Prävalenz von Mutationen im Cystein-Desulfurase-IscS-Gen (Pfnfs1) bei wiederkehrenden Plasmodium falciparum-Infektionen nach Artemether

Malaria Journal Band 22, Artikelnummer: 158 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Malaria bleibt weltweit ein Problem für die öffentliche Gesundheit. Die Resistenz gegen Malariamedikamente gefährdet immer wieder die Erfolge bei der Bekämpfung der Malariaparasiten. Derzeit sind Artemether-Lumefantrin (AL) und Dihydroartemisinin-Piperaquin (DP) in vielen afrikanischen Ländern, darunter Kenia, die Behandlungsschemata gegen Plasmodium falciparum-Infektionen. Bei Patienten, die mit AL oder DP behandelt wurden, wurde über wiederkehrende Infektionen berichtet, was auf die Möglichkeit einer erneuten Infektion oder eines erneuten Auftretens von Parasiten im Zusammenhang mit der Entwicklung einer Resistenz gegen die beiden Therapien schließen lässt. Der Selektionsmarker Plasmodium falciparum Cysteindesulfurase IscS (Pfnfs1) K65 wurde zuvor mit einer verringerten Lumefantrin-Empfindlichkeit in Verbindung gebracht. Diese Studie untersuchte die Häufigkeit des Pfnfs1-K65-Resistenzmarkers und des damit verbundenen K65Q-Resistenzallels bei wiederkehrenden Infektionen, die von mit P. falciparum infizierten Personen gesammelt wurden, die in Matayos, Busia County, im Westen Kenias leben.

In der Studie wurden archivierte getrocknete Blutflecken (DBS) von Patienten mit wiederkehrender Malariainfektion an klinischen Nachbeobachtungstagen nach der Behandlung mit AL oder DP verwendet. Nach der Extraktion genomischer DNA wurden PCR-Amplifikation und Sequenzierungsanalyse eingesetzt, um die Häufigkeit des Pfnfs1-K65-Resistenzmarkers und des mutierten K65Q-Allels bei den wiederkehrenden Infektionen zu bestimmen. Die genetischen Marker Plasmodium falciparum msp1 und P. falciparum msp2 wurden verwendet, um wiederkehrende Infektionen von neuen Infektionen zu unterscheiden.

Das K65-Wildtyp-Allel wurde in den wiederkehrenden Proben mit einer Häufigkeit von 41 % nachgewiesen, während das mutierte K65Q-Allel mit einer Häufigkeit von 22 % nachgewiesen wurde. 58 % der Proben, die das K65-Wildtyp-Allel enthielten, waren AL-behandelte Proben und 42 % waren DP-behandelte Proben. 79 % der Proben mit der K65Q-Mutation waren AL-behandelte Proben und 21 % waren DP-behandelte Proben. Das K65-Wildtyp-Allel wurde in drei wiederkehrenden Infektionen (100 %) nachgewiesen, die aus den mit AL behandelten Proben identifiziert wurden. Das K65-Wildtyp-Allel wurde in zwei mit DP behandelten wiederkehrenden Proben (67 %) nachgewiesen, während das mutierte K65Q-Allel in einer mit DP behandelten (33 %) wiederkehrenden Probe identifiziert wurde.

Die Daten zeigen eine höhere Häufigkeit des K65-Resistenzmarkers bei Patienten mit wiederkehrenden Infektionen während des Studienzeitraums. Die Studie unterstreicht die Notwendigkeit einer konsequenten Überwachung molekularer Resistenzmarker in Regionen mit hoher Malariaübertragung.

Weltweit ist Malaria nach wie vor eine Krankheit, die für die öffentliche Gesundheit von großer Bedeutung ist. Im Jahr 2020 wurden 627.000 Todesfälle und 241 Millionen Krankheitsfälle gemeldet [1]. Malaria wird durch einen apikomplexen Parasiten der Gattung Plasmodium verursacht. Die tödlichste Art, Plasmodium falciparum, ist die am weitesten verbreitete Art auf dem afrikanischen Kontinent, wo 95 % aller Malariafälle auftreten [1].

Die Artemisinin-basierte Kombinationstherapie (ACT) wird zur Behandlung von P. falciparum-Malaria eingesetzt, da die Kombination eines kurzwirksamen Artemisinin-Derivats mit einem Partnermedikament mit längerer Halbwertszeit wirksam ist und die verbleibende Parasitenbelastung beseitigt [2]. Das Auftreten von Artemisinin-resistenten P. falciparum-Parasiten wurde erstmals in Südostasien gemeldet [3]. ACT bleibt in den meisten Teilen Afrikas wirksam [4,5,6]. Allerdings wurden in Ruanda [7] und Uganda [8] Berichte über Artemisinin-resistente Parasiten gemeldet, die mit einer verzögerten Parasitenbeseitigung einhergehen. Der Verlust der Artemisinin-Wirksamkeit wird wahrscheinlich einen Selektionsdruck ausüben und die Aktivität der ACT-Partnermedikamente beeinträchtigen [9]. Weitere 78 Millionen Malariafälle würden in Afrika gemeldet, wenn sich eine Artemisinin- und Partnermedikamentenresistenz entwickeln würde [10]. Die Resistenz gegen Malariamedikamente wird durch In-vitro-Arzneimittelsensitivitätstests, In-vivo-Studien zur therapeutischen Wirksamkeit oder die Überwachung molekularer Marker im Zusammenhang mit Resistenzen überwacht. Ein mögliches Ergebnis von Studien zur therapeutischen Wirksamkeit von Malariamedikamenten sind wiederkehrende Infektionen während der Nachbeobachtungstage, die auf eine erneute Infektion oder ein erneutes Auftreten von Parasiten zurückzuführen sind.

Artemisinin-Resistenz ist hauptsächlich mit Mutationen in mehreren Loci des P. falciparum kelch13 (PfK13)-Gens verbunden [11,12,13]. Resistenzen gegen die 4-Aminochinolin-Partnermedikamente wie Amodiaquin entwickeln sich durch Mutationen im P. falciparum-Chloroquin-Resistenztransporter (PfCRT) und im P. falciparum-Multidrug-Resistenz-1-Transporter (PfMDR1) [13], während die von Piperaquin durch Plasmepsin entsteht II- und III-Amplifikation [14]. Der Wirkungsmechanismus von Arylalkohol-Medikamenten wie Lumefantrin ist nicht genau verstanden, obwohl allgemein angenommen wird, dass sie die Häm-Entgiftung beeinträchtigen [15]. Eine Resistenz gegen Lumefantrin wurde mit einem Anstieg der Kopienzahl des pfmdr1-Gens in Verbindung gebracht [16]. Studien zur Resistenz von Parasiten gegen Lumefantrin sind aufgrund der schlechten Löslichkeit des Arzneimittels und des Fehlens eines klar definierten In-vitro-Schwellenwerts für die Resistenz gegen Lumefantrin eine Herausforderung [17]. Daher ist die Überwachung molekularer Marker, die mit der Resistenz von Parasiten gegen Artemisinin und seine Partnermedikamente in Zusammenhang stehen, für die Früherkennung und Reaktion auf neu auftretende Arzneimittelresistenzen erforderlich.

In Kenia sind 70 % der Gesamtbevölkerung gefährdet, an Malaria zu erkranken [18]. Ungefähr 19 % der ambulanten Besuche in Gesundheitseinrichtungen im Land werden auf die Krankheit zurückgeführt [19]. ACT wurde 2004 im Land zur Behandlung von Malaria eingeführt. Artemether-Lumefantrin (AL) ist die Medikamentenkombination der ersten Wahl, während Dihydroartemisinin-Piperaquin (DP) die zweite Wahl bei unkomplizierter Falciparum-Malaria ist [20]. ACT bleibt in Kenia gegen P. falciparum-Infektionen wirksam [21]. Im Land wurden nicht-synonyme Mutationen in der PfK13-Propellerregion identifiziert, aber keine ist mit einer Artemisinin-Resistenz verbunden [22, 23].

Plasmodium falciparum Cystein-Desulfurase IscS (Pfnfs1) (PF3D7_0727200) wurde mit Lumefantrin-Resistenz in Verbindung gebracht. In Gambia waren höhere IC50-Werte für die Wildtyp-K65-Allele und eine starke zeitliche Differenzierung desselben Allels über sieben Jahre mit der Lumefantrin-Resistenzselektion verbunden [24]. Das PfNFS1-Protein gehört zu einer Gruppe von Transferase-Enzymen, die als Cystein-Desulfurasen bekannt sind. Sie sind für die Fe-S-Biogenesewege essentiell, wo sie an der Abspaltung von Schwefelatomen von L-Cystein für den Aufbau von Eisen-Schwefel-Clustern (Fe-S) beteiligt sind. Der FeS-Clusteraufbau umfasst mehrere Komponenten, darunter Eisen- und Schwefelquellen, Gerüstproteine, Trägerproteine und akzessorische Proteine [25]. Diese Cluster aktivieren Proteine, die an der Genexpression, Zellentwicklung, Arzneimittelresistenz und Stoffwechselregulation unter Stressbedingungen beteiligt sind [26,27,28]. Das PfNFS1-Protein ist Teil des Eisen-Schwefel-Cluster-Synthesewegs (ISCS), der in den parasitären Mitochondrien lokalisiert ist [29], und der Weg ist an der Entwicklung von Parasiten im asexuellen Blutstadium beteiligt und ein mögliches Medikamentenziel [26]. Angesichts der entscheidenden Rolle der Eisenhomöostase in den Blutstadien von Malariaparasiten und der Arzneimittelmechanismen der Chinoline [24] müssen Gene wie Pfnfs1 weiter untersucht werden, um ihre mögliche Rolle bei der Arzneimittelwirkung und -resistenz zu bestimmen.

Diese Studie analysierte archivierte DBS, die an den Tagen 21, 28 und 42 nach der AL- und DP-Behandlung gesammelt wurden, um die Häufigkeit von Mutationen in der Zielregion des Pfnfs1-Gens und die damit verbundenen Folgen bei wiederkehrenden Infektionen zu bestimmen. Um Mutationen in der Zielregion des Pfnfs1-Gens zu untersuchen, wurde DNA aus dem DBS extrahiert, gefolgt von einer PCR-Amplifikation und Sequenzierung der Isolate.

Die Studie wurde in Matayos, Busia County, Westkenia durchgeführt. Matayos liegt auf einer Breite von 0,3618°N und einer Länge von 34,168°E, liegt auf einer Höhe von 1214 m über dem Meeresspiegel und hat eine Fläche von 196,2 Quadratkilometern. Die Region erlebt jährlich zwei Regenzeiten, von März bis Juni und von Oktober bis November. Das Gebiet hat eine hohe Malariaübertragungsrate und ist Teil des Viktoriaseebeckens. Dadurch bietet es geeignete Brutbedingungen für die wichtigsten Malariaüberträger Anopheles gambiae und Anopheles funestus, die eine kontinuierliche Malariaübertragung ermöglichen, während P. falciparum die am weitesten verbreitete Parasitenart ist in der Gegend [30].

In dieser Studie wurden archivierte DBS verwendet, die 2016 im Rahmen einer zweiarmigen Studie zur therapeutischen Wirksamkeit (TES) zu Artemether-Lumefantrin (AL) und Dihydroartemisinin-Piperaquin (DP) gesammelt wurden. Es kam ein randomisiertes, kontrolliertes Studiendesign zum Einsatz, bei dem die Teilnehmer während der Behandlung auf die Einhaltung der Behandlungsrichtlinien überwacht wurden. Die Nachbeobachtungstage der Behandlung waren der 7., 14., 21., 28. und 42. Tag nach der Behandlung. Die Studie wurde ohne Voreingenommenheit hinsichtlich des Geschlechts oder des Geschlechts durchgeführt. Die archivierten DBS wurden bei –20 °C gelagert. Zu den Zulassungskriterien der Studie gehörten: Einholung einer Einwilligung nach Aufklärung, Fieber in der Vorgeschichte mit einer Körpertemperatur von ≥ 37,5 °C, P. falciparum-Monoinfektion und Parasitämiewerte zwischen 2.000 und 200.000 Parasiten/μl Blut. Zu den Ausschlusskriterien gehörten Patienten, die in den vorangegangenen vierzehn Tagen wegen Malaria behandelt wurden, und freiwillige Abbrecher aus der Studie. Eine Malariainfektion wurde mikroskopisch bestätigt. Die Studie analysierte 71 DBS von Patienten mit wiederkehrenden Malariainfektionen. Diese DBS wurden an den Tagen 21, 28, 42 und 5 Proben von außerplanmäßigen Tagen nach der medikamentösen Behandlung mit AL oder DP gesammelt.

Zwei hochpolymorphe Marker, P. falciparum msp2 (Pfmsp2) und P. falciparum msp1 (Pfmsp1), wurden verwendet, um wiederkehrende Infektionen von Neuinfektionen nach den Standardmethoden zu unterscheiden (31). Das Pfmsp2-Gen wurde unter Verwendung des Vorwärtsprimers 5′-GAAGGTAATTAAAACATTGTC-3′ und des Rückwärtsprimers 5′-GAGGGATGTTGCTGTCTCCACA-3 für die primäre PCR sowie des Vorwärtsprimers 5′-GAGTATAAG GAGAAGTATG-3′ und des Rückwärtsprimers 5′-CTAGAACCATGCATATGTCC-3′ amplifiziert. für die sekundäre PCR. Das Pfmsp1-Gen wurde unter Verwendung des Vorwärtsprimers 5ʹ-CTAGAAGCTTTAGAAGATGCAGTATT-3ʹ und des Rückwärtsprimers 5ʹ-CTTAAATAGTATTCTAATTCAAGTGGATCA-3 für die primäre PCR und des Vorwärtsprimers 5-AAATGAAGAAGGAAATTACTACAAAAGG-3ʹ und des Rückwärtsprimers 5ʹ-GCTTGCATCAGCTGGAGGGCTTGCACC-3ʹ für die sekundäre PCR amplifiziert R. Sowohl die Pfmsp2- als auch die Pfmsp1-PCR-Reaktion wurden unter ähnlichen Bedingungen durchgeführt. Kurz gesagt bestand die Reaktionsmischung aus 5 × Firepol-Mastermix mit 12,5 mM MgCl2 (Solis Biodyne™, Kat.-Nr. 04-12-00125), 10 µM der Vorwärts- und Rückwärtsprimer, nukleasefreiem Wasser und 1 µl individueller genomischer DNA Auf ein Endreaktionsvolumen von 20 µl extrahieren. Die PCR-Amplifikation wurde im ProFlex PCR-System (Applied Biosystems) unter folgenden optimierten Bedingungen durchgeführt: Primäre PCR: anfängliche Denaturierung bei 94 °C für 3 Minuten, gefolgt von 30 Denaturierungszyklen bei 94 °C für 25 Sekunden, Annealing bei 1 Minute lang bei 42 °C und 2 Minuten lang bei 65 °C verlängert, gefolgt von einer abschließenden Verlängerung 3 Minuten lang bei 72 °C. Sekundäre PCR: anfängliche Denaturierung bei 94 °C für 3 Minuten, gefolgt von 30 Denaturierungszyklen bei 94 °C für 25 Sekunden, Annealing bei 50 °C für 1 Minute und Elongation bei 72 °C für 3 Minuten, gefolgt von einer abschließenden Verlängerung um 72 °C für 2 Min.

Die Analyse von Pfnfs1 wurde unter Verwendung archivierter DBS von Patienten mit rezidivierender Parasitämie durchgeführt. Genomische Parasiten-DNA wurde aus dem DBS mit dem QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Kat.-Nr. 51304) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die Zielregion des Pfnfs1-Gens wurde durch konventionelle PCR unter Verwendung des Vorwärtsprimers 5'-TTTGTGTTAAAAGACCTCATCCC-3' und des Rückwärtsprimers 5'-TCTTGGGTCAATCATTGTGGTT-3', die mit Benchling entworfen wurden, amplifiziert. Kurz gesagt bestand die Reaktionsmischung aus 5 × Q5-Reaktionspuffer (NEB™, Kat.-Nr. B9027S), 10 µM der Vorwärts- und Rückwärtsprimer, 10 mM dNTPs-Mischung, Q5-High-Fidelity-DNA-Polymerase (NEB, Kat.-Nr. M0491), Nuklease-freies Wasser und 1 µl einzelner genomischer DNA-Extrakt auf ein Endreaktionsvolumen von 25 µl. Die PCR-Amplifikation wurde im ProFlex PCR-System (Applied Biosystems) unter folgenden optimierten Bedingungen durchgeführt: anfängliche Denaturierung bei 98 °C für 30 s, gefolgt von 35 Denaturierungszyklen bei 98 °C für 15 s, Annealing bei 58 °C für 15 s und Verlängerung bei 72 °C für 2 min, gefolgt von einer abschließenden Verlängerung bei 72 °C für 7 min. Die PCR-Produkte wurden in einem 1,5 %igen Agarosegel analysiert und mit dem QIAquick PCR-Reinigungskit (Qiagen, Kat.-Nr. 28104) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Die gereinigten PCR-Proben wurden mit einem 3730xl DNA-Analysator-Sequenziergerät BigDye v3.1 (Applied Biosystems) sequenziert.

Die Software Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA), Version 10 [32], wurde verwendet, um die Sequenzen mit dem Referenzgen aus dem Genom des 3D7 P. falciparum-Stammes zu analysieren, das von PlasmoDB erhalten wurde. Die Häufigkeiten wurden als Prozentsatz der Sequenzen berechnet, die eine Mutation trugen, bezogen auf die Gesamtzahl der Sequenzen mit Daten für den interessierenden Locus.

Die Studie wurde am Kenya Medical Research Institute (KEMRI) durchgeführt. Alle Experimente wurden gemäß relevanten nationalen und internationalen Standards durchgeführt und von der Scientific and Ethics Review Unit (SERU) des Kenya Medical Research Institute unter der Genehmigung KEMRI/SERU/CTMDR/095/4172 genehmigt. Die ursprüngliche Studie war eine therapeutische Wirksamkeitsstudie zur Wirksamkeit von ACT und hatte die SERU-Zulassungsnummer SSC 2276.

Insgesamt wurden 334 Patienten in die Studie aufgenommen; 166 Patienten wurden mit AL und 168 mit DP behandelt. Das mittlere Alter der Patienten im AL-Behandlungsarm betrug 56 Monate, während das im DP-Arm 48 Monate betrug. 46 % der Patienten im AL-Behandlungsarm und 45 % im DP-Behandlungsarm waren weiblich. Insgesamt wurden 71 Patienten mit rezidivierender Parasitämie zu unterschiedlichen Nachbeobachtungszeitpunkten erfasst. Rezidivierende Infektionen nach einer AL- oder DP-Behandlung wurden an den Tagen 21, 28 und 42 sowie an außerplanmäßigen Tagen nach der Behandlung aufgezeichnet. Die Zielregion des Pfnfs1-Gens wurde in 64 Proben erfolgreich amplifiziert und sequenziert: 44 mit AL behandelte Patienten und 20 mit DP behandelte Patienten. 26 AL-behandelte Proben und 14 DP-behandelte Proben wurden sequenziert und sicher bewertet. 24 Proben (18 AL-behandelte und 6 DP-behandelte Proben) wurden nicht sicher bewertet und daher nicht für die weitere Analyse einbezogen. Am 21. Tag nach der Behandlung hatten 13 mit AL behandelte Patienten wiederkehrende Parasitämien, während bei mit DP behandelten Patienten keine wiederkehrende Infektion auftrat. Am 28. Tag nach der Behandlung zeigten 20 Patienten wiederkehrende Infektionen: 17 von den mit AL behandelten und drei von den mit DP behandelten Patienten. Weitere Nachuntersuchungen ergaben, dass 12 mit AL und 14 mit DP behandelte Patienten eine wiederkehrende Parasitämie aufwiesen, was insgesamt 26 Patienten am Tag 42 nach der Behandlung ergab. Zwei AL-behandelte und drei DP-behandelte Proben zeigten an außerplanmäßigen Nachbehandlungstagen eine wiederkehrende Parasitämie (Tabelle 1).

Parasitologische Daten der mit AL behandelten Patienten zeigten einen Anstieg der Parasitendichte um 31,7 % bei Patienten mit einer wiederkehrenden Infektion am 21. Tag im Vergleich zur entsprechenden Ausgangsparasitämie am Tag 0 (Tabelle 2). Mit zunehmender Parasitenzahl kam es am 21. Tag zu einem durchschnittlichen Rückgang des mittleren Hämoglobinspiegels (Hb) auf 9,7 g/dl (Tabelle 2). Bei den mit DP behandelten Patienten kam es am 28. bzw. 42. Tag nach der Behandlung zu einem Anstieg der Hb-Werte um 11,6 % bzw. 13,8 %, im Vergleich zu einem Anstieg um 9,4 % bzw. 7,2 % an ähnlichen Nachbeobachtungstagen bei den mit AL behandelten Patienten (Tisch 3).

Wiederkehrende Infektionen wurden als Infektionen kategorisiert, bei denen die Allele in gepaarten Proben am Tag 0 und am Tag der wiederkehrenden Infektion identisch waren (Zusatzdatei 1: Abb. S1). Zwei wiederkehrende Infektionen wurden am 28. Tag nach der Behandlung und eine wiederkehrende Infektion am 42. Tag nach der Behandlung im AL-Behandlungsarm festgestellt (Abb. 1). Im DP-Behandlungsarm wurde am 28. Tag nach der Behandlung eine wiederkehrende Infektion und am 42. Tag nach der Behandlung zwei wiederkehrende Infektionen festgestellt (Abb. 1). Am 21. Tag nach der Behandlung und an außerplanmäßigen Nachbeobachtungstagen wurde in beiden Behandlungsarmen kein Wiederauftreten festgestellt.

Anzahl der wiederkehrenden Infektionen an den Nachbeobachtungstagen nach der Behandlung mit Artemether-Lumefantrin (AL) und Dihydroartemisinin-Piperaquin (DP)

Die PCR-Amplifikation der Zielregion ergab ein 686-bp-Fragment (Zusatzdatei 2: Abb. S2). Nach der Sequenzierung der Zielregion des Pfnfs1-Gens wurden 26 der 44 mit AL behandelten wiederkehrenden Proben zuverlässig bewertet und analysiert. 15 mit AL behandelte wiederkehrende Proben besaßen das K65-Wildtyp-Allel, während das mutierte K65Q-Allel in 11 Proben nachgewiesen wurde. Das K65-Wildtyp-Allel wurde in zwei am 21. Tag entnommenen Proben, in sechs am 28. Tag entnommenen Proben und in fünf am 42. Tag entnommenen Proben nachgewiesen (Abb. 2A). Das mutierte K65Q-Allel wurde in vier Proben sowohl am 21. als auch am 28. Tag nach der Behandlung und in drei Proben, die am 42. Tag nach der Behandlung entnommen wurden, nachgewiesen (Abb. 2B). Die drei wiederkehrenden Proben, die im AL-Behandlungsarm der Studie nachgewiesen wurden, enthielten alle das K65-Wildtyp-Allel – zwei wurden am 28. Tag nach der Behandlung und eine am Tag 42 nach der Behandlung nachgewiesen (Abb. 2C).

Anzahl und prozentuale (%) Häufigkeit von A K65-Wildtyp-Allel bei wiederkehrenden Infektionen, B-K65Q-Mutanten-Allel bei wiederkehrenden Infektionen und C K65-Wildtyp-Allel in Rezidivproben am Tag 21, Tag 28, Tag 42 und außerplanmäßigen Tagen nach der Behandlung mit Artemether-Lumefantrin (AL)

Eine Auswertung wiederkehrender Infektionen im DP-Arm der Studie ergab, dass 14 der 20 DP-behandelten Proben nach der Sequenzierung zuverlässig bewertet und analysiert wurden. Elf Proben enthielten das K65-Wildtyp-Allel, während drei Proben das mutierte K65Q-Allel trugen. Das K65-Wildtyp-Allel, das typischerweise mit Lumefantrin-Resistenz assoziiert ist, wurde am 28. Tag mit einer Häufigkeit von 18 % nachgewiesen. Interessanterweise wurde die höchste Häufigkeit des K65-Wildtyp-Allels in beiden Behandlungsarmen am 42. Tag nach der DP-Behandlung mit einer Häufigkeit von nachgewiesen 55 % (Abb. 3A). Weitere Untersuchungen der wiederkehrenden Proben ergaben, dass das mutierte K65Q-Allel erst am Tag 42 nach der Behandlung nachgewiesen wurde (Abb. 3B). Zwei der drei wiederkehrenden Proben, die im DP-Behandlungsarm der Studie nachgewiesen wurden, enthielten das K65-Wildtyp-Allel – eine wurde am 28. Tag nach der Behandlung und die andere am 42. Tag nach der Behandlung nachgewiesen (Abb. 3C). Eine wiederkehrende Probe, die am Tag 42 nach der Behandlung entnommen wurde, enthielt das mutierte K65Q-Allel (Abb. 3D).

Anzahl und prozentuale (%) Häufigkeit von A K65-Wildtyp-Allel bei wiederkehrenden Infektionen B K65Q-mutiertes Allel bei wiederkehrenden Infektionen C K65-Wildtyp-Allel bei wiederkehrenden Infektionen D K65Q-mutiertes Allel bei wiederkehrenden Infektionen am Tag 21, Tag 28, Tag 42, und außerplanmäßige Tage nach der Behandlung mit Dihydroartemisinin-Piperaquin (DP)

Es wird angenommen, dass der Anstieg der Parasitenzahl bei den mit AL behandelten Patienten mit den erwarteten sinkenden LM-Konzentrationen unter die minimale Hemmkonzentrationsschwelle übereinstimmt. Studien haben gezeigt, dass ein Anstieg der Prävalenz und Intensität malariainduzierter Anämie mit wiederkehrenden Malariainfektionen verbunden ist, die durch das Wiederauftreten von Parasiten verursacht werden [33]. Es wird angenommen, dass die hohen Parasitenzahlen am 21. Tag zu einer Erschöpfung der zirkulierenden Erythrozyten führen, was zu niedrigen Hb-Werten und einer durch Malaria verursachten Anämie führt. Der schnelle Abbau roter Blutkörperchen und Entzündungen wurden mit einer geringeren Erholung der Erythrozyten bei Malariainfektionen in Verbindung gebracht [34]. In den Folgetagen nach dem ersten Nachweis einer wiederkehrenden Parasitämie wurde sowohl bei mit AL als auch mit DP behandelten Patienten kontinuierlich über Parasitämie berichtet. Frühere Studien deuten darauf hin, dass die Parasitenruhe oder -ruhe zu einer verzögerten Parasitenbeseitigung führt [35, 36]. Bei den mit DP behandelten Patienten wurde im Vergleich zu den mit AL behandelten Patienten eine höhere Hämoglobin-Erholung berichtet. In Uganda wurde auch berichtet, dass DP eine bessere Hämoglobin-Erholung aufweist, was durch den höheren mittleren Anstieg der Hb-Werte im Vergleich zu AL gezeigt wird [37]. In den meisten Fällen wurde jedoch berichtet, dass sich die Hb-Werte trotz Behandlungsversagens erholten und anstiegen [38]. Behandlungsversagen nach DP ist selten und wurde nur in drei Ländern Afrikas registriert, und diese Studien zeigten auch Behandlungsversagen bei AL [39,40,41].

Insgesamt handelte es sich bei 9 % aller wiederkehrenden Infektionen um wiederkehrende Infektionen, während es sich bei 91 % um Neuinfektionen handelte. Die hohe Zahl neuer Infektionen steht im Einklang mit der hohen Malariaübertragung im Untersuchungsgebiet. Bei diesen Infektionen könnten die Anteile des K65-Wildtyp-Allels und des K65Q-Mutanten-Allels ein Indikator für deren Verteilung in den in der Region zirkulierenden Parasiten sein. In dieser Studie betrug die Rate des Behandlungsversagens 1,80 % im AL-Arm der Studie und 1,78 % im DP-Arm der Studie und unterstreicht die Notwendigkeit einer konsistenten Überwachung der Wirksamkeit von Malariamedikamenten im Feldeinsatz.

Es wurde gezeigt, dass mit der Verwendung von AL ein Anstieg des K65-Wildtyp-Allels und der IC50 von LM gegen P. falciparum-Feldisolate zunimmt [24]. Darüber hinaus sagte ein mathematisches Modell eine Zunahme der erworbenen Resistenz gegen AL zwischen dem 20. und 39. Tag nach der Behandlung voraus [42]. In dieser Studie wurden keine Parasitenproben für nachfolgende In-vitro-Kulturen und die Bestimmung der IC50-Werte gesammelt. Es wurde beobachtet, dass rezidivierende Parasitämien bei AL früher auftraten als bei mit DP behandelten Patienten (Tabelle 1). Die Eliminationshalbwertszeit von Lumefantrin beträgt etwa vier bis fünf Tage [43], während die von Piperaquin auf 23 bis 33 Tage geschätzt wird [44]. Daher kann der Unterschied im Auftreten einer wiederkehrenden Parasitämie zwischen den beiden Behandlungen auf die unterschiedlichen Plasmaeliminationsraten des Arzneimittels bei den Patienten zurückzuführen sein. Darüber hinaus wurde eine um 56 % höhere Inzidenz wiederkehrender Infektionen nach der Behandlung mit AL als nach der Behandlung mit DP beobachtet, was darauf hindeuten könnte, dass sich Parasiten im Vergleich zu DP an den AL-Medikamentendruck anpassen. Es besteht eine wechselseitige Resistenz zwischen Arylalkohol-Medikamenten wie LM und Aminochinolin-Medikamenten wie Chloroquin (CQ) und PQ [45]. Die Auswahl von K65 kann daher zu einer höheren Anfälligkeit für Aminochinolin-Medikamente führen und so das Wiederauftreten des Parasiten verzögern. Im Vergleich zu einer in Kilifi, einer Küstenregion Kenias, durchgeführten Studie kam es in dieser Studie zu einer höheren Häufigkeit des K65-Wildtyp-Allels [46]. Dies könnte auf die unterschiedliche Malariaübertragung zwischen den beiden Regionen zurückzuführen sein. In der Küstenregion kommt es zu einer mäßigen Malariaübertragung, während in der endemischen Region am See, in der diese Studie durchgeführt wurde, eine hohe und stabile Malariaübertragung herrscht.

In dieser Studie wurden bis zum 42. Tag nach der AL-Behandlung wiederkehrende Infektionen gemeldet. Darüber hinaus wurde das K65-Wildtyp-Allel in der wiederkehrenden Probe nachgewiesen, die am Tag 42 nach der Infektion entnommen wurde. Der Nachweis einer erhöhten Anzahl von K65-Wildtyp-Allelen bei wiederkehrenden Infektionen vom 21. bis zum 42. Tag der Nachbeobachtungszeit könnte auf eine mögliche Selektionsrichtung nach fortgesetzter AL-Behandlung in der Region hinweisen. Zusammengenommen unterstreichen diese Daten den Nutzen einer Nachbeobachtungszeit von mindestens 42 Tagen bei Studien zur Wirksamkeit von Malariamedikamenten und zur Überwachung der Resistenz gegen Parasitenmedikamente. Ein Behandlungsversagen nach einer AL-Behandlung kann durch schlechte Absorption und Bioverfügbarkeit des Arzneimittels, Nichteinhaltung der Arzneimitteldosierung durch den Patienten und Parasitenresistenz verursacht werden. In Angola [47], der Demokratischen Republik Kongo [40] und Burkina Faso [41] wurde über Behandlungsversagen nach AL-Therapie berichtet. Eine aktuelle Studie im Distrikt Busia im Osten Ugandas, der relativ nahe an dem in dieser Studie untersuchten Standort liegt, berichtete ebenfalls über eine hohe Malariaprävalenz und eine geringe Wirksamkeit von AL [39]. Auch bei Reisenden aus Afrika wurde über Therapieversagen berichtet [48, 49]. Diese Studien deuten auf einen konsistenten Trend zum AL-Versagen und dem anschließenden erneuten Auftreten von Parasiten hin. Obwohl eine schlechte LM-Absorption als wahrscheinliche Ursache für die in dieser Studie beobachtete wiederkehrende Parasitämie nicht vollständig ausgeschlossen werden kann, deutet der Nachweis einer K65-Mutation im AL-Arm stark darauf hin, dass wiederkehrende Infektionen möglicherweise eher mit der K65-Mutation als mit einer schlechten Absorption zusammenhängen.

Ab dem 28. Tag wurde eine wiederkehrende Parasitämie im DP-Arm festgestellt. Danach stieg die Anzahl der wiederkehrenden Infektionen mit der Zeit an und erreichte am 42. Tag nach der Behandlung den Höhepunkt der wiederkehrenden Infektionen (Tabelle 1). Die höchste Anzahl wiederkehrender Infektionen wurde auch am 42. Tag nach der Behandlung festgestellt. Es ist inzwischen allgemein bekannt, dass Artemisinin-Derivate ruhende Parasiten induzieren, die wiederkehrende Infektionen befeuern, die mit einem erneuten Auftreten von Parasiten in vitro und in vivo einhergehen [50,51,52,53]. Die persistierenden Parasiten treten nach einer medikamentösen Behandlung wieder auf, wenn die Medikamentenkonzentration subtherapeutisch ist [54]. Dies kann darauf hindeuten, dass das langsame PQ-Eliminationsprofil das Wiederauftreten von Parasiten verzögern und Neuinfektionen zumindest aus der Ferne verhindern kann. Diese Beobachtung ist jedoch nicht einzigartig; Eine klinische Studie in Uganda berichtete auch über eine Zunahme wiederkehrender Parasitämien im Zusammenhang mit Rezidiven bei mit DP behandelten Personen vom 28. bis zum 42. Tag [39]. Studien in Asien haben auch über wiederkehrende Infektionen nach DP-Behandlung ab dem 28. Tag der Nachbeobachtungszeit berichtet [55, 56]. Rückfälle wurden auch bei Patienten berichtet, die mehr als sechs Wochen nach der Behandlung mit DP behandelt wurden [57]. Die relativ längere Eliminationshalbwertszeit von Piperaquin kann zu einem längeren Vorteil bei der Unterdrückung des Wiederauftretens von Parasiten führen, weshalb in dieser Studie am 28. Tag eine wiederkehrende Parasitämie einsetzte. Nach diesem Zeitraum nimmt die minimale Hemmkonzentration des Arzneimittels ab und noch nicht abgetötete Parasiten können sich ausbreiten, was die Wahrscheinlichkeit wiederkehrender Infektionen erhöht. Darüber hinaus könnten aufgrund des langen Eliminationsprofils von PQ sinkende Arzneimittelkonzentrationen im Plasma zur Selektion und Vermehrung von Parasiten führen, die gegen das Arzneimittel resistent sind.

Der Eisen-Schwefel-Cluster-Synthese-Weg (ISCS) wurde als vielversprechendes Ziel für Malariamedikamente vorgeschlagen, und Pfnfs1 ist für die Steuerung dieses Weges von entscheidender Bedeutung. Anhand von Proben, die nach mehr als zehn Jahren ACT-Einsatz in Kenia gesammelt wurden, zeigen die generierten Daten das Vorhandensein des K65-Lumefantrin-Resistenz-Selektionsmarkers bei wiederkehrenden Infektionen in Matayos, Westkenia. Aufgrund der Bedrohung durch neu auftretende arzneimittelresistente P. falciparum-Parasiten besteht ein Bedarf an einer kontinuierlichen Überwachung molekularer Marker für das Versagen der ACT-Behandlung, um klinische Daten bei der Information über die Behandlungspolitik in Kenia und anderen Gebieten mit hoher Malariaübertragung zu ergänzen. Zukünftige Studien sollten auch das Arzneimittelanfälligkeitsprofil der wiederkehrenden Parasiten und den Zusammenhang der beobachteten Mutationen mit der Arzneimittelanfälligkeit bewerten.

Der in dieser Studie verwendete Datensatz ist verfügbar und kann auf begründete Anfrage an den entsprechenden Autor weitergegeben werden.

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Wir danken dem Direktor des Kenya Medical Research Institute für die Erlaubnis, diese Arbeit zu veröffentlichen.

Die Afrikanische Union unterstützte diese Arbeit im Rahmen der Pan African University, Institute for Basic Sciences, Technology, and Innovation (PAUSTI), einem Ph.D. Stipendienpreis an BG.

Abteilung für Molekularbiologie und Biotechnologie, Panafrikanisches Universitätsinstitut für Grundlagenwissenschaften, Technologie und Innovation, Postfach 62000-00200, Nairobi, Kenia

Beatrice Gachie, Jean Chepngetich und Gabriel Magoma

Zentrum für traditionelle Medizin und Arzneimittelforschung (CTMDR), Kenya Medical Research Institute, Off Raila Odinga Way, PO Box 54840-00200, Nairobi, Kenia

Beatrice Gachie, Brenda Muriithi, Jean Chepngetich, Jeremiah Gathirwa und Peter Mwitari

Zentrum für biotechnologische Forschung und Entwicklung (CBRD), Kenya Medical Research Institute, Off Raila Odinga Way, PO Box 54840-00200, Nairobi, Kenia

Beatrice Gachie, Kelvin Thiong'o, Brenda Muriithi, Jean Chepngetich, Noah Onchieku und Francis Kimani

Abteilung für Biochemie, Jomo Kenyatta University of Agriculture and Technology (JKUAT), PO Box 62000 -00200, Nairobi, Kenia

Gabriel Magoma & Daniel Kiboi

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BG, DK und FK planten und gestalteten die Studie. BG führte die molekularen Analysen durch. BG, KT und DK führten statistische Analysen und Interpretationen durch. BG und DK haben das Manuskript erstellt. Alle anderen Autoren haben an der Manuskripterstellung mitgewirkt. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Beatrice Gachie.

Diese Studie wurde von der Scientific and Ethics Review Unit (KEMRI/SERU) des Kenya Medical Research Institute genehmigt.

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Abb. S1: Gelbild von PCR-Produkten aus der Amplifikation der Gene Plasmodium falciparum msp2 und Plasmodium falciparum msp1 aus ausgewählten Patientenisolaten. Spur 1 – 100-bp-Leiter; Spur 2 – Patientenprobe 1, Tag 0, MSP2 Spur 3 – Patientenprobe 1, Tag 28, MSP2, Spur 4 – Patientenprobe 1, Tag 0, MSP1, Spur 5 – Patientenprobe 1, Tag 28, MSP1; Spur 6 – 100-bp-Leiter, Spur 7 – Patientenprobe 2, Tag 0, MSP2, Spur 8 – Patientenprobe 2, Tag 42, MSP2, Spur 9 – Patientenprobe 2, Tag 0, MSP1, Spur 10 – Patientenprobe 2, Tag 42, MSP1; Spur 11 – 100-bp-Leiter, Spur 12 – Patientenprobe 3, Tag 0, MSP2, Spur 13 – Patientenprobe 3, Tag 21, MSP2, Spur 14 – Patientenprobe 3, Tag 0, MSP1, Spur 15 – Patientenprobe 3, Tag 21, MSP1, Spur 16 – 100-bp-Leiter. Spur 2–5: Neuinfektionen, Spur 7–10: Wiederkehrende Infektionen, Spur 12–15: Neuinfektion.

Abb. S2: Gelbild von PCR-Produkten aus der Amplifikation des Plasmodium falciparum-Cystein-Desulfurase-IscS-Gens aus ausgewählten Patientenisolaten. Spur 1 – 100-bp-Leiter, Spur 2 – Patientenprobe 1, Spur 3 – Patientenprobe 2, Spur 4 – Patientenprobe 3, Spur 5 – Patientenprobe 4, Spur 6 – Patientenprobe 5, Spur 7 – Patientenprobe 6, Spur 8 - Patientenprobe 7, Spur 9 - Patientenprobe 8, Spur 10 - Patientenprobe 9, Spur 11 - Patientenprobe 10, Spur 12 - Patientenprobe 11, Spur 13 - Patientenprobe 12, Spur 14 - Patientenprobe 13, Spur 15 - Patientenprobe 14, Spur 16 – 100-bp-Leiter.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Gachie, B., Thiong'o, K., Muriithi, B. et al. Prävalenz von Mutationen im Cystein-Desulfurase-IscS-Gen (Pfnfs1) bei wiederkehrenden Plasmodium falciparum-Infektionen nach einer Behandlung mit Artemether-Lumefantrin (AL) und Dihydroartemisinin-Piperaquin (DP) in Matayos, Westkenia. Malar J 22, 158 (2023). https://doi.org/10.1186/s12936-023-04587-2

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Eingegangen: 31. Januar 2023

Angenommen: 11. Mai 2023

Veröffentlicht: 19. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12936-023-04587-2

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