und Elementkartierungsanalyse, BJ XPS-Analyse, LM-A. In-vivo-Studie, MC-In-vitro-Toxizität, ET-Betreuung und Finanzierung. Alle Autoren haben zur Überarbeitung des Textes zur endgültigen Fassung beigetragen.

Korrespondenz mit Marija Vukomanovic oder Eduard Torrents.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt John-Sigurd Svendsen und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteurin: Christina Karlsson Rosenthal.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Vukomanovic, M., Gazvoda, L., Kurtjak, M. et al. Entwicklung eines ternären antimikrobiellen Cyclodextrin-Arginin-Ciprofloxacin-Komplexes mit erhöhter Stabilität. Commun Biol 5, 1234 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04197-9

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Eingegangen: 12. Mai 2022

Angenommen: 31. Oktober 2022

Veröffentlicht: 12. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04197-9

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