Erzeugung eines Mutatorparasiten zur Förderung der Resistomentdeckung in Plasmodium falciparum

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 3059 (2023) Diesen Artikel zitieren

1631 Zugriffe

19 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Die In-vitro-Evolution von Arzneimittelresistenzen ist ein leistungsfähiger Ansatz zur Identifizierung von Antimalaria-Zielen. Die Haupthindernisse bei der Auslösung von Resistenzen sind jedoch die Größe des Parasiten-Inokulums und die Mutationsrate. Hier versuchten wir, die genetische Diversität der Parasiten zu erhöhen, um die Resistenzselektion durch die Bearbeitung katalytischer Reste der DNA-Polymerase δ von Plasmodium falciparum zu verstärken. Mutationsakkumulationstests zeigen einen etwa 5- bis 8-fachen Anstieg der Mutationsrate, mit einem Anstieg um das 13- bis 28-fache in Leitungen unter Drogendruck. Bei Belastung mit dem Spiroindolon-PfATP4-Inhibitor KAE609 wird eine hohe Resistenz schneller und bei geringeren Inokulamengen erreicht als bei Wildtyp-Parasiten. Selektionen ergeben auch Mutanten mit Resistenz gegen eine „unwiderstehliche“ Verbindung, MMV665794, die bei anderen Stämmen keine Resistenz hervorbrachte. Wir validieren Mutationen in einem bisher nicht charakterisierten Gen, PF3D7_1359900, das wir als Chinoxalin-Resistenzprotein (QRP1) bezeichnen, als Ursache für die Resistenz gegen MMV665794 und eine Reihe von Chinoxalin-Analoga. Das erweiterte genetische Repertoire, das diesem „Mutator“-Parasiten zur Verfügung steht, kann genutzt werden, um die Entdeckung des P. falciparum-Resistoms voranzutreiben.

Die Antimalaria-Wirkstoffforschung hat aktiv nach neuen oder verbesserten Arzneimitteln zur Behandlung und letztendlichen Beseitigung von Malaria gesucht. Aktuelle Artemisinin-basierte Kombinationstherapien (ACTs) für Plasmodium falciparum an vorderster Front wurden durch das Auftreten von Parasiten beeinträchtigt, die in Südostasien, einem Epizentrum der Malariaresistenz, weniger anfällig für Artemisinin und Partnermedikamente sind1,2. Darüber hinaus stellt die Artemisinin-Resistenz eine Bedrohung für die öffentliche Gesundheit von Menschen dar, die weltweit in Endemiegebieten leben, wie jüngste Berichte über das Auftreten von Kelch13-Mutationen in ruandischen und ugandischen Isolaten zeigen, die eine verringerte Anfälligkeit für Artemisinin verursachen3,4. Viele vielversprechende Anti-Malaria-Wirkstoffe mit guter Wirksamkeit und mehrstufiger Aktivität wurden mithilfe eines phänotypischen Ganzzell-Screenings entdeckt5. Allerdings bereitet dieser Ansatz Schwierigkeiten bei der Leitstrukturoptimierung, da das molekulare Ziel nicht bekannt ist. Ein tieferes Verständnis des Wirkstoffziels, der Wirkungsweise und des Resistenzmechanismus könnte zur Entwicklung besserer Medikamente führen, die Medikamentenresistenzen standhalten6,7,8. Darüber hinaus liefert die Kenntnis des Arzneimittelziels oder des Resistenzgens molekulare Marker für die Überwachung der genomischen Epidemiologie vor Ort, um die Ausbreitung und Eindämmung von Arzneimittelresistenzen zu überwachen9,10.

Die In-vitro-Evolution von Arzneimittelresistenzen, gefolgt von einer Analyse des gesamten Genoms, ist zu einem Schlüsselansatz für die Identifizierung von Arzneimittelzielen geworden, da sie dabei hilft, Wirkungsweisen sowie Mechanismen und Neigungen zur Resistenz zu definieren11,12,13. Eine typische In-vitro-Resistenzselektion wird unter Verwendung von Parasiten-Inokula im Bereich von 105 bis 109 Parasiten durchgeführt, die einer Antimalariaverbindung in einer Konzentration ausgesetzt werden, die in der Lage ist, alle arzneimittelempfindlichen Parasiten abzutöten8,14,15. Wiederkehrende Parasiten können dann einer Sequenzierung des gesamten Genoms unterzogen werden, um das zugrunde liegende Gen zu identifizieren, das für den Resistenzphänotyp verantwortlich ist. Das Haupthindernis für den Erfolg ist die anhaltende oder in manchen Fällen völlige Unfähigkeit, resistente Parasiten zu selektieren, unabhängig vom Selektionsschema oder Stammhintergrund. Bei diesem arbeits- und zeitintensiven Prozess gelingt es daher möglicherweise nicht, ein molekulares Ziel oder einen definierten Wirkmechanismus für gesuchte Verbindungen zu identifizieren. Beispielsweise ergaben in einer Reihe von In-vitro-Resistenzselektionen mit 48 Verbindungen durch das Malaria Drug Accelerator Consortium (MalDA) 23 Verbindungen resistente Parasiten, wobei nach 15–300 Tagen eine Resistenz beobachtet wurde16. Verbindungen, die auch nach mehreren Versuchen und Bedingungen keine resistenten Parasiten hervorbringen, werden als „unwiderstehlich“ bezeichnet17. Obwohl es mehrere mögliche Gründe dafür geben kann, dass Verbindungen scheinbar „unwiderstehlich“ sind, ist ihre geringe Resistenzneigung aus Sicht der Wirkstoffforschung gegen Malaria eine attraktive Eigenschaft, und daher wären Einblicke in ihren Wirkungsmechanismus wertvoll.

Die Fähigkeit, einen Parasiten mit einer schützenden Mutation auszuwählen, hängt zumindest teilweise von der Größe des Inokulums mit ausreichender genetischer Variation ab. Aus Gründen der technischen Praktikabilität ist das maximale Inokulum für In-vitro-Resistenzselektionen jedoch typischerweise auf ~5 × 109 Parasiten pro Flasche (~10 % Parasitämie mit 3 % Hämatokrit in einer 170-ml-Kultur) begrenzt, was um Größenordnungen weniger ist, als möglich ist treten bei einem infizierten Menschen auf. Größere Kulturgrößen und längere Selektionszeiten verbrauchen auch mehr Verbindung, was möglicherweise einschränkend ist. Mehrere Laborstämme sowie Feldisolate, die im Epizentrum der Arzneimittelresistenz im Westen Kambodschas gesammelt wurden, weisen nachweislich einen ähnlichen Mutationsratenbereich von etwa 10−9 bis 10−10 Basensubstitutionen pro Stelle und asexuellem Lebenszyklus auf18,19, 20,21.

In dieser Arbeit verwenden wir CRISPR-Cas9, um einen mutierten Dd2-Parasiten von P. falciparum zu erzeugen, der eine mangelhafte Korrekturleseaktivität der DNA-Polymerase aufweist, um die in einem bestimmten Kulturvolumen repräsentierte genetische Vielfalt zu erhöhen und möglicherweise den experimentellen Zeitrahmen der Selektion zu verkürzen δ-katalytische Untereinheit, inspiriert von einem ähnlichen Ansatz beim Nagetier-Malariaparasiten Plasmodium berghei22,23. Wir zeigen, dass diese manipulierte P. falciparum-Linie eine erhöhte Mutationsrate aufweist, was das Inokulum verringert und die Zeit verkürzt, die erforderlich ist, um eine Resistenz gegen KAE609, eine Verbindung mit einem bekannten Ziel, zu selektieren24. Bei der Herausforderung mit einer zuvor identifizierten unwiderstehlichen Verbindung MMV665794, die zuvor bei der Selektion mit Wildtyp-3D7- und Dd2-Parasiten versagt hatte16,25, erhalten wir mehrere resistente Klone mit Mutationen in einem Gen unbekannter Funktion, PF3D7_1359900. Die CRISPR-Cas9-Bearbeitung dieser Kandidatenmutationen in Wildtyp-Parasiten verleiht der ausgewählten Linie ein ähnliches Maß an Resistenz, was die Rolle dieses Gens bei der Resistenz gegen Verbindungen auf Chinoxalinbasis zeigt. Unsere Ergebnisse unterstützen das Potenzial dieses „Mutator“-Parasiten, neue Antimalaria-Ziele zu identifizieren und Arzneimittelresistenzmechanismen zu verstehen.

Um das genetische Repertoire von P. falciparum-Parasiten in Kultur zu erweitern, wollten wir aus der katalytischen Untereinheit der DNA-Polymerase δ (PF3D7_1017000) Parasiten mit beeinträchtigter 3ʹ−5ʹ-Korrekturleseaktivität erzeugen, um das Niveau basaler spontaner Mutationen zu erhöhen über frühere Arbeiten zu Hefe und dem Nagetier-Malariaparasiten Plasmodium berghei22,23,26. Die replikative DNA-Polymerase δ mit hoher Wiedergabetreue ist ein wichtiges Enzym für die Synthese des nacheilenden Strangs und enthält eine 3ʹ-5ʹ-Exonukleaseaktivität, die während der DNA-Replikation falsch eingebaute Nukleotide herausschneiden kann27,28. Die Störung zweier konservierter katalytischer Reste der Exonukleasedomäne der DNA-Polymerase δ (ergänzende Abbildung 1) führt zu einer beeinträchtigten 3ʹ-5ʹ-Korrekturleseaktivität, was zu einer verringerten Wiedergabetreue bei der DNA-Replikation führt. Dies führt zu einer Zunahme der Nukleotidsequenzvariation und einer höheren Mutationsrate im Genom29,30. Die beiden konservierten katalytischen Reste der 3ʹ−5ʹ-Korrekturleseuntereinheit von P. falciparum, D308 und E310, wurden mithilfe von CRISPR-Cas9 im Dd2-Stammhintergrund durch Alanin ersetzt (Abb. 1A, B).

A Die D308- und E310-Reste wurden in P. falciparum Dd2 durch Alanin ersetzt, indem das pDC2-Cas9-gRNA-Plasmid verwendet wurde, das die sgRNA, Cas9 und die Donor-Matrize enthielt. Die beiden sgRNA-Bindungsstellen und die stillen Schildmutationen sind angegeben. B CRISPR-Cas9-editierte Parasiten wurden mit 5 nM WR99210 selektiert und editierte Klone wurden durch limitierende Verdünnung isoliert. Drei klonale mutierte DNA-Polymerase-δ-Parasiten (Dd2-Polδ) wurden für die Gesamtgenomsequenzierung und den Mutationsakkumulationstest ausgewählt. C Fitness des Dd2-Polδ-Mutantenparasiten. Wettbewerbsfitnesstests mischten die fluoreszierende Referenzlinie Dd2-GFP im Verhältnis 1:1 mit entweder Dd2-WT oder Dd2-Polδ-Klon H11. Das Wachstum wurde über einen Zeitraum von insgesamt 20 Tagen alle zwei Tage durchflusszytometrisch bestimmt, wobei der Anteil der GFP-positiven Parasiten im Vergleich zur Gesamtzahl der infizierten Erythrozyten mit MitoTracker Deep Red ermittelt wurde. Es wurden zwei unabhängige biologische Experimente (n = 2) mit technischen Dreifachversuchen durchgeführt, die Daten werden als Mittelwerte +/−SD dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Es wird vorausgesagt, dass die DNA-Polymerase δ von P. falciparum für das Überleben des Parasiten essentiell ist31. Um zu untersuchen, ob die Abschaffung der Korrekturlesefunktion der DNA-Polymerase δ dem Parasiten Fitnesskosten verursachte, führten wir einen kompetitiven Fitnesstest durch. Als Wachstumsreferenz wurde Dd2-GFP verwendet, ein manipulierter Parasit, der das grün fluoreszierende Protein (GFP) stark exprimiert32. Die Referenz-Dd2-GFP-Linie wurde im Verhältnis 1:1 entweder mit Dd2-Wildtyp (Dd2-WT) oder der Dd2-DNA-Polymerase-δ-Mutante (Dd2-Polδ) gemischt und die relativen Anteile der beiden Linien wurden durch Durchfluss gemessen Zytometrie alle zwei Tage für 20 Tage (~10 Generationen). Dd2-Polδ zeigte im Vergleich zu Dd2-WT nur eine leicht verringerte Fitness, basierend darauf, wie schnell jede Linie die sich langsamer vermehrende Dd2-GFP-Referenz übertreffen konnte (Abb. 1C).

Um Veränderungen in der Vielfalt der Nukleotidsequenzen und der Mutationsrate zu testen, führten wir einen Mutationsakkumulationstest in Kombination mit der Sequenzierung des gesamten Genoms durch (Abb. 2A) und verglichen Dd2-Polδ mit Dd2-WT. Drei Klone von Dd2-Polδ (E8, F11, H11) und ein Klon von Dd2-WT wurden 100 Tage lang (~ 50 Generationen) kontinuierlich in Vollmedium kultiviert (Abb. 2A). Alle 20 Tage wurden Parasiten gesammelt und Klone durch begrenzte Verdünnung isoliert. Insgesamt 12 Klone von Dd2-WT und 37 Klone von Dd2-Polδ, entsprechend einem bis drei Klonen pro Zeitpunkt, wurden zufällig für die Sequenzierung des gesamten Genoms ausgewählt. Die Genome aller Parasiten wurden auf das Dd2-Referenzgenom (PlasmoDB-44_PfalciparumDd2_Genome) abgebildet. Das Dd2-Kerngenom, das kodierende und nicht-kodierende Regionen umfasst, wurde als Referenz für Einzelnukleotidvarianten-Aufrufe (SNV) verwendet. Die Varianten der Oberflächenantigen-Genfamilie (var) und die subtelomere Region aller Chromosomen wurden aus dem Kerngenom ausgeschlossen. Die Koordinaten des Dd2-Kerngenoms sind in der Ergänzungstabelle 1 definiert. Die De-novo-SNVs für jeden der Klone wurden durch Vergleich mit ihren Elternlinien am Tag 0 bestimmt. Die Anzahl der De-novo-SNVs in Dd2-WT lag im Durchschnitt unter 1 SNV pro Klon in der kodierenden Sequenz über den 100-tägigen Kulturzeitraum. Im Gegensatz dazu hatte jeder der Dd2-Polδ-Klone durchschnittlich 3–6 SNVs pro Klon in kodierenden Regionen (Exom) (Abb. 2B, ergänzende Abb. 2A, B und ergänzende Tabelle 2 und ergänzende Daten 1). Der Unterschied in der Anzahl der SNVs in nicht-kodierenden Regionen zwischen Dd2-WT- und Dd2-Polδ-Klonen war weniger ausgeprägt (Abb. 2B). Dennoch wies jeder der Dd2-Polδ-Klone eine größere Anzahl von SNVs aller Art auf, insbesondere nicht-synonyme Varianten, die über alle 14 Chromosomen verteilt waren (Abb. 2C und ergänzende Abb. 3A, B). Wir untersuchten, ob es Cluster von Mutationen gab (die innerhalb von 20 bp auftraten) und identifizierten 12 Beispiele, diese befanden sich jedoch alle in AT-reichen intergenen Regionen (Ergänzungstabelle 3). Wir identifizierten nur vier Gene, die mehrere Missense-Mutationen enthielten (ergänzende Abbildung 3C). Der Vergleich der Basenpaarsubstitutionen für Übergangsereignisse (Ts) und Transversionsereignisse (Tv) zeigte eine moderate Abnahme des Ts:Tv-Verhältnisses in Dd2-Polδ und einen Anstieg der G:C → A:T-Übergänge um das 2- bis 4-fache (ergänzende Abbildung). . 4A, B).

Ein Mutationsakkumulationstest, der Dd2-WT mit drei Klonen von Dd2-Polδ vergleicht. Alle Linien wurden 100 Tage lang (~50 Generationen) parallel kultiviert. Alle 20 Tage wurden Proben der Parasiten zur klonalen Isolierung entnommen und anschließend zur genomischen DNA-Extraktion geerntet. Die Sequenzierung des gesamten Genoms wurde an Proben durchgeführt, die am Tag 0, 20, 40, 60, 80 und 100 gesammelt wurden identifiziert durch Subtrahieren von den am Tag 0 gefundenen SNVs. Jeder Punkt stellt einen Klon dar, wobei n = die folgende Anzahl unabhängiger Klone (WT:12, E8:12, F11:14, H11:11). Die Mittellinie wird angezeigt und das 25./75. Perzentil wird durch das Kästchen begrenzt, wobei die Whiskers Min-Max anzeigen. Ein zweiseitiger Wilcoxon-Matched-Pairs-Signed-Rank-Test zeigte statistisch signifikante Unterschiede für die Dd2-Polδ-Klone im Vergleich zu Dd2-WT mit den angegebenen p-Werten (a:0,0049; b:0,0015; c:0,002; d:0,002; e:0,002; f:0,0298; g:0,0005; h:0,001). C Genomische Position von SNVs, Farbcode nach Parasitenlinie. D Die Mutationsraten von Dd2-WT (n = 12) und Dd2-Polδ-Klon E8 (n = 12), F11 (n = 14) und H11 (n = 11), Daten werden als Mittelwert + /−SD (mit) dargestellt (Werte und 95 %-Konfidenzintervalle siehe Tabelle 1). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Als nächstes bestimmten wir die Mutationsraten für Dd2-WT und die drei Dd2-Polδ-Klone E8, F11 und H11 basierend auf der mittleren Anzahl von De-novo-SNVs für alle Klone jeder Linie pro Generation, pro Genom oder Exom (siehe Methoden). Jeder der Dd2-Polδ-Klone zeigte höhere Mutationsraten als Dd2-WT und variierte vom 2–3-fachen im Kerngenom (kodierende und nicht-kodierende Regionen) bis zum 5–8-fachen in den kodierenden Regionen (Exom) (Abb. 2D, Tabelle 1 und ergänzende Daten 2). Die Dd2-Polδ-Klone F11 und H11 zeigten eine höhere Mutationsrate als Klon E8 (Abb. 2D und Tabelle 1), und daher wurden alle nachfolgenden Experimente mit Klon H11 durchgeführt. Um zu untersuchen, ob die geringfügigen Unterschiede in der Mutationsrate zwischen Klonen auf spontane Mutationen in DNA-Reparaturgenen zurückzuführen sind, haben wir auch untersucht, ob Gene, die eine Rolle bei der DNA-Reparatur spielen, während der 100-tägigen Kulturperiode in den Dd2-Polδ-Linien mutiert waren ( Ergänzende Daten 1). Obwohl in jeder der Dd2-Polδ-Linien SNVs innerhalb oder in der Nähe von DNA-Reparaturgenen beobachtet wurden, wurde kein einziges SNV von allen Klonen gemeinsam genutzt. Der Dd2-Polδ-Klon E8 besaß SNVs in der kodierenden Region von zwei mutmaßlichen DNA-Reparaturgenen: eine G435E-Änderung in der DNA-Polymerase Theta (PfDd2_130037000) und eine N420K-Änderung im DNA-Reparaturprotein RHP16 (PfDd2_120056000). Der Dd2-Polδ-Klon F11 hatte eine P225L-Änderung in der RuvB-ähnlichen Helikase 3 (PfDd2_130068000). Der Dd2-Polδ-Klon H11 wies keine SNVs in der kodierenden Region von DNA-Reparaturgenen auf; Allerdings wurde ein SNV in der nichtkodierenden Region in der Nähe des proliferierenden Zellkernantigens 2 (PfDd2_120031600) beobachtet (Ergänzungsdaten 1).

Basierend auf der Annahme, dass ein vielfältigeres genetisches Repertoire, das den Dd2-Polδ-Kulturen zur Verfügung steht, die Effizienz der Selektion arzneimittelresistenter Parasiten erhöhen würde, führten wir ein Proof-of-Concept-Experiment durch, in dem wir Dd2-WT mit Dd2-Polδ unter Verwendung eines Arzneimittels verglichen eine gut beschriebene Wirkungsweise. KAE609 (Cipargamin), das sich derzeit in klinischen Phase-II-Studien befindet, zielt auf das P-Typ-Natrium-ATPase-4-Gen (Pfatp4, PF3D7_1211900) von P. falciparum mit SNVs ab, die bekanntermaßen Resistenz verleihen24. Eine In-vitro-Arzneimittelresistenzselektion wurde mit einer Reihe von Ausgangsinokula durchgeführt, die auf 2 × 106, 2 × 107, 2 × 108 und 1 × 109 parasitierte Zellen eingestellt waren und in Gegenwart von 2,5 nM KAE609 (~5-facher IC50 von Dd2) kultiviert wurden -WT) in drei unabhängigen Flaschen pro Inokulum.

Nach 5 Tagen medikamentöser Behandlung wurden mikroskopisch keine lebensfähigen Parasiten nachgewiesen. Ein Wiederauftreten von Dd2-WT wurde nur mit dem höchsten Ausgangsinokulum von 1 × 109 beobachtet, wobei Parasiten an den Tagen 18, 21 und 30 in den drei unabhängigen Selektionsflaschen beobachtet wurden. Im Gegensatz dazu brachte die Dd2-Polδ-Linie am 12. Tag Parasiten zurück, und zwar mit einem geringeren Ausgangsinokulum (Abb. 3A). Alle drei Flaschen mit 2 × 108 und 1 × 109 Parasiten waren positiv, und einer von drei Flaschen mit 2 × 107 Parasiten zeigte am 12. Tag auch rekrudierende Parasiten. Keiner der drei Flaschen war positiv auf Parasiten mit dem Ausgangsinokulum von 2 × 106 (Abb. 3A).

Ein Dd2-WT (blaue Linie) und Dd2-Polδ (rote Linie) wurden kontinuierlich in Gegenwart von 2,5 nM KAE609 (5 × IC50) kultiviert. Die Parasiten-Inokula lagen zwischen 2 × 106 und 1 × 109 Zellen in Dreifachflaschen, und Parasiten wurden über den 30-tägigen Selektionszeitraum mikroskopisch nachgewiesen. Dd2-Polδ-Parasiten wurden am 12. Tag mit dem Ausgangsinokulum von 2 × 107, 2 × 108 und 1 × 109 beobachtet, wohingegen Dd2-WT-Parasiten nur mit dem 109-Inokulum nachgewiesen wurden und in drei Flaschen am 18., 21. und 30. Tag auftraten , jeweils. B Dosis-Wirkungs-Kurven von KAE609 für Elternlinien, die keinem Drogendruck ausgesetzt waren, und drogenselektierte Linien (R1-R3) für Dd2-WT (linkes Feld) und Dd2-Polδ (rechtes Feld). Dargestellt ist ein repräsentativer Test (mit zwei technischen Replikaten, Fehlerbalken zeigen SD), wobei die IC50-Werte als Mittelwert +/−SD dargestellt sind, abgeleitet aus den folgenden biologischen Replikaten (Dd2-WT, n = 6; Dd2-R1, n = 3; Dd2-R2, n = 3; Dd2-R3, n = 3; DNA-Polδ, n = 6; Polδ-R1, n = 6; Polδ-R2, n = 6; Polδ-R3, n = 5). C AlphaFold-Modell von PfATP4, das KAE609-Resistenzmutationen zeigt, die sich in oder in der Nähe der Transmembrandomänen befinden. Blaue Reste stammten von Dd2-WT-Selektionen, rote von Dd2-Polδ. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Vor der Selektion hatten sowohl die Dd2-WT- als auch die Dd2-Polδ-Elternlinie einen ähnlichen IC50-Wert von etwa 0,3–0,6 nM. Die KAE609-selektierten Linien aus dem Dd2-WT-Hintergrund hatten IC50-Werte im Bereich von 3–9 nM (Abb. 3B). Im Vergleich dazu waren die arzneistoffselektierten Linien aus dem Dd2-Polδ-Hintergrund deutlich resistenter mit IC50-Werten um 700–900 nM (Abb. 3B), drei Größenordnungen höher als ihre Elternlinie.

Um die Resistenzdeterminanten zu identifizieren, die diese Phänotypen bestimmen, wurde der Satz ausgewählter Linien durch Sequenzierung des gesamten Genoms sowie durch direkte Sanger-Sequenzierung des pfatp4-Gens untersucht. Beide Ansätze ergaben Mutationen in pfatp4 (PF3D7_1211900) in diesen resistenten Linien, die Proteinmutationen bei L350H und G199V im Dd2-WT-Hintergrund aus Flasche 1 bzw. Flasche 3 und G358S in allen Linien aus dem Dd2-Polδ-Hintergrund verursachten (Supplementary Data). 3). Alle drei Mutationen liegen voraussichtlich innerhalb oder in der Nähe der PfATP4-Transmembranregion33 (Abb. 3C). Die Mutationen L350H und G358S wurden zuvor aus einem In-vitro-Resistenzexperiment in Dd2 bzw. 3D7 mit dem Dihydroisochinolon SJ733, einer weiteren Verbindung, die auf PfATP434 abzielt, berichtet. L350H wurde auch mit KAE609 in einem kambodschanischen Isolat selektiert25. Zusätzlich zu PfATP4 wurden nicht-synonyme SNVs in fünf weiteren Genen beobachtet (Supplementary Data 3), was zeigt, dass bei der Auswahl mit der Dd2-Polδ-Linie möglicherweise zusätzliche Kriterien erforderlich sind, um Kandidaten zu priorisieren, wenn keine Vorkenntnisse über das Ziel verfügbar sind. Von den fünf zusätzlichen Genen (PF3D7_0318500, PF3D7_0520800, PF3D7_1002200, PF3D7_1004200, PF3D7_1428400) wurde auch in einigen Klonen des Mutationsakkumulationsexperiments ohne Medikament beobachtet und ist daher wahrscheinlich eine Hintergrundmutation.

Insgesamt bestätigten diese Ergebnisse, dass die Dd2-Polδ-Linie im erwarteten molekularen Ziel nach arzneimittelresistenten Parasiten selektieren kann24,25,34, mit einer geringeren Anzahl an Ausgangsparasiten (2 × 107 vs. 1 × 109) und in einem kürzeren Selektionszeitraum als Dd2-WT (12 Tage vs. 18–30 Tage).

Als nächstes haben wir die Dd2-Polδ-Linie mit einer „unwiderstehlichen“ Verbindung herausgefordert. Die „unwiderstehliche“ Verbindungsklasse bezieht sich im Allgemeinen auf Verbindungen, die bei der In-vitro-Selektion mit Standardstämmen (typischerweise Dd2 oder 3D7) keinen arzneimittelresistenten Parasiten ergeben. Die Aufklärung des Wirkungsmechanismus dieser Verbindungen ist aufgrund ihrer geringen Resistenzneigung von großem Interesse35. MMV665794, auch bekannt als TCMDC-124162 (2-N,3-N-Bis[3-(trifluormethyl)phenyl]chinoxalin-2,3-diamin), ist ein Chinoxalin-Gerüst-Antimalariamittel, das in einem phänotypischen Hochdurchsatz-Screening identifiziert wurde36. Erste In-vitro-Arzneimittelresistenzselektionen wurden mit dieser Verbindung in Wildtyp-3D7- und Dd2-Stämmen unter Verwendung unterschiedlicher Ansätze durchgeführt, jedoch ohne Erfolg (Ergänzungstabelle 4).

Wir behandelten Dd2-Polδ und Dd2-WT intermittierend mit 95 nM (1 × IC50) der Chinoxalinverbindung. Um die Chance, eine resistente Linie zu erhalten, zu maximieren, verwendeten wir ein hohes Ausgangsinokulum von 1 × 109 Parasiten pro Kolben in dreifacher Ausfertigung (Abb. 4A). Nach 10–12 Tagen Druck konnten für beide Linien keine Parasiten mikroskopisch nachgewiesen werden, und der Arzneimitteldruck wurde nach dem 20. Tag entfernt. Dd2-WT erholte sich im Einklang mit den vorherigen Tagen während der 60-tägigen Expositionsdauer nicht (Abb. 4A). erfolglose Auswahlen (Ergänzungstabelle 4). Im Gegensatz dazu erholten sich alle drei Flaschen der Dd2-Polδ-Linie am 21. Tag. Die Wirkstoffkonzentration wurde dann auf 2 × IC50 erhöht, was zu einer Unterdrückung der Parasiten führte. Am 40. Tag wurden die Kulturen auf drogenfreies Komplettmedium umgestellt und am 60. Tag wurden in allen drei Flaschen erneut Parasiten nachgewiesen. Klonlinien, die aus den arzneimittelselektierten Parasiten isoliert wurden, hatten einen etwa 2–2,5-fach erhöhten IC50-Wert im Vergleich zur Elternlinie, die keinem Arzneimitteldruck ausgesetzt war (Abb. 4B). Die Parasiten aus zwei Flaschen vermehrten sich normal, wenn sie erneut einem konstanten Arzneimitteldruck von 2 × IC50 ausgesetzt wurden, aber die Parasiten im dritten Kolben überlebten nicht.

Ein Selektionsschema, das die Unfähigkeit zeigt, mit Dd2-WT eine Resistenz gegen MMV665794 zu entwickeln, aber eine erfolgreiche Isolierung der Resistenz mit Dd2-Polδ. Oberes Feld: Dd2-WT, 60 Tage lang 1 × IC50 (95 nM) ausgesetzt. Unteres Feld: Der Dd2-Polδ-Selektionsdruck wurde auf 2 × IC50 (190 nM) erhöht, wobei nach 60 Tagen in 3 unabhängigen Kolben ein Wiederauftreten beobachtet wurde, aber nur 2 von 3 Kolben konnten unter Arzneimitteldruck stabil wachsen. Wiederkehrende Parasiten wurden mit 3× und 4× IC50 weiter herausgefordert, überlebten jedoch nicht. B Dosis-Wirkungs-Kurven von MMV665794 für Elternlinien und die beiden resistenten Linien (C1-2), die unter 2 × IC50-Druck überleben konnten. Dargestellt ist ein repräsentativer Assay (zwei technische Replikate, Fehlerbalken zeigen SD), wobei die IC50-Werte als Mittelwerte +/−SD dargestellt sind, abgeleitet aus den folgenden biologischen Replikaten (DNA-Polδ, n = 7; Polδ-R1, n = 5; Polδ-R2, n = 5). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um zu untersuchen, ob eine höhere Resistenz erreicht werden konnte, wurden die Parasitenkulturen aus zwei rekrudierenden Flaschen jeweils in zwei weitere Flaschen aufgeteilt (jeweils mit 4,5 × 108 Parasiten), die einem weiteren Druck von entweder 3 × IC50 oder 4 × IC50 ausgesetzt wurden. Bei beiden Behandlungen starben die Parasiten nach 4 Tagen ab und wurden anschließend in drogenfreiem Komplettmedium kultiviert (Abb. 4A). Allerdings erholten sich nach 60 Tagen keine Parasiten, was darauf hindeutet, dass gegen MMV665794 nur eine geringe Resistenz erreicht werden konnte.

Um die ursächlichen Resistenzmutationen in den mit MMV665794 ausgewählten Linien zu identifizieren (Abb. 4), führten wir eine Sequenzierung des gesamten Genoms an sechs Klonen durch, die aus zwei unabhängigen Selektionen isoliert wurden. Das einzige mutierte Gen, das allen Chinoxalin-selektierten Linien gemeinsam war, war PF3D7_1359900 (PfDd2_130065800), das für ein konserviertes Plasmodium-Membranprotein unbekannter Funktion kodierte. Das Protein aus 2126 Aminosäuren kodiert für vier vorhergesagte Transmembrandomänen (Abb. 5A). Jeder der 6 Klone enthielt einen von zwei unterschiedlichen SNVs, entweder G1612V (vier Klone aus Flasche 2) oder D1863Y (zwei Klone aus Flasche 3), entsprechend G1616V bzw. D1864Y in Dd2 (Abb. 5A und ergänzende Daten 3). In arzneimittelselektierten Klonen wurden keine neuen Kopienzahlvarianten festgestellt (Supplementary Data 4).

Ein PfQRP1 (PF3D7_1359900) kodiert für ein 250-kDa-Protein mit vier vorhergesagten Transmembrandomänen. Die beiden Mutationen G1612V und D1863Y, die in zwei unabhängigen Selektionen mit MMV665794 gefunden wurden, befinden sich in einer C-terminalen Domäne, die die gleiche Konservierung wie α/β-Hydrolasen aufweist. B Modell der C-terminalen 656 Reste (1471–2126) von PfQRP1, das die mutmaßliche katalytische Triade von Ser-Asp-His (gelb) und die G1612V- und D1863Y-Resistenzmutationen (lila) zeigt. C, D IC50-Werte von CRISPR-Cas9 bearbeitetem QRP1. Dd2-Linien, die die äquivalenten G1612V- und D1863Y-Mutationen kodieren, zeigten im Vergleich zu Dd2-WT und still bearbeiteten Kontrollen eine deutlich verringerte Anfälligkeit gegenüber MMV665794 und waren kreuzresistent gegenüber MMV007224, einem strukturell verwandten Molekül, das das Chinoxalingerüst teilt. Jeder Punkt stellt ein biologisches Replikat dar, mit n = 6 unabhängigen Replikaten mit angezeigtem Mittelwert ± SD und statistischer Signifikanz im Vergleich zu stillschweigend bearbeiteten Kontrollen, bestimmt durch zweiseitigen Mann-Whitney-U-Test. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um einen Einblick in die potenzielle Funktion von PF3D7_1359900 zu erhalten, das nur innerhalb der Apicomplexa offensichtliche Orthologe aufweist (ergänzende Abbildung 5), haben wir mit trRosetta und AlphaFold ein Strukturmodell der Region untersucht, die die Resistenzmutationen enthält. Diese Region befindet sich in Richtung des C-Terminus des Proteins, stromabwärts der 4 vorhergesagten Transmembransegmente (Abb. 5A). Der Vergleich der Proteinstruktur mithilfe des DALI-Servers zeigte eine mögliche strukturelle Homologie mit Esterasen/Lipasen an, wobei sich eine mutmaßliche katalytische Ser-Asp-His-Triade in unmittelbarer Nähe des Proteinmodells befand und über Orthologe hinweg hoch konserviert war (Abb. 5B und ergänzende Abb. 5). Es sind jedoch weitere Studien erforderlich, um die mögliche Hydrolaseaktivität zu charakterisieren.

Um die durch Medikamente ausgewählten Mutationen in PF3D7_1359900 zu validieren, haben wir CRISPR-Cas9-bearbeitete Linien generiert, indem wir das Dd2-Äquivalent der G1612V- oder D1863Y-Mutation eingeführt haben. Darüber hinaus wurden Kontrollparasitenlinien generiert, die nur mit den entsprechenden stillen Mutationen (G1612sil und D1863sil) und den allen editierten Linien gemeinsamen gRNA-Schutzmutationen modifiziert wurden. Beide mutierten Linien, jedoch nicht die stillen Kontrollen, zeigten die gleiche geringfügige Verschiebung von IC50 zu MMV665794, die bei den arzneimittelselektierten Parasiten beobachtet wurde (Abb. 5C).

Um zu untersuchen, ob Mutationen in PF3D7_1359900 im Zusammenhang mit anderen In-vitro-Evolutionsexperimenten aufgetreten sind, untersuchten wir die Datenbank der SNVs, die vom Malaria Drug Accelerator Consortium in 262 P. falciparum-Linien identifiziert wurden, die mit 37 Verbindungen ausgewählt wurden, und identifizierten einen einzelnen Klon mit einer Frameshift-Mutation am Rest D100 von PF3D7_135990016. Bemerkenswerterweise wurde der Klon mit MMV007224 unter Druck gesetzt, einer Verbindung mit einem ähnlichen Chinoxalingerüst wie MMV665794 (Abb. 5D). Das Vorhandensein einer Frameshift-Mutation am Anfang des Proteins (ergänzende Abbildung 6A) sowie die Mutagenese im Gesamtgenom-Screening von piggyBac31 weisen darauf hin, dass dieses Gen im asexuellen Blutstadium nicht essentiell ist.

Wir haben getestet, ob die CRISPR-editierten Parasiten, die die MMV665794-Resistenzmutationen tragen, Kreuzresistenz zu ihrem Analogon MMV007224 verleihen können. Sowohl die G1612V- als auch die D1863Y-Mutantenlinie zeigten eine ähnlich geringe Resistenz gegen MMV007224 wie bei MMV665794 (Abb. 5D). Ebenso zeigte die mit MMV007224 ausgewählte Linie, die die Frameshift-Mutation in PF3D7_1359900 trug, eine gleichwertige minderwertige Resistenz gegen MMV665794, jedoch nicht gegen die nicht verwandten Verbindungen KAE609 und Chloroquin (ergänzende Abbildung 6B).

Diese Ergebnisse legen nahe, dass das von PF3D7_1359900 kodierte Protein, das wir als Chinoxalin-Resistenzprotein 1 (PfQRP1) bezeichnet haben, eine allgemeine Resistenz gegen Chinoxalin-ähnliche Verbindungen verleihen kann. Um zu untersuchen, ob Mutationen in PfQRP1 eine umfassendere Resistenz gegen Verbindungen mit einem Chinoxalin-ähnlichen Gerüst vermitteln, haben wir sechs Analoga von MMV665794 (Ergänzungsmaterial) synthetisiert und weitere fünf Analoga kommerziell beschafft und dieses Panel im Vergleich zum CRISPR-editierten Parasiten QRP1-D1863Y bewertet. Bis auf ein Chinoxalin-Analogon zeigten alle Chinoxalin-Analogon eine geringe Resistenz in der QRP1-Mutantenlinie, die sich deutlich von den Kontrollen unterschied. Im Gegensatz zu BQR695 und KDU69139 wurde erwartet, dass Malariamittel, die auf die Phosphatidylinositol-4-Kinase abzielen, eine Wirkungsweise haben, die nichts mit den Chinoxalin-Verbindungen zu tun hat (ergänzende Abb . 7). Unsere Daten deuten darauf hin, dass es sich bei PfQRP1 um ein bisher nicht charakterisiertes Protein handelt, das eine geringe Resistenz gegen Chinoxalin-basierte Verbindungen verleiht.

Die erhöhte Fähigkeit der Dd2-Polδ-Linie, Resistenzen sowohl gegen KAE609 als auch gegen MMV665794 zu erzeugen, stand im Einklang mit einer Zunahme der zur Selektion verfügbaren genetischen Vielfalt. Wir haben die Mutationsrate von Dd2-Polδ unter Drogendruck bestimmt, indem wir Parasiten, die mit KAE609, MMV665794 und zwei weiteren Resistenzselektionen ausgewählt wurden, mit den nicht verwandten unwiderstehlichen Verbindungen Salinopostin A und KM15HA40,41 verglichen. De-novo-SNVs der arzneimittelselektierten Linien wurden im Vergleich zu den Elternlinien bestimmt, die in der entsprechenden Reihe von Selektionsexperimenten verwendet wurden (Abb. 6A und ergänzende Abb. 8). Die Änderung der Mutationsrate in diesen Linien wurde mit Dd2-WT ohne Druck verglichen, was die kombinierten Faktoren einer fehlerhaften Korrekturlese-DNA-Polymerase δ und eines Arzneimitteldrucks widerspiegelt. Dd2-Polδ zeigte unter Arzneimitteldruck eine erhöhte Mutationsrate in kodierenden Regionen um das 13- bis 28-fache und im Genom um das etwa 3- bis 6-fache im Vergleich zu Wildtyp-Dd2 ohne Arzneimitteldruck (Abb. 6B und Tabelle 1). Im Vergleich zu nicht medikamentös behandeltem Dd2-Polδ führen diese Veränderungen zu einem etwa 1,5- bis 3,5-fachen Anstieg der kodierenden Regionen und einer im Wesentlichen unveränderten (etwa 0,8- bis 1,9-fachen) Veränderung im gesamten Genom. Das Ts:Tv-Verhältnis von Dd2-Polδ unter Drogendruck variierte und zeigte keinen erkennbaren Trend (ergänzende Abbildung 9).

A Die Anzahl der SNVs in Dd2-Polδ, ausgewählt mit verschiedenen Antimalariaverbindungen. Mit Ausnahme von KAE609 führten diese Selektionen nicht zu resistenten Parasiten mit Dd2-WT. Beachten Sie die höhere Anzahl von SNVs bei KAE609-Selektionen mit Dd2-Polδ im Vergleich zu Dd2-WT (siehe Ergänzungstabelle 6). Jeder Punkt stellt einen sequenzierten Klon dar, wobei die Anzahl der unabhängigen Klone in Klammern steht: Dd2-WT + KAE609 (2); Dd2-Polδ+KAE609 (3); Dd2-Polδ+MMV665794 (6); Dd2-Polδ+SalA (6); Dd2-Polδ+KM15HA (2). Die blauen und orangefarbenen Balken stellen das Exom bzw. das Kerngenom dar, wobei Mittelwerte ± SD angezeigt werden. B Die Mutationsraten von Dd2-WT und Dd2-Polδ unter Drogendruck. Jeder Punkt stellt einen sequenzierten Klon dar, wobei die Anzahl der unabhängigen Klone unter dem Medikament wie oben für (A) angegeben und wie folgt angegeben ist: Dd2-WT-Medikament (12); Dd2-Polδ-Wirkstoff (11). Die Daten werden als Mittelwert +/-SD dargestellt (Werte und 95 %-Konfidenzintervalle siehe Tabelle 1). Zum Vergleich sind Daten des nicht medikamentös behandelten Dd2-WT- und Dd2-Polδ-Klons H11 (siehe Abb. 2D) enthalten. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die Mutationsrate von Dd2-WT unter Medikamentendruck erhöhte sich in kodierenden Regionen im Vergleich zu Dd2-WT ohne Medikamentendruck ebenfalls um das etwa Dreifache. Dies blieb jedoch im gesamten Genom relativ unverändert (Tabelle 1), was mit früheren Berichten übereinstimmt18.

Insgesamt deuten unsere Daten darauf hin, dass die Dd2-Polδ-Linie eine erhöhte Mutationsrate aufweist, die ein erhöhtes Potenzial für die Selektion arzneimittelresistenter Parasiten bietet, selbst bei zuvor unwiderstehlichen Verbindungen, und gleichzeitig niedrig genug ist, um die Genomintegrität und die Robustheit des Parasiten aufrechtzuerhalten.

Wir schlagen vor, dass der Dd2-Polδ-Mutator-Parasit P. falciparum ein leistungsstarkes neues Werkzeug zur Identifizierung von Zielen und Resistenzmechanismen von Antimalariamitteln ist. Das fehlerhafte Korrekturlesen, das aus der technischen Modifikation der DNA-Polymerase δ resultiert, führt zu einer erhöhten Rate spontaner Mutationen. Durch die Erweiterung des genetischen Sequenzraums in kultivierten Parasiten zeigen wir eine verbesserte Fähigkeit, arzneimitteltolerante Linien unter In-vitro-Evolution von Resistenzregimen hervorzubringen. Wir beobachteten, dass wir bei Selektionen mit einem Medikament mit bekannter Wirkungsweise, KAE60924, resistente Parasiten mit einem 10–100-fach geringeren Inokulum und in einem kürzeren Selektionsfenster unter Verwendung der Dd2-Polδ-Linie erhielten. Im Fall einer unwiderstehlichen Verbindung, dem Chinoxalin MMV665794, ergab die Dd2-Polδ-Linie mäßig resistente Parasiten, bei denen frühere Selektionen fehlgeschlagen waren. Eine mögliche Überlegung, die sich aus der erhöhten Mutationsrate ergibt, ist das Vorhandensein weiterer unabhängiger genetischer Mutationen, die bei der Auswahl der Arzneimittelresistenz auftreten. Die Sequenzierung von mindestens zwei Klonen aus mehr als einer unabhängigen Selektion in Verbindung mit der Validierung des Genom-Editings wird daher wichtig sein, um kausale Mutationen zu lokalisieren.

Durch die Verwendung eines Mutationsakkumulationstests in Kombination mit der Sequenzierung des gesamten Genoms konnten wir eine Mutationsrate basierend auf Daten des gesamten Genoms bestimmen, die nicht von repräsentativen Reporterorten abhängig war42. Wir verfolgten Wildtyp- und Dd2-Polδ-Parasiten über 100 Tage, um eine Mutationsrate abzuleiten. Bei Dd2-Polδ-Parasiten war diese Rate im gesamten Genom etwa dreifach höher als bei Dd2-WT und beim Vergleich der Veränderungen im Exom bis zu achtfach höher, mit der Einschränkung, dass die Mutationsrate für das Wildtyp-Exom möglicherweise höher ist unterrepräsentiert, da 7 von 13 Eltern-Dd2-Klonen im Zeitraum des Experiments keine SNVs erwarben. Somit erfordert Dd2-Polδ eine geringere Anzahl von Parasiten, damit eine Mutation in seinem haploiden Genom auftritt als Dd2-WT (5.08E7 vs. 1.63E8 Parasiten; Ergänzende Daten 2).

In Gegenwart von Antimalariaverbindungen war die Mutationsrate im gesamten Exom in der Dd2-Polδ-Linie im Vergleich zur unbehandelten Linie 1,5–3,5-fach höher. Obwohl eine mögliche Erklärung möglicherweise der mutagene Stress der Behandlungen selbst ist, war die Mutationsrate im gesamten Genom im Vergleich zu nicht medikamentös behandelten Linien nur geringfügig erhöht (0,8–1,9-fach), was mit einer früheren Studie übereinstimmt, in der weniger als festgestellt wurde 3-facher Anstieg der Mutationsrate unter Atovaquon-Selektion18. Dieser scheinbare Anstieg innerhalb des Exoms spiegelt möglicherweise die positive Auswahl funktioneller Mutationen wider, die sich auf die Fähigkeit auswirken, den Drogendruck zu überleben oder die Fitness aufrechtzuerhalten, indem sie primäre Resistenzmutationen unterstützen. Alternativ können Klone, die eine höhere Anzahl an Bystander-Mutationen ansammeln, ohne Arzneimitteldruck ausgewählt werden, würden aber Klone mit einer geringeren Mutationslast verdrängen, wenn sie eine zufällige Resistenz-SNV besitzen.

Der milde Mutator-Phänotyp von Dd2-Polδ kann in zweierlei Hinsicht vorteilhaft sein: Er erzeugt nicht zu viele Mutationen bei der Selektion, um die Identifizierung der wahrscheinlichen ursächlichen Mutationen zu ermöglichen, und er behält die Fitness trotz der potenziellen Erzeugung schädlicher Mutationen bei. Im Vergleich zu Dd2-WT zeigte die Dd2-Polδ-Linie nur einen geringen Fitnessverlust und wir konnten nach Langzeitkultur keine Umkehrung der manipulierten D308A/E310A-Mutationen in der DNA-Polymerase beobachten. Im Gegensatz dazu zeigte die äquivalente DNA-Polymerase-δ-Mutante in P. berghei eine signifikante Verringerung der Fitness, und es wurde das Vorhandensein einer Antimutator-Mutation in der DNA-Polymerase δ beobachtet22,23. Die höhere Mutationsrate der P. berghei-DNA-Polymerase-δ-Mutante, etwa 90-fach im Vergleich zum Wildtyp, und möglicherweise die strengeren Wachstumsbedingungen in vivo könnten den größeren Einfluss auf die Parasitenfitness beim Nagetier-Malariaparasiten erklären. In den in der Pf6K-Datenbank vorhandenen klinischen Isolaten wurden keine Mutationen dieser beiden Reste der DNA-Polymerase δ gefunden43.

Antimutatormutationen in DNA-Polymerasen erhöhen die Wiedergabetreue und können selbst mit inhärenten Fitnesskosten verbunden sein (Herr et al., 2011). Wir haben in keinem der sequenzierten P. falciparum Dd2-Polδ-Klone bekannte Antimutatormutationen in der DNA-Polymerase δ beobachtet, was möglicherweise auf den begrenzten Selektionsdruck zurückzuführen ist, der durch die moderate Erhöhung der Mutationsrate entsteht. Dennoch besaßen alle drei Dd2-Polδ-Klone SNVs in oder in der Nähe von Genen, die bei der DNA-Replikation und DNA-Reparatur eine Rolle spielen. Ob diese Mutationen jedoch funktionelle Auswirkungen haben, ist unbekannt. Das nichtkodierende SNV in der Nähe des proliferierenden Zellkernantigens 2 (PCNA2) im Klon H11 (Ergänzungsdaten 1) kann möglicherweise die Genexpression von pcna2, einem von zwei PCNA-Proteinen in P. falciparum, modulieren, um eine hohe Prozessivität der DNA-Polymerase δ44 zu ermöglichen. 45,46. Darüber hinaus weist der Dd2-Polδ-Klon E8, der eine geringere Mutationsrate als die beiden anderen Klone (F11 und H11) aufwies, ein nicht-synonymes SNV (G435E) im mutmaßlichen DNA-Polymerase-Theta (PF3D7_1331100) Gly435 auf, das Gly226 in entspricht menschliche DNA-Polymerase θ, die in der Region der DEAD/DEAH-Box-Helikase liegt. DNA-Polymerase θ besitzt eine DNA-Polymerase- und Helikase-Aktivität mit geringer Wiedergabetreue und spielt eine Rolle bei der DNA-Reparatur, wie z. B. der Reparatur von Doppelstrangbrüchen durch kanonische nicht-homologe Endverknüpfung, mikrohomologievermittelte Endverknüpfung und homologe Rekombination. Polymerase θ hat Einfluss auf die Genomstabilität und die Reparatur von Brüchen, die durch G4-Quadruplex-Strukturen gebildet werden46,47.

Die Fähigkeit der Dd2-Polδ-Linie, resistente Parasiten hervorzurufen, wurde unter Verwendung von zwei Verbindungen, KAE609 (Cipagarmin) und MMV665794, bewertet. KAE609, das sich derzeit in klinischen Phase-II-Studien befindet, zielt auf die P-Typ-ATPase PfATP4 ab, die für den Transport von Na+ durch die Plasmamembran des Parasiten verantwortlich ist (Rottmann et al., 2010; Spillman et al., 2013). Alle drei aus unserer Selektion erhaltenen Mutationen lagen in der vorhergesagten Transmembranregion von PfATP4, was mit den meisten zuvor beobachteten Mutationen übereinstimmt (Rottmann 2010; Jimenez-Diaz et al., 2014; Viadya et al., 2015; Lee und Fidock, 2016). Bemerkenswert ist, dass Selektionen mit der Dd2-Polδ-Linie eine G358S-Mutante hervorbrachten, die kürzlich bei den meisten Behandlungsversagen während einer Phase-II-Studie mit KAE609 beobachtet wurde (Schmitt et al., 2021), was darauf hindeutet, dass die In-vitro-Evolution mit dieser Linie zu Ergebnissen führen kann mit klinischer Relevanz. Diese hochgradige Resistenzmutation wurde auch zuvor bei Selektionen mit einer Dihydroisochinolonverbindung (+)-SJ733 (Jimenez-Diaz et al., 2014) sowie bei parallelen KAE609-Selektionen mit unserer Dd2-Polδ-Linie durch eine andere Gruppe beobachtet48. Qui et al. generierte eine CRISPR-editierte Linie mit dem G358S-SNV, was zeigt, dass diese Mutation ausreicht, um eine große Verschiebung von IC50 voranzutreiben, und zeigte, dass sie die Na+-ATPase-Aktivität von PfATP4 vor der Hemmung durch KAE609 schützt, allerdings auf Kosten einer Verringerung der Affinität von das Protein zu Na+48. Trotz dieser funktionellen Wirkung auf PfATP4 haben die mutierten Parasiten keine großen Fitnesskosten. Dies könnte teilweise erklären, warum wir die G358S-Mutante nur bei Selektionen mit der Dd2-Polδ-Linie beobachteten, da sie möglicherweise langsamer wachsende oder weniger resistente Mutanten in der Massenkultur übertrifft.

Das Hauptpotenzial der Dd2-Polδ-Linie besteht nicht nur darin, eine einfachere Resistenz bei geringerer Parasitenzahl zu erreichen, sondern auch darin, neuen Sequenzraum für bisher unwiderstehliche Verbindungen zu erschließen. Wir haben die Dd2-Polδ-Linie mit MMV665794 herausgefordert, einer unwiderstehlichen Verbindung mit einem chemischen Chinoxalin-Gerüst und einer Flutamid-ähnlichen funktionellen Gruppe16,49. Unsere Selektionen mit Dd2-Polδ ergaben nach etwa 60 Tagen einen mäßig resistenten Parasiten, wohingegen Selektionen mit Wildtyp-3D7- oder Dd2-Linien fehlschlugen (Ergänzungstabelle 4)16.

Die Gesamtgenomsequenzierung von MMV665794-resistenten Klonen ergab Mutationen in PF3D7_1359900 in allen sechs Klonen, die aus zwei unabhängigen Selektionsflaschen ausgewählt wurden. Es wird vorhergesagt, dass das Gen nicht essentiell ist, basierend auf einer einzelnen piggyBac-Insertionsstelle etwa 0,8 kb im 7 kb großen Gen31 sowie unserer Beobachtung einer Frameshift-Mutante nahe dem Start des Gens. Die CRISPR-Cas9-Bearbeitung der Mutationen G1612V und D1863Y bestätigte deren Rolle im Resistenzphänotyp. Darüber hinaus zeigten diese Parasiten eine Kreuzresistenz gegen mehrere strukturell verwandte Chinoxalin-ähnliche Verbindungen. Das von PF3D7_1359900 kodierte Protein, das wir als Chinoxalin-Resistenzprotein 1 (PfQRP1) bezeichnet haben, enthält voraussichtlich vier Transmembrandomänen in Richtung des N-Terminus und eine Domäne in Richtung des C-Terminus, in der sich die Resistenzmutationen befinden und mit denen die Konservierung gemeinsam ist konventionelle Hydrolasen. Die nicht-essentielle Natur von PfQRP1 legt nahe, dass es sich hierbei nicht um das Ziel der Chinoxalinverbindungen, sondern um einen Resistenzmechanismus handelt. Obwohl wir nicht wissen, ob die Mutationen G1612V und D1863Y zu einem Funktionsverlust führen, ist das Vorhandensein der Frameshift-Mutation in der mit MMV007224 ausgewählten Linie ein Hinweis darauf. Ob QRP1 direkt auf Chinoxalinverbindungen wirkt, ähnlich wie die PfPARE-Esterase, die ein Prodrug in eine aktive Form umwandelt50, oder eine indirekte Wirkung hat, ist nicht bekannt. Dennoch ist der Grad der hervorgerufenen Resistenz bescheiden und es kommt lediglich zu einem zweifachen Wirksamkeitsverlust. Daher lassen die Schwierigkeit, eine Resistenz gegen MMV665794 zu erreichen, zusammen mit der begrenzten Verschiebung der Wirksamkeit darauf schließen, dass Verbindungen dieser chemischen Klasse vielversprechende Antimalaria-Kandidaten für die weitere Erforschung sein könnten. Generell gilt: Da mit der Dd2-Polδ-Linie immer mehr zuvor „unwiderstehliche“ Verbindungen erforscht werden, wird es interessant sein zu bestimmen, ob dieser Ansatz häufiger zu Mutationen in Resistenzgenen führt als zu direkten Zielen. Die Natur „unwiderstehlicher“ Verbindungen kann dazu führen, dass eine Mutation des direkten Ziels zu einem nicht lebensfähigen Parasiten führt oder dass die Verbindung mehrere Ziele oder Ziele aus dem Wirt befallen kann. Diese Möglichkeiten können als wahrscheinlichstes Ergebnis zu Resistenzmutationen führen.

Die Entwicklung von Resistenzen in vitro in Verbindung mit der Analyse des gesamten Genoms hat sich als äußerst erfolgreiche Technik zum Verständnis des Wirkmechanismus neuer Verbindungen sowie zur Identifizierung von Markern für Arzneimittelresistenz auf diesem Gebiet erwiesen13,51. Eine Einschränkung dieses Ansatzes war die relative Schwierigkeit, Resistenzen gegen einige chemische Klassen hervorzurufen. Durch die Erhöhung der genetischen Komplexität von In-vitro-Kulturen hat die hier entwickelte Dd2-Polδ-Parasitenlinie das Potenzial, das Parasiteninokulum zu reduzieren, die Selektionszeit zu beschleunigen und die Erforschung zuvor unwiderstehlicher Verbindungen zu ermöglichen.

Der Stamm P. falciparum Dd2 wurde für alle genetischen Manipulationen unter Verwendung von CRISPR-Cas9 verwendet. Um die „Mutator“-Linie zu erzeugen, wurden die konservierten katalytischen Aminosäurereste D308 und E310 der katalytischen Untereinheit der DNA-Polymerase δ (PF3D7_1017000) zu Alanin mutiert. Zwei verschiedene einzelne Guide-RNAs (sgRNA) und eine Donor-Reparatur-Matrize (Länge 699 bp, mit 363 bp/289 bp flankierender Homologie), die die doppelten D308A/E310A-Mutationen mit zusätzlichen Schildmutationen zur Verhinderung der Bindung des sgRNA-Cas9-Komplexes enthalten, wurden nacheinander kloniert ein einzelnes Plasmid, das SpCas9 und den hdhfr-selektionierbaren Marker enthält (siehe Abb. 1A)52. Um die mutmaßlichen Resistenzmutationen G1612V und D1863Y in PF3D7_1359900 einzuführen, wurden wie oben zwei sgRNAs und eine Spenderreparaturvorlage für jede Mutation konstruiert. Für G1612V wurde eine Donor-Matrize von 746 bp (443 bp/235 bp flankierende Homologie) generiert, und für D1863Y wurde eine Donor-Matrize von 671 bp (252 bp/307 bp flankierende Homologie) generiert. Guide-RNAs wurden als Oligo-Primer (IDT) synthetisiert. Spender-Reparaturvorlagen und Kontroll-Spendervorlagen, die nur stille Mutationen an den Zielstellen kodieren, wurden von GeneArt (Thermo Fisher Scientific) synthetisiert. Die 5'- und 3'-Seiten der Spender-DNA-Matrizen wurden von einer zusätzlichen 20–21 bp langen Sequenz mit Homologie zum Ziel-pDC2-Cas9-gRNA-Plasmid zur Insertion an den AatII- und EcoRI-Stellen unter Verwendung von NEBuilder HiFi DNA Assembly52 flankiert. Die Plasmidkonstrukte wurden durch Sanger-Sequenzierung verifiziert. Die sgRNAs und Sanger-Sequenzierungsprimer sind in der Ergänzungstabelle 5 aufgeführt.

Die Parasiten wurden in RPMI 1640 (Gibco) Komplettmedium kultiviert, bestehend aus 0,5 % Albumax II (Gibco), 25 mM HEPES (Kulturqualität), 1x GlutaMAX (Gibco), 25 μg/ml Gentamicin (Gibco) und mit O+ Human Red versorgt Blutzellen (RBCs), die von anonymen gesunden Spendern des National Health Services Blood and Transplant (NHSBT) oder des Roten Kreuzes (Madrid, Spanien) stammen. Die Verwendung von Erythrozyten erfolgte in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften mit Genehmigung des NHS Cambridgeshire Research Ethics Committee und des Human Materials and Data Management Committee des Wellcome Sanger Institute für die im Vereinigten Königreich durchgeführten Experimente. Erythrozyten wurden ethisch beschafft und ihre Forschungsverwendung entsprach den Bedingungen der Einverständniserklärungen im Rahmen eines vom IRB/der Europäischen Kommission genehmigten Protokolls für in Spanien durchgeführte Experimente. Die Parasiten wurden routinemäßig bei 0,5–3 % Parasitämie mit 3 % Hämatokrit gehalten und unter Malariagas (1 % O2, 3 % CO2 und 96 % N2) kultiviert. Eine synchrone Ringstufe wurde durch Behandlung mit 5 % Sorbit im Zyklus vor der Elektroporation erhalten. Im nächsten Zyklus wurde das Ringstadium (0–16 h) mit 10 % Parasitämie für die Elektroporation geerntet. Das pDC2-Cas9-gRNA-Donorplasmid wurde mit einem Gene Pulser Xcell (BioRad) in die P. falciparum Dd2-Linie transfiziert. Plasmide, die entweder sgRNA1 oder sgRNA2 (50 µg) oder eine Mischung beider Plasmide (100 µg) enthielten, wurden mit 150 µl gepackter, mit Parasiten infizierter roter Blutkörperchen und vollständigem Zytomix (120 mM KCl, 0,2 mM CaCl2, 2 mM EGTA, 10) gemischt mM MgCl2, 25 mM HEPES, 5 mM K2HPO4, 5 mM KH2PO4; pH 7,6), um ein Gesamtvolumen von 420 μl52 zu ergeben. Die Transfektanten wurden 8 Tage lang in Komplettmedium mit 5 nM WR99210 (Jacobus Pharmaceuticals) selektiert. Anschließend wurde die Kultur in drogenfreiem Vollmedium gehalten, bis erneut Parasiten auftraten. Eine Grenzverdünnung wurde durchgeführt, um klonale geneditierte Parasiten zu isolieren (Abb. 1B). Transfektanten aus Massen- und Klonkulturen wurden durch allelspezifische PCR und Sanger-Sequenzierung genotypisiert. Die Primer sind in der Ergänzungstabelle 5 aufgeführt.

Der Mutationsakkumulationstest wurde mit Dd2-WT und drei Dd2-Polδ-Klonen durchgeführt. Parasiten im gemischten Stadium mit 1–5 % Parasitämie in 10 ml wurden 100 Tage lang kontinuierlich kultiviert. Parasiten wurden aus den kontinuierlichen Kulturen an den Tagen 0, 20, 40, 60, 80 und 100 zur klonalen Isolierung durch begrenzte Verdünnung in Platten mit 96 Vertiefungen entnommen. Von jedem Zeitpunkt wurden ein bis drei Parasitenklone zur genomischen DNA-Extraktion durch DNeasy Blood & Tissue Kits (Qiagen) für die Gesamtgenomsequenzierung auf einem Hiseq X (Illumina) vermehrt.

Der Test wurde durch Mischen der Test- und Kontrollparasiten im Verhältnis 1:1 mit jeweils 1 % Parasitämie durchgeführt. Dd2-GFP, eine Dd2-Linie, die grün fluoreszierendes Protein aus dem ER-hsp70-Promotor32 exprimiert, wurde als Referenzparasit verwendet, der in einer 6-Well-Platte entweder mit Dd2-WT oder Dd2-Polδ konkurrierte. Der Hämatokrit der Abfrage- und der Konkurrenzkulturen wurde mit dem Cellometer Auto 1000 (Nexcelom Bioscience) bestimmt. Parasitämie wurde durch Anfärben der Parasiten mit MitoTracker Deep Red FM (Invitrogen) und Zählen mit einem CytoFlex S-Durchflusszytometer (Beckman Coulter) mit der Software CytExpert v2.4 bestimmt und weiter mit FlowJo v10 analysiert, wobei die Anzahl und das Parasitenstadium durch mikroskopische Untersuchung nach Giemsa bestätigt wurden Fleckenbildung (VWR Chemicals). Nicht infizierte Erythrozyten wurden als Signalhintergrund für das Gating auf dem Durchflusszytometer verwendet. Die Wettkampftauglichkeit wurde durch Messung der gesamten Parasitämie durch MitoTracker Deep Red-Färbung und des Anteils der GFP-positiven Kontrollparasiten auf dem Durchflusszytometer alle zwei Tage über 20 Tage (ca. 10 Generationen) ermittelt. Die Proben wurden in einer 96-Well-Rundbodenplatte (Costar) vorbereitet, indem 4 μl Kultur in 200 μl Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) (Gibco) mit 100 nM Mitotracker Deep Red FM gegeben wurden. Die Platte wurde 15 Minuten lang bei 37 °C inkubiert und einer Analyse auf dem Durchflusszytometer unterzogen. Die Gates wurden für die Kanäle FITC (Verstärkung 5 oder 10) und APC (Verstärkung 3 oder 5) für GFP- bzw. Mitotracker Deep Red FM-Signale eingerichtet. Eine repräsentative Gating-Strategie ist in der ergänzenden Abbildung 10 dargestellt. Es wurden zwei unabhängige biologische Experimente mit drei technischen Replikaten durchgeführt.

Für die In-vitro-Resistenzentwicklung wurden zwei Verbindungen verwendet: KAE609 (Cipargamin) und MMV665794, eine Antimalariaverbindung, die im Tres Cantos Antimalaria-Set identifiziert und in der Medicines for Malaria Venture Malaria Box36,49 enthalten ist. Um das minimale Inokulum für Resistenz (MIR) für KAE609 zu bestimmen, wurden drei unabhängige Kolben mit Ringstadiumkulturen von Dd2-WT und Dd2-Polδ-Klon H11 mit einem Inokulabereich von 2 × 106, 2 × 107, 2 × 108 getestet und 1 × 109 Parasiten. Jeder Kolben wurde kontinuierlich in Vollmedium mit 2,5 nM (~ 5 × IC50) KAE609 kultiviert. Diese Konzentration war in der Lage, Parasiten in einem Ausmaß abzutöten, das bei der Mikroskopie von mit Giemsa gefärbten dünnen Ausstrichen (mindestens 30 Felder mit 100 Erythrozyten) nicht nachweisbar war. Das Absterben und Wiederauftreten des Parasiten nach der medikamentösen Behandlung wurde durch Giemsa-Färbung dünner Abstriche mit mikroskopischer Untersuchung alle ein bis zwei Tage überwacht. Selektionen mit MMV665794 wurden mit Dd2-WT und Dd2-Polδ mit intermittierender Arzneimittelexposition in drei unabhängigen Flaschen durchgeführt (dargestellt in Abb. 4A). Parasiten mit einem anfänglichen Inokulum von 1 × 109 wurden 20 Tage lang kontinuierlich 95 nM MMV665794 (1 × IC50) ausgesetzt. Dann wurde Dd2-WT bis zum 60. Tag in drogenfreiem Vollmedium gehalten. Dd2-Polδ-Parasiten, die nach der Selektion wieder auftraten, wurden anschließend bis zum 40. Tag einer zweifachen Erhöhung von MMV665794 bei 190 nM ausgesetzt. Der Medikamentendruck wurde entfernt, bis die Parasiten verschwunden waren nachgewiesen, und die Konzentration wurde anschließend mit einer Inokula von 4,5 × 108 Parasiten auf 3 × IC50 und 4 × IC50 erhöht. Für alle ausgewählten Linien wurden Parasitenklone durch begrenzte Verdünnung isoliert und 18–25 Tage lang vermehrt. Parasiten vor dem Drogendruck und überlebende Parasiten nach dem Drogendruck wurden für die Extraktion genomischer DNA und die Sequenzierung des gesamten Genoms geerntet.

Arzneimittelempfindlichkeitstests wurden in Platten mit 96 Vertiefungen unter Verwendung synchronisierter Parasiten im Ringstadium durchgeführt, die unter Verwendung von 5 % Sorbit hergestellt wurden. Die Parasiten im Ringstadium im nächsten Zyklus wurden mit 2 % Hämatokrit (Endkonzentration in der Testplatte) auf 1 % Parasitämie verdünnt, um den halbmaximalen wachstumshemmenden Konzentrationstest (IC50) durchzuführen. Der Konzentrationsbereich wurde durch zweifache Reihenverdünnung der Verbindung in Vollmedium ermittelt. Als Kontrollen wurden unbehandelte oder nur mit 5 μM Artesunat und Erythrozyten (2 % Hämatokrit) behandelte Parasiten in die Testplatte aufgenommen. Das Parasitenwachstum wurde nach 72-stündiger Arzneimittelinkubation unter Verwendung von 2x Lysepuffer mit 2 × SYBR Green I (Molecular Probes)53 und Messung auf einem FluorStar Omega v5.11 bestimmt. Die IC50-Analyse wurde mit GraphPad Prism v8/v9 durchgeführt und die statistische Signifikanz wurde durch zweiseitige Mann-Whitney-U-Tests bestimmt. Alle Tests wurden in drei bis sechs unabhängigen biologischen Experimenten mit jeweils zwei technischen Wiederholungen durchgeführt.

Parasitenproben wurden in 0,1 % Saponin lysiert, mit 1×PBS gewaschen und genomische DNA (gDNA) wurde mit dem QIAamp DNA Blood Midi Kit (Qiagen) extrahiert. Die Konzentration der gDNA wurde mit dem Qubit dsDNA BR-Assay-Kit quantifiziert und vor der Sequenzierung mit einem Qubit 2.0-Fluorometer (Thermo Fisher Scientific) gemessen. Die Proben wurden in etwa 450-bp-Fragmente zerkleinert und die Bibliothek mit dem NEBNext UltraII DNA Library Kit (NEB) erstellt, gefolgt von qPCR zur Probenzusammenführung und Normalisierung für die Illumina-Sequenzierungsplattform. Die Paired-End-Sequenzierung (2 × 150 bp) und die PCR-freie Sequenzierung des gesamten Genoms wurden auf einem HiSeq X (Illumina)54 durchgeführt. Auf Resistenz gegen Salinopostin A und KMHA15 ausgewählte Proben wurden auf einer Illumina MiSeq- bzw. NextSeq 550-Sequenzierungsplattform sequenziert, um 300 oder 150 bp Paired-End-Reads bei einer durchschnittlich 30-fachen Abdeckungstiefe zu erhalten.

Die Genomsequenzen von Dd2-Polδ-Klonen wurden nach dem GATK4-Best-Practice-Workflow55 analysiert. Paired-End-Sequenzierungsablesungen von jedem Parasitenklon wurden unter Verwendung von bwa mem (bwa/0.7.17 = pl5.22.0_2) mit der P. falciparum 3D7- (PlasmoDB-44_Pfalciparum3D7) und Dd2-Referenzsequenz (PlasmoDB-44_PfalciparumDd2) abgeglichen. PCR-Duplikate wurden durch GATK MarkDuplicates (picard/2.22.2-−0) entfernt (Ergänzungstabelle 6). Der Variantenaufruf wurde von GATK HaplotypeCaller (gatk/4.1.4.1) durchgeführt. Die SNVs mussten die Filterkriterien erfüllen (ReadPosRankSum ≥ −8,0, MQRankSum ≥ −12,5, QD ≥ 20,0, SOR ≥ 3,0, FS ≤ 60,0, MQ ≥ 40,0, GQ ≥ 50,0, DP ≥ 5,0). Varianten, die heterozygote Aufrufe hatten oder sich außerhalb des Kerngenoms befanden, wurden ausgeschlossen (die Dd2-Kerngenomkoordinaten sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt). Die Annotation genetischer Varianten und die Vorhersage funktioneller Effekte wurden mithilfe von snpEff (v4.3t)56 bestimmt. Die Startorte der Transkription wurden gemäß dem kürzlich verfeinerten Datensatz57 kartiert

Die Anzahl der De-novo-SNVs, die während des Mutationsakkumulationstests auftraten, wurde mithilfe des am Tag 0 gesammelten Genoms von Dd2-WT und Dd2-Polδ zur Subtraktion in jeder Parasitenlinie identifiziert. Für den Drogendruckzustand wurden die De-novo-SNVs identifiziert, indem zur Subtraktion das Genom der Elternlinie verwendet wurde, die keinem Drogendruck ausgesetzt war. Die signifikante Änderung der SNV-Zahlen in Dd2-WT und Dd2-Polδ im Zustand ohne Arzneimittel wurde durch zweiseitige Wilcoxon-Matched-Pairs-Signed-Rank-Tests (GraphPad Prism v8/v9) bestimmt.

CNVs wurden mit dem für P. falciparum angepassten GATK 4-Workflow58 erkannt. Kurz gesagt, die Lesezahlen wurden über die genkodierenden Regionen des P. falciparum-Kerngenoms60 gesammelt und die entrauschten log2-Kopienverhältnisse wurden anhand einer Gruppe von Normalen berechnet, die aus nicht medikamentenselektierten Dd2-Proben erstellt wurden. CNVs blieben erhalten, wenn mindestens 4 aufeinanderfolgende Gene ein denoisiertes log2-Kopienverhältnis von mehr als oder gleich 0,5 (Zunahme der Kopienzahl) oder weniger als oder gleich –0,5 (Abnahme der Kopienzahl) zeigten.

Die Mutationsrate (µ) jeder Parasitenlinie wurde durch die mittlere Anzahl von De-novo-Einzelnukleotidvarianten (S) aller Klone (C) bestimmt, die während der kontinuierlichen Parasitenkultur auftraten und sich am Tag 0 von der Parasitenlinie unterschieden. Die Dauer Der Erythrozyten-Lebenszyklus (L) und die Genomgröße (G) wurden wie unten gezeigt berechnet20,21. Ein einzelner asexueller Blutstadiumszyklus für Dd2 wurde mit 44,1 h20 berechnet. Die Größen des Dd2-Kerngenoms und der kodierenden Region wurden auf 20.789.542 bp bzw. 11.553.554 bp festgelegt (Supplementary Data 2). Der Shapiro-Wilk-Normalitätstest wurde verwendet, um SNV-Datensätze auf Normalverteilung zu untersuchen. Ein Stichproben-T-Test wurde verwendet, um mittlere Stichproben und 95 %-Konfidenzintervalle zu untersuchen (Ergänzungsdaten 2). Alle Tests wurden mit R-Programmierung (v4.1.3) durchgeführt und die Daten in Microsoft Excel (v16) zusammengestellt.

Die Proteinstrukturen von PfATP4 (PF3D7_1211900) und PfQRP1 (PF3D7_1359900) wurden von AlphaFold37 modelliert und Vergleiche mit dem DALI-Server61 durchgeführt. Strukturen wurden mit dem molekularen Grafiksystem PYMOL dargestellt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die diesem Artikel zugrunde liegenden Daten sind in den ergänzenden Material- und Quelldatendateien verfügbar. Alle zugehörigen Sequenzdaten sind im NCBI Sequence Read Archive unter dem Zugangscode ERP110649 (BioProject: PRJEB28444) verfügbar. Bibliotheksnamen DN581642P:A7, D7, E7 und DN573783H:A5-12, B5-B12, C5-C12, D5-D8, D10-D12, E5-E12, F5-F12, G6-G7, G9-G12, H4- H12. Referenzgenome für Dd2 und 3D7 sowie Genannotationsdaten sind auf PlasmoDB verfügbar (Dd2 unter https://plasmodb.org/common/downloads/release-44/PfalciparumDd2/; 3D7 unter https://plasmodb.org/common/downloads/ release-44/Pfalciparum3D7/). Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Dondorp, AM et al. Artemisinin-Resistenz bei Plasmodium falciparum-Malaria. N. engl. J. Med. 361, 455–467 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Amato, R. et al. Genetische Marker im Zusammenhang mit Dihydroartemisinin-Piperaquin-Versagen bei Plasmodium falciparum-Malaria in Kambodscha: eine Genotyp-Phänotyp-Assoziationsstudie. Lanzetteninfektion. Dis. 17, 164–173 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Uwimana, A. et al. Assoziation von Plasmodium falciparum kelch13 R561H-Genotypen mit verzögerter Parasitenbeseitigung in Ruanda: eine offene, einarmige, multizentrische, therapeutische Wirksamkeitsstudie. Lanzetteninfektion. Dis. 21, 1120–1128 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Balikagala, B. et al. Hinweise auf Artemisinin-resistente Malaria in Afrika. N. engl. J. Med. 385, 1163–1171 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Tse, EG, Korsik, M. & Todd, MH Die Vergangenheit, Gegenwart und Zukunft von Anti-Malaria-Medikamenten. Malar. J. 18, 93 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Yuthavong, Y. et al. Malaria-Dihydrofolat-Reduktase als Paradigma für die Arzneimittelentwicklung gegen ein resistentes Ziel. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 109, 16823–16828 (2012).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yoo, E. et al. Definition der Determinanten der Spezifität von Plasmodium-Proteasom-Inhibitoren. Marmelade. Chem. Soc. 140, 11424–11437 (2018).

Artikel MathSciNet CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Duffey, M. et al. Bewertung des Risikos einer Resistenz von Plasmodium falciparum gegenüber ausgewählten Antimalariamitteln der nächsten Generation. Trends Parasitol. 37, 709–721 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kumpornsin, K., Kochakarn, T. & Chookajorn, T. Das Resistom und die genomische Aufklärung im Zeitalter der Malaria-Eliminierung. Dis. Modell Mech. 12, dmm040717 (2019).

Artikel PubMed Central Google Scholar

Neafsey, DE, Taylor, AR & MacInnis, BL Fortschritte und Chancen in der Genomik der Malariapopulation. Nat. Rev. Genet 22, 502–517 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cowell, AN et al. Kartierung des medikamentös behandelbaren Genoms des Malariaparasiten mithilfe von In-vitro-Evolution und Chemogenomik. Wissenschaft 359, 191–199 (2018).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ding, XC, Ubben, D. & Wells, TN Ein Rahmen zur Bewertung des Resistenzrisikos für Malariamittel in der Entwicklung. Malar. J. 11, 292 (2012).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Luth, MR, Gupta, P., Ottilie, S. & Winzeler, EA Nutzung von In-vitro-Evolution und Gesamtgenomanalyse zur Entdeckung von Zielen der nächsten Generation für die Entdeckung von Antimalariamedikamenten. ACS-Infektion. Dis. 4, 301–314 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ng, CL & Fidock, DA Plasmodium falciparum, In-vitro-Arzneimittelresistenzauswahl und Genbearbeitung. Methoden Mol. Biol. 2013, 123–140 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nzila, A. & Mwai, L. In-vitro-Selektion von arzneimittelresistenten Parasitenlinien von Plasmodium falciparum. J. Antimicrob. Chemother. 65, 390–398 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Corey, VC et al. Eine umfassende Analyse der Resistenzentwicklung beim Malariaparasiten. Nat. Komm. 7, 11901 (2016).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yang, T. et al. MalDA beschleunigt die Entdeckung von Malariamedikamenten. Trends Parasitol. 37, 493–507 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bopp, SE et al. Die mitotische Evolution von Plasmodium falciparum zeigt ein stabiles Kerngenom, aber eine Rekombination in Antigenfamilien. PLoS Genet 9, e1003293 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McDew-White, M. et al. Art und Tempo der Mikrosatellitenlängenänderung in einem Malariaparasiten-Mutationsakkumulationsexperiment. Genombiol. Entwicklung 11, 1971–1985 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Claessens, A. et al. Erzeugung antigener Diversität in Plasmodium falciparum durch strukturierte Umlagerung von Var-Genen während der Mitose. PLoS Genet 10, e1004812 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Hamilton, WL et al. Extreme Mutationsverzerrung und hoher AT-Gehalt in Plasmodium falciparum. Nucleic Acids Res 45, 1889–1901 (2017).

CAS PubMed Google Scholar

Honma, H. et al. Mutationsneigung des Mutators Plasmodium berghei mit korrekturlesedefizienter DNA-Polymerase Delta. Wissenschaft. Rep. 6, 36971 (2016).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Honma, H. et al. Entstehung von Nagetier-Malariaparasiten mit hoher Mutationsrate durch Zerstörung der Korrekturleseaktivität der DNA-Polymerase Delta. DNA Res 21, 439–446 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rottmann, M. et al. Spiroindolone, eine wirksame Verbindungsklasse zur Behandlung von Malaria. Science 329, 1175–1180 (2010).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, AH & Fidock, DA Hinweise auf einen milden Mutator-Phänotyp bei kambodschanischen Plasmodium falciparum-Malariaparasiten. PLoS One 11, e0154166 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Simon, M., Giot, L. & Faye, G. Die 3'- bis 5'-Exonukleaseaktivität in der DNA-Polymerase-Delta-Untereinheit von Saccharomyces cerevisiae ist für eine genaue Replikation erforderlich. EMBO J. 10, 2165–2170 (1991).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Swan, MK, Johnson, RE, Prakash, L., Prakash, S. & Aggarwal, AK Strukturelle Grundlagen der High-Fidelity-DNA-Synthese durch Hefe-DNA-Polymerase Delta. Nat. Struktur. Mol. Biol. 16, 979–986 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Byrnes, JJ, Downey, KM, Black, VL & So, AG Eine neue Säugetier-DNA-Polymerase mit 3'- bis 5'-Exonukleaseaktivität: DNA-Polymerase Delta. Biochemistry 15, 2817–2823 (1976).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bebenek, A. & Ziuzia-Graczyk, I. Treue der DNA-Replikation – eine Frage des Korrekturlesens. Curr. Genet 64, 985–996 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kunkel, TA Sich entwickelnde Ansichten über die (Un-)Treue der DNA-Replikation. Kalter Frühling Harb. Symp. Quant. Biol. 74, 91–101 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, M. et al. Entdeckung der essentiellen Gene des menschlichen Malariaparasiten Plasmodium falciparum durch Sättigungsmutagenese. Wissenschaft 360, eaap7847 (2018).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Baragana, B. et al. Ein neuartiges mehrstufiges Malariamittel, das die Proteinsynthese hemmt. Natur 522, 315–320 (2015).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Spillman, NJ & Kirk, K. Das Malariaparasiten-Kation ATPase PfATP4 und seine Rolle im Wirkungsmechanismus eines neuen Arsenals an Antimalariamedikamenten. Int J. Parasitol. Drugs Drug Resist 5, 149–162 (2015).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Jimenez-Diaz, MB et al. (+)-SJ733, ein klinischer Kandidat für Malaria, der über ATP4 eine schnelle wirtsvermittelte Clearance von Plasmodium induziert. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 111, E5455–E5462 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Okombo, J., Kanai, M., Deni, I. & Fidock, DA Genomische und genetische Ansätze zur Untersuchung der Resistenz gegen Malariamedikamente und der Plasmodiumbiologie. Trends Parasitol. 37, 476–492 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gamo, FJ et al. Tausende chemische Ausgangspunkte für die Identifizierung von Antimalaria-Leitlinien. Natur 465, 305–310 (2010).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Jumper, J. et al. Hochpräzise Vorhersage der Proteinstruktur mit AlphaFold. Natur 596, 583–589 (2021).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yang, J. et al. Verbesserte Vorhersage der Proteinstruktur mithilfe der vorhergesagten Orientierungen zwischen den Resten. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 117, 1496–1503 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Meister, S. et al. Bildgebung von Plasmodium-Leberstadien, um die Entdeckung von Malariamedikamenten der nächsten Generation voranzutreiben. Wissenschaft 334, 1372–1377 (2011).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yoo, E. et al. Das Antimalaria-Naturprodukt Salinipostin A identifiziert essentielle Alpha/Beta-Serinhydrolasen, die am Lipidstoffwechsel in P. falciparum-Parasiten beteiligt sind. Zellchemie. Biol. 27, 143–157 e145 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Knaab, TC et al. 3-Hydroxypropanamidine, eine neue Klasse oral wirksamer Malariamittel gegen Plasmodium falciparum. J. Med. Chem. 64, 3035–3047 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Katju, V. & Bergthorsson, U. Altes Handwerk, neue Tricks: Einblicke in den spontanen Mutationsprozess aus der Kombination klassischer Mutationsakkumulationsexperimente mit genomischen Hochdurchsatzansätzen. Genombiol. Entwicklung 11, 136–165 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

MalariaGen et al. Ein offener Datensatz zur Genomvariation von Plasmodium falciparum in 7.000 weltweiten Proben. Willkommen, Open Res. 6, 42 (2021).

Artikel PubMed Central Google Scholar

Cai, J. et al. Rekonstitution des menschlichen Replikationsfaktors C aus seinen fünf Untereinheiten in Baculovirus-infizierten Insektenzellen. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 93, 12896–12901 (1996).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Uhlmann, F. et al. In-vitro-Rekonstitution des menschlichen Replikationsfaktors C aus seinen fünf Untereinheiten. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 93, 6521–6526 (1996).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sheriff, O. et al. Die Untereinheit 1 des Replikationsfaktors C von Plasmodium falciparum ist an der genotoxischen Stressreaktion beteiligt. Zellmikrobiol. 23, e13277 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Beagan, K. & McVey, M. Verknüpfung der DNA-Polymerase-Theta-Struktur und -Funktion bei Gesundheit und Krankheit. Zellmol. Lebenswissenschaft. 73, 603–615 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Qiu, D. et al. Eine G358S-Mutation in der Na(+)-Pumpe PfATP4 von Plasmodium falciparum führt zu einer klinisch relevanten Resistenz gegen Cipargamin. Nat. Komm. 13, 5746 (2022).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Van Voorhis, WC et al. Open-Source-Wirkstoffentdeckung mit der Malaria-Box-Verbindungssammlung für vernachlässigte Krankheiten und darüber hinaus. PLoS Pathog. 12, e1005763 (2016).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Istvan, ES et al. Die Esterasemutation ist ein Mechanismus der Resistenz gegen Malariamittel. Nat. Komm. 8, 14240 (2017).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ariey, F. et al. Ein molekularer Marker für Artemisinin-resistente Plasmodium falciparum-Malaria. Natur 505, 50–55 (2014).

Artikel ADS PubMed Google Scholar

Adjalley, S. & Lee, MCS CRISPR/Cas9-Editierung des Plasmodium falciparum-Genoms. Methoden Mol. Biol. 2470, 221–239 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Smilkstein, M., Sriwilaijaroen, N., Kelly, JX, Wilairat, P. & Riscoe, M. Einfache und kostengünstige fluoreszenzbasierte Technik für das Hochdurchsatz-Screening von Antimalariamedikamenten. Antimikrob. Agenten Chemother. 48, 1803–1806 (2004).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kozarewa, I. et al. Die amplifikationsfreie Vorbereitung der Illumina-Sequenzierungsbibliothek ermöglicht eine verbesserte Kartierung und Zusammenstellung von (G+C)-voreingenommenen Genomen. Nat. Methoden 6, 291–295 (2009).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

DePristo, MA et al. Ein Framework für die Variationserkennung und Genotypisierung mithilfe von DNA-Sequenzierungsdaten der nächsten Generation. Nat. Genet 43, 491–498 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cingolani, P. et al. Ein Programm zur Annotation und Vorhersage der Auswirkungen von Einzelnukleotidpolymorphismen, SnpEff: SNPs im Genom des Drosophila melanogaster-Stamms w1118; ISO-2; ISO-3. Fliege. (Austin) 6, 80–92 (2012).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Chappell, L. et al. Verfeinerung des Transkriptoms des menschlichen Malariaparasiten Plasmodium falciparum mithilfe amplifikationsfreier RNA-Seq. BMC Genomics 21, 395 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McKenna, A. et al. Das Genomanalyse-Toolkit: ein Mapreduce-Framework zur Analyse von DNA-Sequenzierungsdaten der nächsten Generation. Genomres. 20, 1297–1303 (2010).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Summers, RL et al. Chemogenomics identifiziert Acetyl-Coenzym-A-Synthetase als Ziel für die Behandlung und Prävention von Malaria. Zellchemie. Biol. 29, 191–201 e198 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Miles, A. et al. Indels, strukturelle Variation und Rekombination fördern die genomische Vielfalt in Plasmodium falciparum. Genomres. 26, 1288–1299 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Holm, L., Kaariainen, S., Rosenstrom, P. & Schenkel, A. Durchsuchen von Proteinstrukturdatenbanken mit DaliLite v.3. Bioinformatik 24, 2780–2781 (2008).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Referenzen herunterladen

Wir möchten den aktuellen und ehemaligen Mitgliedern des Lee-Labors für ihr konstruktives Feedback danken. Wir danken Liz Huckle und den Mitarbeitern von Sanger Scientific Operations für ihre Unterstützung bei der Sequenzierung. Wir danken Kotanan N. für das Kunstwerk. Wir danken der Bill and Melinda Gates Foundation für die Finanzierung von MCSL, DAF, GSK und EAW (OPP1054480) sowie von DAF (INV-033538) für die Finanzierung durch den Wellcome Institutional Translational Partnership Award (ITPA) und die Mahidol University TK und TC sowie Finanzierung von Wellcome [206194/Z/17/Z] an MCSL und das Wellcome Sanger Institute.

Wellcome Sanger Institute, Wellcome Genome Campus, Hinxton, Großbritannien

Krittikorn Kümpornsin, Johanna Hoshizaki, Mukul Rawat, Richard D. Pearson und Marcus CS Lee

Calibr, Abteilung des Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA

Krittikorn Kümpornsin

Das Labor für molekulare Infektionsmedizin Schweden und die Abteilung für Molekularbiologie, Universität Umeå, Umeå, Schweden

Theerarat Kochakar und Thanat Chookajorn

Abteilung für Mikrobiologie und Immunologie, Columbia University Irving Medical Center, New York, NY, USA

Thomas Yeo, John Okombo, Kyra A. Schindler, Sachel Mok und David A. Fidock

Abteilung für Pädiatrie, School of Medicine, University of California, San Diego, La Jolla, CA, USA

Madeline R. Luth und Elizabeth A. Winzeler

Zentrum für Malariatherapeutika und antimikrobielle Resistenz, Abteilung für Infektionskrankheiten, Abteilung für Medizin, Columbia University Irving Medical Center, New York, NY, USA

Sachel Mok, Anne-Catrin Uhlemann & David A. Fidock

Abteilung für Infektionskrankheiten, Abteilung für Medizin, Columbia University Irving Medical Center, New York, NY, USA

Heekuk Park & Anne-Catrin Uhlemann

TCG Lifesciences Private Limited, Salt-Lake Electronics Complex, Kalkutta, Indien

Gouranga P. Jana & Bikash C. Maity

Medicines for Malaria Venture, International Centre Cointrin, Genf, Schweiz

Benoit Laleu, Elodie Chenu und James Duffy

Global Health Medicines R&D, GlaxoSmithKline, Tres Cantos, Madrid, Spanien

Sonia Moliner Cubel, Virginia Franco, Maria G. Gomez-Lorenzo und Francisco Javier Gamo

Abteilung für Genomik und Evolutionsmedizin, Kompetenzzentrum für Malariaforschung, Fakultät für Tropenmedizin, Mahidol-Universität, Bangkok, Thailand

Thanat Chookjorn

Biologische Chemie und Wirkstoffforschung, Wellcome Centre for Anti-Infectives Research, University of Dundee, Dundee, Großbritannien

Marcus CS Lee

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

KK und MCSL haben die Studie konzipiert. KK erzeugte die Dd2-Polδ-Parasitenlinien und führte die Mutationsakkumulationsexperimente durch. KK und MR führten Parasitentransfektionen durch. KK, KAS, SMC, VF und MGG führten die In-vitro-Experimente zur Arzneimittelauswahl durch. Arzneimittelsensitivitäts- und Kreuzresistenztests wurden von KK, JO, MR, KAS und MCSLHP durchgeführt und ACU trug zur Generierung von Daten zur Sequenzierung des gesamten Genoms bei. GPJ, BCM, BL, EC und JD trugen zur Verbindungssynthese bei. Daten zur Sequenzierung des gesamten Genoms wurden von KK, TK, TY, MRL, JH, RP analysiert, und SMKK, FJG, EAW, DAF, TC und MCSL konzipierten und planten die Experimente und überwachten die Studie. Alle Autoren haben zum Verfassen der Arbeit beigetragen.

Korrespondenz mit Marcus CS Lee.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Shiroh Iwanaga, Toshihiro Mita und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Kümpornsin, K., Kochakarn, T., Yeo, T. et al. Erzeugung eines Mutatorparasiten zur Förderung der Resistomentdeckung in Plasmodium falciparum. Nat Commun 14, 3059 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38774-1

Zitat herunterladen

Eingegangen: 23. August 2022

Angenommen: 12. Mai 2023

Veröffentlicht: 27. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38774-1

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.