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Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 9445 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Pseudomonaden sind metabolisch flexibel und können auf verschiedenen pflanzlichen Wirten gedeihen. Die für die Promiskuität des Wirts erforderlichen Stoffwechselanpassungen sind jedoch unbekannt. Hier haben wir diese Wissenslücke geschlossen, indem wir RNAseq eingesetzt und die transkriptomischen Reaktionen von Pseudomonas donghuensis P482 mit Wurzelexsudaten zweier Pflanzenwirte verglichen haben: Tomate und Mais. Unser Hauptziel bestand darin, die Unterschiede und Gemeinsamkeiten zwischen diesen beiden Antworten zu identifizieren. Zu den Signalwegen, die nur durch Tomatenexsudate hochreguliert wurden, gehörten die Entgiftung von Stickoxid, die Reparatur von Eisen-Schwefel-Clustern, die Atmung durch das Zyanid-unempfindliche Cytochrom BD und der Katabolismus von Amino- und/oder Fettsäuren. Die ersten beiden weisen auf das Vorhandensein von NO-Donatoren in den Exsudaten der Testpflanzen hin. Mais induzierte spezifisch die Aktivität der MexE-RND-Typ-Effluxpumpe und die Kupfertoleranz. Mit der Motilität verbundene Gene wurden durch Mais induziert, durch Tomaten jedoch unterdrückt. Die gemeinsame Reaktion auf Exsudate schien sowohl durch Verbindungen, die aus den Pflanzen stammen, als auch durch solche aus ihrer Wachstumsumgebung beeinflusst zu werden: Arsenresistenz und Bakterioferritinsynthese wurden hochreguliert, während Schwefelassimilation, Wahrnehmung von Eisencitrat und/oder anderen Eisenträgern, Hämaufnahme usw Der Transport polarer Aminosäuren wurde herunterreguliert. Unsere Ergebnisse geben Hinweise zur Erforschung der Mechanismen der Wirtsanpassung in pflanzenassoziierten Mikroorganismen.

Pflanzen ernähren mikrobielle Gemeinschaften in der Rhizosphäre, indem sie Mischungen organischer Verbindungen über die Wurzeln freisetzen1. Wurzelexsudate enthalten primäre Metaboliten wie organische Säuren, Aminosäuren, Zucker und sekundäre Metaboliten mit bioaktiven oder signalgebenden Eigenschaften. Die genaue chemische Zusammensetzung von Exsudaten hängt von der Pflanzenart und dem physiologischen Status der Pflanze ab, wobei letzterer vom Entwicklungsstadium, der Nährstoffverfügbarkeit und dem Vorhandensein von Stressfaktoren abhängt2. Unterschiede in der Zusammensetzung der Exsudate und der Funktionsweise der angeborenen Immunität der Pflanze beeinflussen die Zusammensetzung und Aktivität der Wurzelmikrobiota3.

Pseudomonas-Bakterien können in verschiedenen Umweltnischen gedeihen, darunter auch in den Wurzeln verschiedener Wirtspflanzen. Ihr Wettbewerbsvorteil beruht auf der Flexibilität des Stoffwechsels und der Produktion einer breiten Palette sekundärer Metaboliten, darunter antimikrobielle Mittel und eisenbindende Verbindungen4. Viele pflanzenassoziierte Stämme erleichtern das Pflanzenwachstum, lindern abiotischen Stress oder schützen Pflanzen vor Krankheitserregern5. Es gibt keine umfassenden Studien zur phylogenetischen Breite der Pflanzen, die ein bestimmter Pseudomonas-Stamm besiedeln kann. Bestimmte Pseudomonaden haben sich jedoch als wirksame Biokontrollmittel bei Pflanzenarten erwiesen, die sich von denen ihres Ursprungs unterscheiden, oder bei mehreren Nutzpflanzen, was darauf hindeutet, dass Pseudomonaden eher promiskuitive Kolonisten von Pflanzen sind6.

Es wird immer mehr erkannt, dass Pflanzenarten unterschiedliche mikrobielle Gemeinschaften selektieren7, wobei phylogenetisch weiter entfernte Pflanzenwirte die unterschiedlichsten Mikrobiota-Populationen rekrutieren8. Daher wirft die offensichtliche Wirtspromiskuität einiger Mikroorganismen, wie z. B. Pseudomonaden, Fragen zu den Stoffwechselveränderungen auf, die Bakterien benötigen, um mehrere Wirte zu besiedeln oder eine Verbindung mit einem Wirt aufrechtzuerhalten, der physiologische Veränderungen durchläuft. Dieses Problem lässt sich mit den vorhandenen Daten nur schwer angehen, da sich die meisten Studien nur auf einzelne Wirt-Mikroben-Interaktionen befassen. Darüber hinaus wurden Determinanten der Wirtsspezifität bei Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Mikroben zwar eingehend für symbiotische Rhizobien untersucht, bei Bakterien, die weniger enge Bindungen mit ihren Wirten eingehen, wurde ihr jedoch wenig Aufmerksamkeit geschenkt9.

Pseudomonas donghuensis P482 ist ein Biokontrollstamm, der das Wachstum mehrerer bakterieller und pilzlicher Pflanzenpathogene hemmt10,11. Ursprünglich aus der Rhizosphäre von Tomaten (Solanum lycopersicum L.) isoliert, kann das Bakterium auch die Rhizosphäre von Kartoffeln12 und, wie in dieser Studie gezeigt, die Wurzeln von Mais besiedeln, was es insgesamt zu einem vielversprechenden Modell für die Untersuchung wirtsadaptiver Merkmale bei Promiscuous macht Wurzelbesiedelnde Bakterien.

In dieser Arbeit untersuchen wir, welche Stoffwechselwege Teil einer adaptiven Reaktion von Pseudomonaden auf verschiedene Pflanzenwirte sein können, indem wir Gene für differenzierende („wirtsspezifische“) und gemeinsame („wirtsunabhängige“) transkriptomische Reaktionen von Pseudomonas donghuensis identifizieren P482 gegen Wurzelexsudate von zwei phylogenetisch unterschiedlichen Pflanzenarten: Tomate (Dicot) und Mais (Monocot).

Die Methoden dieser Studie stehen im Einklang mit relevanten institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien und Gesetzen. Dieses Studienprotokoll entspricht auch der Grundsatzerklärung der IUCN zur Forschung an Arten, die vom Aussterben bedroht sind, und dem Übereinkommen über den Handel mit gefährdeten Arten freilebender Tiere und Pflanzen.

Der Rhizosphären-Kolonisierungstest wurde mit P482 Rif durchgeführt, einem spontanen Rifampicin-resistenten Mutanten von P48212. Aus mit P482 inokulierten Samen wurden Pflanzen 18 Tage lang in nicht sterilem Boden gezüchtet. Experimentelle Details finden Sie in den Zusatzinformationen (SI).

Tomate (Solanum lycopersicum L.) cv. Saint Pierre (Vilmorin Garden, Polen) und Mais (Zea mays L.) cv. Bejm (bereitgestellt vom Institut für Pflanzenzüchtung und Akklimatisierung, Smolice, Polen) wurden aus Samen gezüchtet.

Tomatensamen wurden durch 1-minütige Behandlung mit 70 % Ethanol, gefolgt von 3 Minuten in 3 % NaOCl und dreimaligem Spülen in sterilem destilliertem Wasser sterilisiert. Maissamen wurden durch zweimaliges Behandeln mit 3 % NaOCl für 15 Minuten, gefolgt von 10 Minuten in 70 % Ethanol und dreimaligem Spülen mit sterilem destilliertem Wasser oberflächensterilisiert. Oberflächensterilisierte Samen wurden auf Keimmedium (GM) (0,5 × Murashige- und Skoog-Medium mit Gamborg B5-Vitaminen, 2 % Saccharose, 0,2 % Weizenpepton und 0,7 % Pflanzenagar, pH ≈ 6,1) zum Keimen gebracht. Der Vorteil der Verwendung von gentechnisch veränderten Pflanzen besteht darin, dass durch die Zugabe von Pepton ein Screening der keimenden Samen auf mikrobielle Kontamination möglich ist. Tomaten keimten im Dunkeln bei 24 °C, während Mais im Licht bei 22 °C keimte. Gekeimte Samen ohne Anzeichen einer Infektion wurden in Behälter mit grobkörnigem Quarzsand (1,4–2 mm) (AQUAEL, Polen) überführt. Die Kulturbedingungen wurden für die Größe und den Nährstoffbedarf jeder Art optimiert: Mais wurde in 900-ml-Glasgefäßen in ¼ Hoagland-Medium, pH 5,6–5,8 (Hoagland's Nr. 2-Basalsalzmischung, Merck), 3 Sämlinge pro Gefäß kultiviert, während Tomaten wurde in GA-7-Magenta-Gefäßen (Merck) kultiviert, 6 Pflanzen pro Gefäß, in ½ Hoagland-Medium. Die Pflanzen wurden 13 Tage lang bei 22 °C und einer Photoperiode von 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit gezüchtet. Beide Pflanzenarten bildeten in diesem Zeitraum ein zweites Blattpaar.

Unter gnotobiotischen Bedingungen gewachsene Pflanzen wurden aus dem Sand entfernt. Die Wurzeln wurden 2–4 Minuten lang in Wasser gewaschen, in Glasbecher mit hochreinem, sterilem Wasser überführt und 2 Stunden lang inkubiert. Einige Blätter der kleinen Tomatenpflanzen berührten die Wasseroberfläche. Es wurden Exsudate von 174 Tomatenpflanzen und 48 Maispflanzen gesammelt, um genügend Exsudate für Bakterienkulturen (RNAseq) und chemische Analysen zu erhalten. Diese Anzahl an Pflanzen ergab 4,5 mg Tomatenexsudate und 6,6 mg Maisexsudate. Die Proben jeder Art wurden gepoolt und durch eine 0,22 µm schwach bindende PES-Membran (Thermo Scientific) filtersterilisiert. Die Proben wurden bei –80 °C eingefroren und gefriergetrocknet.

Eine nicht gezielte Analyse der chemischen Zusammensetzung von Wurzelexsudaten wurde mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) und Kernspinresonanz (NMR) durchgeführt. Die relative Menge von 21 Aminosäuren wurde mittels Flüssigchromatographie-selektiver Reaktionsüberwachungs-Massenspektrometrie (LC-SRM) bestimmt. Alle Einzelheiten finden Sie in den Zusatzinformationen (SI).

P482 wurde bei 28 °C in 1C-Medium (M9-Salze, 2 mM Mg2SO4, 0,1 mM CaCl2, 0,4 % Glucose13) mit oder ohne (Kontrolle) gefriergetrockneten Exsudaten von Tomaten oder Mais gezüchtet. Das Experiment wurde in 96-Well-Platten durchgeführt, die unter orbitalem Schütteln in einem EPOCH-Mikroplattenlesegerät (BioTek) inkubiert wurden, wobei die OD600 alle 20 Minuten gemessen wurde. Drei Konzentrationen von Exsudaten (0,02 mg L−1, 0,1 mg L−1, 0,2 mg L−1) wurden getestet, um ihren Einfluss auf die Wachstumsparameter von P482 zu überprüfen (Abb. S1). Die höchste Konzentration wurde später zum Züchten von Zellen zur Untersuchung mit RNAseq angewendet, da man davon ausging, dass die höchste Konzentration am wahrscheinlichsten zu exsudatinduzierten Veränderungen der Genexpression führt. Der pH-Wert des Mediums wurde vor der Inokulation und nach dem Wachstum von P482 in eine frühe stationäre Phase unter Verwendung von MQuant-pH-Indikatorstreifen (Supelco) gemessen.

Die Bakterien wurden nach Erreichen der frühen stationären Phase geerntet, nach 33 Stunden Wachstum in nicht ergänztem 1C-Medium und nach 24 bzw. 28 Stunden Wachstum in 1C-Medium mit Mais- oder Tomatenexsudaten (OD600 0,35–0,48) (Abb. S1). Pro Behandlung wurden drei Zellpools (ca. 109) durch Zentrifugation gesammelt und mit fixRNA (Eurx, Polen) fixiert. Jeder Pool wurde im nachgeschalteten RNAseq als separates biologisches Replikat behandelt. Die Gesamt-RNA wurde mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen) isoliert. Gereinigte RNA wurde mit dem TURBO DNA-free™ Kit (Thermo Fisher Scientific) behandelt. Das Fehlen einer gDNA-Kontamination wurde durch Echtzeit-PCR mit Primern bestätigt, die auf gyrB abzielten.

Neun RNA-Proben wurden sequenziert, mit 3 biologischen Replikaten für jede der beiden Exsudatbehandlungen und die Kontrolle (1 C-Medium allein). Die Bewertung der RNA-Integrität, die Depletion von rRNA, die Bibliotheksvorbereitung, die Illumina-Sequenzierung (mindestens 5 GB pro Probe), die Transkriptomassemblierung und die Analyse der differentiellen Genexpression wurden an Baseclear (Leiden, Niederlande) ausgelagert. Gefilterte RNA-seq-Reads wurden dem Referenzgenom von P482 zugeordnet (Genbank: JHTS00000000.1)14. Statistiken nach Filterung und Ausrichtung sind in den Tabellen S1 bzw. S2 verfügbar. Die Hauptkomponentenanalyse wurde angewendet, um zu überprüfen, ob die Replikatproben separate Cluster bilden (Abb. S2). Die Analyse der differentiellen Genexpression wurde mit DESeq2 1.22.215 durchgeführt. Weitere Analysen wurden intern durchgeführt. Die Veränderungen in der Genexpression wurden nach biologischer (1,5 log2-facher Veränderung (FC)) und statistischer Signifikanz (p < 0,05; angepasster p-Wert, Benjamini-Hochberg (B–H)-Korrektur zur Kontrolle der Falscherkennungsrate (FDR)) gefiltert. Gene mit padj > 0,05 und solche, denen der angepasste Wert (NA) nicht zugewiesen werden konnte, wurden von der nachgelagerten Analyse ausgeschlossen. Überlappende Gruppen unterschiedlich exprimierter Gene wurden mit BioVenn16 sichtbar gemacht. Proteine ​​wurden mithilfe des eggNOG-Mappers 5.017 Clustern orthologer Gruppen (COGs) und mithilfe von BlastKOALA18,19,20,21 den KEGG-Stoffwechselwegen zugeordnet. Die Anreicherung innerhalb der COGs und KEGG-Signalwege wurde unter Verwendung des Genoms von P482 als Referenz (JHTS00000000.1) ermittelt, wobei der exakte Fisher-Test zur Bestimmung der statistischen Signifikanz angewendet wurde (p < 0,05; angepasster p-Wert, B-H-Korrektur). Genvernetzung und Clusteranreicherung wurden mit STRING 11.5 (Mai 2023)22 analysiert, wobei das Genom von P. donghuensis HYS als Referenz diente11.

RNAseq-Daten wurden durch RT-qPCR unter Verwendung von sechs Zielen mit unterschiedlichen Expressionsmustern validiert: BV82_3254, mexE, norC, ssuC, trpB und ytfE. Reverse Transkription und Echtzeit-qPCR wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt23. Einzelheiten zur Grundierung finden Sie in Tabelle S3. Die Größe der Amplikons wurde durch Gelelektrophorese bestätigt (Abb. S3). Die Genexpressionsanalyse wurde mit qbase + 24 durchgeführt. Die verwendeten Referenzgene gyrB und rpoD wurden auf der Grundlage unserer vorherigen Arbeit23 ausgewählt und auf Stabilität im analysierten Datensatz bestätigt (durchschnittliches M = 0,543; CV = 0,181). Die Expression wurde auf die Proben skaliert, die aus P482 stammten, das in 1C-Medium ohne Exsudate (unbehandelt) gezüchtet wurde. Die statistische Signifikanz der Expressionsunterschiede wurde mithilfe eines ungepaarten t-Tests bewertet.

P482 Rif war auf den Wurzeln von 18 Tage alten Tomaten- und Maispflanzen vorhanden, die in Erde aus inokulierten Samen gewachsen waren. Basierend auf dem arithmetischen Mittel war die Populationsgröße an Tomatenwurzeln ungefähr zehnmal höher als die an Maiswurzeln und betrug 1,54 × 107 KBE g−1 bei Tomaten und 2,35 × 106 KBE g−1 bei Mais (Abb. S4). Bei Berücksichtigung der Medianwerte betrug der Unterschied das 25-fache, mit Populationsgrößen von 8,1 × 106 KBE g−1 und 3,1 × 105 KBE g−1 für Tomaten bzw. Mais. Trotz des Unterschieds kann die Populationsgröße von P482 auf beiden Pflanzen als hoch angesehen werden, was bedeutet, dass sich der Stamm an die Besiedlung beider Wirte anpassen kann.

Die Profilierung des gesamten Transkriptoms wurde für P482-Zellen durchgeführt, die in Gegenwart von Wurzelexsudaten von Tomaten oder Mais (0,2 mg L−1) gezüchtet wurden. Beide stimulierten das Wachstum des Bakteriums im Vergleich zu 1C-Medium allein (Abb. S1A, B). Im Transkriptom wurden 5168 Gene nachgewiesen, die 99 % des gesamten Genoms abdecken. Die Zuverlässigkeit der Messung der Transkripthäufigkeit durch RNAseq wurde mithilfe der Reverse-Transkription-Echtzeit-qPCR (RT-qPCR) für ausgewählte Ziele bestätigt (Abb. S5).

Tomatenexsudate veränderten die Expression von 413 Genen (7,99 %) im Vergleich zum nicht ergänzten Medium. Diese werden im Weiteren als tomateninduzierte differenziell exprimierte Gene (tiDEGs) bezeichnet. Mais-Exsudate beeinflussten die Expression von 181 Genen (3,51 %), die im Folgenden als miDEGs (Mais-induzierte DEGs) bezeichnet werden (Abb. 1). Die Tatsache, dass es mehr tiDEGs als miDEGS gab und dass sie einen höheren mittleren log2FC-Wert aufwiesen (2,27 log2FC vs. 2,14 log2FC; Datensatz S1), legt nahe, dass die Reaktion von P482 auf die Exsudate von Tomaten breiter und ausgeprägter war als die auf die Ausscheidungen von Mais. Es ist eine offene Frage, ob dies damit zusammenhängt, dass Mais nicht der ursprüngliche Wirt von P482 ist. Ein ähnliches Ausmaß der transkriptomischen Reaktion wie für P482 und Tomaten wurde für P. aeruginosa PAO1 berichtet, das in CAA-Medium wuchs, das mit Exsudaten von Rote Bete (Beta vulgaris) ergänzt war25. In der letztgenannten Studie, die darauf abzielte, neuartige und vermutlich wirtsspezifische Gene zu identifizieren, die an der Wechselwirkung zwischen Pflanze und Mikrobe beteiligt sind, verglichen die Autoren die Reaktion von PAO1 auf Exsudate von zwei Rote-Bete-Sorten, Celt und Roberta, von denen bekannt ist, dass sie nach verschiedenen mikrobiellen Gemeinschaften selektieren. Je nach Sorte waren 9,30 % und 8,13 % des Transkriptoms von PAO1 durch Exsudate beeinträchtigt.

Venn-Diagramm, das die Untergruppen der Gene in den durch Tomaten und Mais ausgelösten Transkriptomen von P. donghuensis P482 (A) und den Anteil der in jeder Untergruppe hoch- und herunterregulierten Gene (B) darstellt. tiDEGs (413) und miDEGs (181) zeigten im Vergleich zu nicht ergänztem Medium (Kontrolle) eine signifikant unterschiedliche Expression als Reaktion auf die Wurzelexsudate von Tomaten bzw. Mais. Im Gegensatz dazu zeigten die Gene der differenzierenden Reaktion (GDRs, 278), ein Satz, der von einer gepunkteten Linie umgeben ist, eine signifikante Veränderung in der Expression zwischen den beiden Exsudatbehandlungen. Die Shared-Response-Gene (SRGs, 63) wurden durch Überlagerung von miDEGs, tiDEGs und GDRs ermittelt und umfassen Gene, die von beiden Arten von Exsudaten auf ähnliche Weise beeinflusst werden. Weitere aus der Überlagerung resultierende Untergruppen sind tomatenspezifische GDRs (150) und maisspezifische GDRs (34). Diese erfüllten gleichzeitig zwei Kriterien: Sie gehörten zu DDRs und gleichzeitig unterschied sich ihre Ausprägung deutlich von der im Medium, wenn sie nur mit einem Exsudattyp behandelt wurden. Signifikanzgrenzen für eine signifikante Änderung des Ausdrucks: p < 0,05 (padj; B–H-Korrektur); log2FC > 1,5. Eine Liste der Loci in jeder Teilmenge finden Sie im Datensatz S6. In Panel B werden hochregulierte Gene in Magenta (links) und herunterregulierte Gene in Blau (rechts) angezeigt. In den Grafiken sind sowohl der Prozentsatz der Gene als auch die tatsächliche ORF-Anzahl angegeben.

Unser Ziel in dieser Studie war es, Stoffwechselwege zu identifizieren, die (1) unterschiedlich und (2) in ähnlicher Weise in P482 als Reaktion auf die Exsudate von Tomaten und Mais reguliert werden. Dazu haben wir zwei Genpools innerhalb des Transkriptoms bestimmt: Gene der Differentiating Response (GDRs) und der Shared Response Genes (SRGs). GDRs (278 Gene) sind Gene, deren Expression sich zwischen den beiden Exsudatbehandlungen deutlich unterscheidet (Abb. 1; Datensatz S2). Im Gegensatz dazu zeigen SGRs (63 Gene) unabhängig von der Quellpflanze ähnliche Reaktionen auf Exsudate. Die Überlagerung von GDRs, tiDEGs und miDEGs bestimmte den SGR-Pool. Diese Analyse ermöglichte außerdem die Unterscheidung von Untergruppen von GDRs, die wir als tomatenspezifische GDRs (150 Gene) und maisspezifische GDRs (34 Gene) bezeichneten (Abb. 1; Datensatz S2). Gene in den pflanzenspezifischen GDR-Untergruppen erfüllten gleichzeitig zwei Kriterien: Sie zeigten bei den beiden Exsudatbehandlungen eine unterschiedliche Expression (> 1,5 log2FC, padj < 0,05), was sie zu GDRs machte, aber auch ihre Expression war signifikant unterschiedlich (> 1,5 log2FC, padj < 0,05) im Vergleich zu 1C-Medium bei Behandlung mit nur einem der Exsudate. Die tomatenspezifischen und maisspezifischen GDRs wurden zusammen mit den SGRs auf hoch- und herunterregulierte Gene mit dem höchsten Rang analysiert (Tabellen S4–S6). Durch die Einrichtung pflanzenspezifischer GDRs konnten wir bestimmte Aspekte der gesamten Differenzierungsreaktion einer der Pflanzen zuordnen. Es verhinderte auch, dass maisbedingte Aspekte der Differenzierungsreaktion nicht ausreichend erfasst wurden, wenn man bedenkt, dass Tomatenexsudate mit einem größeren Anteil an GDRs der dominierende Treiber der Gesamtveränderungen sind.

Der vollständige Pool von 278 GDRs (differenzierende Reaktion) und 63 SGRs (gemeinsame Reaktion) wurde auf KEGG- und COG-Anreicherung und Genvernetzung analysiert (Abb. 2, 3; Datensätze S3–S4). Die interessantesten Ergebnisse werden im Folgenden vorgestellt und diskutiert, während einige kleinere Wege in SI beschrieben werden.

KEGG-Pfade und COG-Kategorien waren innerhalb der gemeinsamen (A, B) und differenzierenden (C, D) transkriptomischen Reaktionen von P482 auf Tomaten- und Maiswurzelexsudate deutlich angereichert. Für einzelne Gene innerhalb von Pfaden: Rot und Blau zeigen eine Hoch- bzw. Herunterregulierung der Genexpression an; Die linke Spalte zeigt Veränderungen im Ausdruck (log2FC) bei Zugabe von Tomatenexsudaten (Buchstabe T) und die rechte Spalte bei Zugabe von Maisexsudaten (Buchstabe M). KEGG-Kategorien: a – Kohlenhydratstoffwechsel, b – Umweltinformationsverarbeitung, c – Aminosäurestoffwechsel. In fetter Schrift dargestellte Gene sind in den angereicherten KEGG-Pfaden und COGs aufgeführt. Unterstrichene Gene überschneiden sich zwischen den Kategorien innerhalb der KEGG-Signalwege.

Genvernetzung für die 63 Gene der gemeinsamen (A) und 278 Gene der differenzierenden (B) transkriptomischen Reaktion von P482 auf Pflanzenwurzelexsudate. Die Analyse wurde mit STRING mit dem Genom von P. donghuensis HYS als Referenz durchgeführt und das Bild wurde manuell kuratiert. Jeder Knoten repräsentiert ein Gen von P482 mit einem mit eggNOG zugewiesenen Namen. Ausgefüllte Knoten markieren Gene, die zu angereicherten Gruppen gehören, die durch STRING identifiziert werden (Karte – KEGG-Signalweg, CL – Cluster, GO – Genontologie, PF, IPR – Proteindomänen). Netzwerkkanten zeigen Vertrauen an. Interaktion basierend auf allen verfügbaren Quellen für Version 11.5 (Mai 2023). Minimaler Interaktionswert 0,4 (mittel). Getrennte Knoten wurden deaktiviert, mit Ausnahme von Genen, bei denen festgestellt wurde, dass sie Teil angereicherter Cluster sind. Jedes Gen kann mithilfe des Datensatzes S5 mit einer Locus-Bezeichnung abgeglichen werden. Die vollständige Liste der STRING-Interaktionen und der angereicherten Gruppen finden Sie im Datensatz S4.

DDRs machten 5,38 % des Transkriptoms aus, mit einem ungefähr gleichen Anteil an herunterregulierten und hochregulierten. Im Vergleich dazu machten die SGRs 1,22 % des Transkriptoms aus, die meisten davon waren herunterreguliert (76 %) (Abb. 1). Daher betrug der Pool an Genen, die von zwei Wirten in P482 unterschiedlich beeinflusst wurden, ca. 4,5-mal größer als der Genpool der gemeinsamen Reaktion. Dasselbe wurde für PAO1 in zwei Rote-Bete-Sorten beobachtet25. Bei unterschiedlichen Wirtspflanzen wie Tomaten und Mais ist es verlockend, diesen Effekt auf die insgesamt artbedingten Unterschiede in der Zusammensetzung der Exsudate zurückzuführen. Die Tatsache, dass eine ähnliche Tendenz bei zwei Sorten einer einzigen Pflanzenart, der Roten Bete, beobachtet wurde, lässt jedoch darauf schließen, dass relativ geringfügige Änderungen in der Zusammensetzung pflanzlicher Verbindungen bahnbrechende Auswirkungen haben könnten. Im Einklang mit dieser Annahme wurde gezeigt, dass Verbindungen wie Benzoxazinoide und Cumarine im Alleingang einen tiefgreifenden Einfluss auf die Zusammensetzung der wurzelassoziierten Mikrobiota haben26,27.

Beide Exsudatbehandlungen verursachten eine Herunterregulierung der P482-Gene innerhalb der überlappenden Pfade für „Schwefelstoffwechsel“ und „ABC-Transporter“ (Abb. 2a, Tabelle 1). Dazu gehörten Gene, die für die CysW- und CysA-Komponenten der Sulfat-Thiosulfat-Permease (SulT) kodierten. Sulfat und Thiosulfat stellen anorganische Schwefelquellen dar, die von Bakterien genutzt werden28. In Abwesenheit von anorganischem Sulfat oder Cystein können Bakterien Alkansulfonate, einschließlich Taurin, als alternative Schwefelquellen nutzen28. In P482 regulierten beide Exsudate die Expression von TauBC und ssuBC herunter, die am Import von Taurin und anderen Alkansulfonaten beteiligt sind. Ein ähnlicher Einfluss wurde für ssuD und tauD beobachtet, die an der Freisetzung von Schwefel aus diesen Verbindungen beteiligt sind29. Darüber hinaus ermöglichte STRING die Identifizierung eines weiteren herunterregulierten Gens, das möglicherweise an der Schwefelaufnahme in P482 beteiligt ist, dem sfnR (Abb. 3a). In Pseudomonas putida DS1 wurde festgestellt, dass sfnR für die Gewinnung von Schwefel aus Dimethylsulfid (DMS)30 erforderlich ist.

Die Ergebnisse zeigen, dass beide Arten von Exsudaten die Expression mehrerer Gene im Zusammenhang mit der Schwefelaufnahme verringern. Eine Herunterregulierung der ssu-Gene oder sowohl der ssu- als auch der tau-Gene wurde auch bei 6 von 8 Pseudomonas spp. beobachtet. Stämme, die den Wurzelausscheidungen des Grases Brachypodium distachyon ausgesetzt sind31. Mais- und Tomatenpflanzen für die P482-Experimente und B. distachyon für die Experimente mit anderen Pseudomonaden wurden in Hoagland-Medium gezüchtet, das Sulfate (MgSO4, ZnSO4, CuSO4) enthielt. Dies könnte möglicherweise die Schwefelverfügbarkeit in den Wurzelausscheidungen der gemeinsam kultivierten Pflanzen beeinflussen. Andererseits wurden in beiden Studien Cystein und Methionin in den Exsudaten nachgewiesen, die eine Quelle für organischen Schwefel für Pseudomonas-Bakterien sein können.

Die häufige Reaktion von P482 auf Exsudate umfasste die Hochregulierung von arsC und arsH (Tabelle 1). Beide Gene stehen im Zusammenhang mit dem Metabolismus von Arsen, einem hochgiftigen Metalloid. Arsen ist in der Umwelt, auch im Boden, allgegenwärtig; Daher haben Bakterien unterschiedliche Mechanismen entwickelt, um es zu verarbeiten32. ArsC ist eine Arsenatreduktase, die fünfwertiges Arsenat (As(V)) in dreiwertiges Arsenit (As(III)) umwandelt, bevor As(III) aus der Zelle austritt33. Das zweite in P482 hochregulierte Gen, arsH, verleiht bestimmten Mikroorganismen Resistenz gegen Organoarsenverbindungen wie die dreiwertigen Formen des Herbizids Mononatriummethylarsenat und das aromatische Arsen Phenylarsenit33.

Man geht davon aus, dass die meisten methylierten Arsenspezies in der Umwelt mikrobiellen Ursprungs sind. Es wurde berichtet, dass einige Mikroorganismen methylierte Arsene als Waffen gegen ihre mikrobiellen Konkurrenten einsetzen34. Pflanzen methylieren Arsen im Gegensatz zu Mikroben nicht35. Stattdessen nehmen sie anorganische Arsenverbindungen aus dem Boden in Form von Arsenat auf, wahrscheinlich über die Phosphattransporter aufgrund der Ähnlichkeit dieser Moleküle, und extrudieren es über die Wurzeln zurück in den Boden, sobald es zu dreiwertigem Arsenit reduziert ist36. Wir nehmen an, dass die hochregulierte Expression von arsC und arsH in P482 durch Arsenat und Organoarsenverbindungen ausgelöst werden könnte, die aus dem sandigen Substrat, das für den Anbau von Tomaten und Mais verwendet wird, auf die Wurzeln übertragen wurden.

Eine der COG-Kategorien, die in der gemeinsamen Antwort erweitert wurden, war „Anorganischer Ionentransport und Metabolismus/Signaltransduktionsmechanismus“. Diese Doppelfunktionskategorie wurde durch sieben fecR-ähnliche Gene repräsentiert (Tabelle 1). Die FecR-Proteine ​​sind Transmembransensoren, die an der Signalübertragung beteiligt sind. In Escherichia coli kooperiert FecR mit dem Sigmafaktor FecI und dem Rezeptorprotein FecA, um die Expression des fecABCDE-Operons zu steuern, das an der Aufnahme von Eisencitrat beteiligt ist37. Allerdings können Bakterienarten viele fecR-ähnliche Gene beherbergen. Im Genom von P. aeruginosa gibt es vierzehn fecR-ähnliche Gene, die neben Eisenmangel-Sigma-Faktoren liegen und möglicherweise in Gegenwart verschiedener verwandter Eisenträger induziert werden können38. Pseudomonaden können nicht nur selbst hergestellte Siderophore verwenden, sondern auch solche, die von anderen Bakterien oder Pflanzen produziert werden, und so die Energiekosten ihrer Produktion auf andere Organismen verlagern39, ein Phänomen, das als „Siderophorenpiraterie“40 bezeichnet wird.

Andere Eisenquellen, die Pseudomonaden nutzen können, sind Hämmoleküle, die von Hämoproteinen freigesetzt werden41. Unter den SGRs von P482 kodierte das Gen mit der stärksten Herunterregulierung für ein Häm-bindendes Protein der A-Familie (−6,8 log2FC) (Tabelle S6). Auch andere Gene, die an der Aufnahme und dem Metabolismus von Häm beteiligt sind, wurden herunterreguliert. Dazu gehörten: hasR, hemO, hmuU und hmuV sowie hasD (Tabelle 1).

Um weiter zu untersuchen, wie die Zugabe von Wurzelexsudaten die Eisenverfügbarkeit zu P482 in unseren Experimenten beeinflusste, haben wir die Expressionsniveaus von drei Genen untersucht: BV82_1009, eine Synthase vom NRPS-Typ, die an der Synthese des potenten Siderophors Pyoverdin beteiligt ist; BV82_1008 (pvdS), ein Sigma-Faktor, der an der Regulierung der Synthese von Pyoverdin beteiligt ist, und BV82_4709, der an der Synthese von 7-Hydroxytropolon beteiligt ist, einer Verbindung mit eisenbindenden und antimikrobiellen Eigenschaften, die für P. donghuensis charakteristischer sind11. Wurzelexsudate beeinflussten die Expression keines dieser Gene (Datensatz S5). Die Expression von Pyoverdin war auch in keinem der acht Pseudomonas-Stämme, die in Wurzelexsudaten von B. distachyon gezüchtet wurden, hochreguliert31. In der letztgenannten Studie wurde die Hochregulierung anderer Gene im Zusammenhang mit der Eisenaufnahme nur bei der Hälfte dieser Stämme beobachtet. Dazu gehörten: Eisendicitrattransporter (Stämme SBW25 und 30–84), Biosynthese der Siderophore Ornicorrugatin (SBW25) und Pyochelin (Stamm Pf-5), Häm-abbauende Enzyme (2–79, 30–84) und TonB-assoziierte Gene (2–79 und Pf-5). In einer anderen Studie war die Expression von Genen im Zusammenhang mit der Häm-Akquisition und der Pyoverdin-Synthese in P. protegens CHA0 als Reaktion auf Weizen im Vergleich zu der bei der Infektion von Insekten beobachteten relativ gering42.

Im Gegensatz zur Herunterregulierung von Genen für die Eisenaufnahme regulierten Wurzelexsudate von Tomaten und Mais die Expression des Bakterioferritin-Gens bfr, das an der intrazellulären Eisenhomöostase beteiligt ist, deutlich hoch. Bfr fungiert bei der Speicherung von Eisen, das, wenn es in freier Form im Überschuss vorhanden ist, durch die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies oxidativen Stress in den Zellen verursachen kann43. Es wurde gezeigt, dass Bacterioferritin und Bfr-interagierende Proteine ​​für die Stressresistenz und Virulenz sowohl bei pflanzlichen als auch bei tierischen Krankheitserregern von wesentlicher Bedeutung sind44,45. Sie spielen auch eine Rolle bei den wurzelknötchenbildenden Pflanzensymbionten46.

Die Hochregulierung von Bfr in P482 ist eine weitere indirekte Annahme, dass Wurzelexsudate allein für P482 und zumindest einige andere Pseudomonaden nicht eisenlimitierend sind. Es ist jedoch sehr wahrscheinlich, dass P482 seine Eisenfängermechanismen in Gegenwart mikrobieller Konkurrenten einsetzen muss.

Bei der Exposition von P482 gegenüber beiden Exsudaten beobachteten wir eine höhere Expression von tagQ, pppA und crp. Bei P. aeruginosa sind tagQ und pppA an der Regulationskaskade beteiligt, die die Aktivierung des Typ-VI-Sekretionssystems (T6SS) steuert, wobei pppA als negativer Regulator von T6SS47 gilt. Das dritte Gen, crp, kodiert für ein zyklisches AMP-Rezeptor-ähnliches Protein. Es gibt nur wenige Berichte über die Rolle von Crp bei der Regulierung von T6SS und betreffen Vibrio cholerae, wo Crp als positiver T6SS-Regulator vermutet wurde48. Insgesamt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass das Vorhandensein von Wurzelexsudaten einen gewissen Einfluss auf T6SS in P482 hat, das in Monokulturen angebaut wird. Die Richtung dieser Auswirkungen erfordert jedoch weitere Untersuchungen. Wir können auch davon ausgehen, dass die Expression von T6SS-verwandten Genen in Gegenwart konkurrierender (Mikro-)Organismen unterschiedlich wäre. Das T6SS ermöglicht es Bakterien, Proteine ​​in andere prokaryotische oder eukaryotische Zellen zu injizieren, und ist vor allem für seine Rolle im interbakteriellen Wettbewerb bekannt49.

Mit Tomaten behandeltes P482 zeigte die Symptome von durch Stickstoffmonoxid verursachtem Stress (auch als nitrosativer Stress bezeichnet). Stickstoffmonoxid ist ein frei diffundierendes Molekül, das toxische Wirkungen auf Zellen ausübt. Um nitrosativem Stress entgegenzuwirken, haben Bakterien mehrere Wege entwickelt, um NO in unschädliche Moleküle wie N2O, NO3− oder Ammoniak umzuwandeln50. Eines der beiden Gene mit der stärksten Hochregulierung in P482 war das für Flavohämoglobin (Hmp) kodierende hmp (BV82_4743). Die Expression dieses Gens war in P482, das in Tomatenexsudaten gezüchtet wurde, jedoch nicht in Mais, stark erhöht (6,13 log2FC). Unter aeroben Bedingungen katalysiert Hmp die Reaktion von NO mit Sauerstoff zu Nitrat (NO3−)51. Ein ähnliches Muster der Veränderungen der Genexpression wurde bei norD, norC und norB beobachtet, die für Stickoxidreduktase (NOR) kodieren. Dieses membranintegrierte Enzym katalysiert die Reduktion von Stickoxid (NO) zu Lachgas (N2O)52. Hmp und NOR sind gut dokumentierte Komponenten des NO-Entgiftungsmechanismus in Bakterien.

NO, das auf eine Bakterienzelle einwirkt, kann aus der Umgebung stammen oder von den Zellen selbst erzeugt werden. NO ist ein bekanntes Zwischenprodukt bei der schrittweisen Reduktion von Nitrat über Nitrit zu Stickoxid53. Dieser als Denitrifikation bezeichnete Prozess kann von einigen Pseudomonas-Bakterien bei begrenzter Sauerstoffverfügbarkeit durchgeführt werden, um den Sauerstoffmangel als terminalen Elektronenakzeptor bei der Atmung zu überwinden54. Die Bildung von NO aus Nitrit im zweiten Schritt der Denitrifikation erfordert die Aktivität von NirS, einer periplasmatischen Cytochrom-cd1-Nitritreduktase, die Häm-c- und Häm-d1-Cofaktoren trägt55. P. donghuensis P482 besitzt ein Homolog von nirS (BV82_3250) und Homologe mehrerer anderer Gene des Nir-Clusters (nirCFLGHNBDJM). Bei P482, das mit Tomatenexsudaten behandelt wurde, ging die Hochregulierung der NO-entgiftenden Gene nicht mit der Induktion von Nir-Genen einher. Daher ist die zugrunde liegende Ursache für die Aktivierung der NO-Entgiftungswege in P482 nicht eine Schalterdenitrifikation, sondern vielmehr die Bewältigung der Toxizität von exogenem NO, das in Tomatenexsudaten vorhanden ist.

Schädliche Wirkungen von NO resultieren hauptsächlich aus der Inaktivierung von Proteinen, die Eisen-Schwefel-Cluster (Fe-S) enthalten56,57. Fe-S-Cluster sind redoxaktive Protein-Cofaktoren, die in fast allen Organismen vorkommen und für viele grundlegende biochemische Prozesse benötigt werden58. In mit Tomaten behandeltem P482 sahen wir eine deutliche Hochregulierung von yftE (6,36 log2FC), das für seine Rolle beim Metabolismus/der Reparatur von Fe-S-Clustern bekannt ist. Homologe von ytfE sind in zahlreichen Bakterien vorhanden59, und das Gen wird bei Bakterienexposition gegenüber NO60 kontinuierlich hochreguliert. Es wurde gezeigt, dass das YftE-Protein zum Überleben von Yersinia pseudotuberculosis in der Milz nach nitrosativem Stress beiträgt und zur Virulenz dieses menschlichen Krankheitserregers beiträgt57. Ein weiteres Gen, dessen Expression durch Tomatenexsudate maßgeblich induziert wurde, ist das nnrS (BV82_3241). NnrS ist ein häm- und kupferhaltiges Transmembranprotein, das zur NO-Stresstoleranz bei Vibrio cholerae beiträgt, indem es Stress abbaut, der durch die Bildung von Eisen-NO-Komplexen verursacht wird61. Bemerkenswert ist, dass yftE und nnrS einen einzigen Gencluster (BV82_3238 bis BV82_3246) mit den NOR-kodierenden Genen und zwei Regulatoren bilden: norR und dnr. Die in P482 durch Tomatenexsudate verursachte Belastung der Fe-S-Cluster wird weiter durch die Hochregulierung der Gene iscR, iscS, iscU, iscA, hscB, hscA und fdx (Abb. 3b) bestätigt, die für Proteine ​​im Zusammenhang mit der Schwefelcluster-Biogenese kodieren62.

Eukaryontische Wirte können als Teil der Abwehr während einer Infektion Stickstoffmonoxid produzieren63. Pflanzen nutzen NO als Signalmolekül als Reaktion auf biotischen und abiotischen Stress und eine Vielzahl physiologischer Prozesse, einschließlich Keimung, Entwicklung, Blüte und Seneszenz64. Da NO hochreaktiv ist, wird es in S-Nitrosothiolen (SNOs) gespeichert, die in vivo als NO-Reservoir fungieren64. NO spielt eine Rolle bei der Reaktion von Pflanzen auf mikrobielle Krankheitserreger, ist aber auch entscheidend für die Etablierung symbiotischer Interaktionen zwischen Rhizobien und Hülsenfrüchten65. Es wurde vermutet, dass NO ein wesentliches Signalmolekül bei der Kommunikation zwischen Pflanzen und Mikroben sein könnte64. Im Fall von P482 ist es wichtig zu beachten, dass das offensichtliche Vorhandensein von Faktoren, die nitrosativen Stress in Tomatenexsudaten verursachen, keinen negativen Einfluss auf die Wachstumsrate von P482 in vitro hatte (Abb. S1). Dies bedeutet, dass P482 gut an die auftretenden Bedingungen angepasst ist.

Pseudomonaden besitzen eine verzweigte Atmungskette. Es ist bekannt, dass in P. aeruginosa fünf verschiedene terminale Oxidasen wirken, die es dem Bakterium ermöglichen, eine Elektronentransportkette zu nutzen, die unter den gegebenen Umständen am besten geeignet ist54. In P482 beobachteten wir als Reaktion auf Tomatenexsudate, jedoch nicht auf Mais, eine Herunterregulierung der Gene ccoN, ccoO, ccoQ und ccoP, die für die Untereinheiten einer Cytochrom-C-Oxidase vom Typ cbb3 kodieren. Diese Oxidase hat eine hohe Affinität zu Sauerstoff und ist für das Überleben der Zellen unter mikroaeroben Bedingungen von entscheidender Bedeutung66. Im Gegensatz zu cco-Genen waren cioA und cioB, die für die Cyanid-unempfindliche Oxidase (CIO) des Cytochrom-BD kodieren, hochreguliert. Mikroorganismen, die auf den CIO-Weg umschalten können, können hohen Konzentrationen von Blausäure standhalten, die die Atmung durch Cytochrom-C-Oxidasen blockieren67. Stamm P482 ist zur Produktion von Cyanwasserstoff fähig68. Allerdings waren in P482, das Tomatenexsudaten ausgesetzt war, die Gene hcnA und hcnB, die für die Cyanwasserstoff-Synthase kodieren, herunterreguliert, was bedeutet, dass die hochregulierte Expression von Cyanid-unempfindlichem Cytochrom bd in diesem Stamm nicht auftritt, um der Toxizität hoher Mengen an selbst produziertem Cyanwasserstoff entgegenzuwirken .

Obwohl die cio-Gene ursprünglich mit der Resistenz von Bakterien gegen Blausäure in Verbindung gebracht wurden, können andere Faktoren ihre Expression beeinflussen. Cyanid-unempfindliches Cytochrom bd spielt eine Rolle bei der Kupferlimitierung unter aeroben Bedingungen69 und verleiht Bakterien Toleranz gegenüber oxidativem und nitrosativem Stress70. Darüber hinaus war cioA an der Umgehung der Wirtsabwehr durch Pseudomonas sp. beteiligt. WCS365 während der Interaktion mit Arabidopsis thaliana71.

Wir nehmen an, dass eine Verschiebung hin zu Cytochrom bd (CIO) bei P482, das mit Tomatenexsudaten behandelt wurde, auf das Vorhandensein von Inhibitoren des Cytochromkomplexes bc1 und/oder Stickoxid zurückzuführen ist. Der Cytochrom-Komplex bc1 ist erforderlich, um die Elektronen an die Cytochrom-c-Oxidasen wie cbb3 weiterzuleiten, nicht jedoch an CIO, das Elektronen direkt von Ubichinon empfängt54,72. Die bakterizide Wirkung von bc1-Inhibitoren wurde durch die gleichzeitige Zugabe von NO-Donoren bei Mycobacterium tuberculosis erheblich verstärkt, eine Wirkung, die Bakterien durch die Umstellung auf den Cytochrom-bd-Weg73 zu bekämpfen versuchten. Cytochrom-bd-Oxidase ist aufgrund der schnellen Dissoziationsrate von NO aus seinem aktiven Zentrum resistenter gegen NO-Hemmung.

Der Zwischenstoffwechsel in P482 wurde hauptsächlich durch die Exsudate von Tomaten beeinflusst. Drei überlappende KEGG-Signalwege wurden innerhalb der differenzierenden Reaktion angereichert: „Pyruvat-Metabolismus“, „Propanoat-Metabolismus“ und „Valin-, Leucin- und Isoleucin-Abbau“. Diese teilen Gene mit angereicherten COGs im Zusammenhang mit „Energieerzeugung und -umwandlung“ (Abb. 2c, d).

Tomatenexsudate erhöhten die Expression von lpdV, bkdB, bkdA2 und pdhA (Tabelle 1). Proteinprodukte dieser Gene sind die Komponenten des verzweigtkettigen Alpha-Keto-Dehydrogenase-Komplexes, einem von drei Multienzymkomplexen, die Pyruvat, 2-Oxoglutarat und verzweigtkettige 2-Oxosäuren metabolisieren. Die Gesamtfunktion dieser Komplexe ist die Umwandlung von Alpha-Ketosäuren in Acyl-CoA und CO2. Alpha-Ketosäuren entstehen häufig durch oxidative Desaminierung von Aminosäuren und sind umgekehrt die Vorläufer für deren Synthese74. Die von bkdA2 und pdhA kodierte 2-Oxoisovalerat-Dehydrogenase ist ein Enzym, das am Abbau verzweigtkettiger Aminosäuren (BCAA) beteiligt ist: Valin, Leucin und Isoleucin75. In P482 beobachteten wir eine gleichzeitige Hochregulierung von mmsA und mmsB. Bei P. aeruginosa ist das mmsAB-Operon am Metabolismus von Valin beteiligt, und die Störung dieser Gene führte zu einem verlängerten Wachstum des Stamms auf dem Valin/Isoleucin-Medium76. Bei einigen Bakterien scheint die Verfügbarkeit von BCAA regulatorische Funktionen zu haben und eine Rolle bei Prozessen wie der Proliferation während einer Infektion und der Umgehung der Wirtsabwehr zu spielen78. Im Gegensatz zu dem, was wir für P482 in Gegenwart von Tomatenexsudaten beobachteten, regulierten sowohl S. typhimurium als auch E. fredii die BCAA-Synthese hoch und nicht deren Katabolismus, wenn sie den Exsudaten von Salat bzw. Zwischenfruchtmais ausgesetzt wurden79,80.

Abgesehen von BCAA scheint der Abbau von drei weiteren Aminosäuren in P482 durch die Behandlung mit Tomatenexsudat induziert zu werden. Dazu gehörten Phenylalanin (Gene phhA, phhB und phhC), Glycin (gcvH und gcvP) und Methionin (aceE/mdeB, mdeA) (Tabelle 1).

Weitere metabolische Veränderungen in P482, die mit einem erhöhten Katabolismus von Aminosäuren und/oder Fettsäuren verbunden sind, umfassen die Hochregulierung der Acyl-CoA-Dehydrogenasen MmgC und Ivd, die die α,β-Dehydrierung von Acyl-CoA-Estern81 katalysieren, und die Hochregulierung der für aceA kodierenden Isocitrat-Lyase. Letzteres impliziert die Aktivierung des Glyoxylat-Shunts (GS). Viele Bakterien aktivieren GS, wenn Acetyl-CoA, das beim Abbau von Aminosäuren oder Fettsäuren entsteht, die primäre Kohlenstoff- und Energiequelle ist, die der Zelle zur Verfügung steht82. Der klassische Tricarbonsäurezyklus (TCA) kann aufgrund des Verlusts von CO2 und der Unfähigkeit, Oxalacetat zu recyceln, keinen Kohlenstoff assimilieren und Citrat recyceln, wenn Acetyl-CoA die einzige verfügbare Kohlenstoffquelle ist. Der GS umgeht die Kohlendioxid erzeugenden Schritte von TCA und leitet einen Teil des Kohlenstoffflusses bei Isocitrat um. Abgesehen von seiner wesentlichen Rolle im Acetat- und Fettsäurestoffwechsel könnte der Glyoxylat-Shunt eine noch wenig erforschte Rolle bei der Stressabwehr und Pathogenese spielen. Die Expression von aceA in P. aeruginosa wurde unter H2O2-induziertem oxidativem Stress und unter eisenlimitierenden Bedingungen hochreguliert und ist mit der interzellulären Eisenhomöostase verbunden72. Dieser Stoffwechselweg ist auch von zentraler Bedeutung für das Wachstum und die Virulenz von P. aeruginosa während einer Infektion, wenn das Bakterium den Abbau von Fettsäuren bevorzugt83. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die Umschaltung des TCA und die Verlagerung hin zur Verwendung von Aminosäuren die Antibiotikaresistenz bei P. aeruginosa erhöhen84. Interessanterweise wurde die GS im humanpathogenen Salmonellen aktiviert, wenn sie mit Salatexsudaten gezüchtet wurde79.

Hier haben wir den anfänglichen Exsudatgehalt analysiert (detaillierte Beschreibung in SI). Die LC-SRM-Analyse des relativen Gehalts an Aminosäuren in den Exsudaten von Mais und Tomaten ergab, dass BCAA-Valin und Leucin in Maisexsudaten etwa viermal häufiger vorkamen als in Tomaten. Der Gehalt an Isoleucin war in beiden Proben gleich (Tabelle S7). . Die Menge an Phenylalanin und Tryptophan war in Mais 4,5- bzw. 2,3-mal höher als in Tomaten. Die Menge an Methionin in den beiden Exsudaten unterschied sich nicht. Daher ist es nicht so, dass Aminosäuren, deren Katabolismus bei mit Tomatenexsudaten behandeltem P482 hochreguliert ist, bei dieser Behandlung häufiger vorkommen. In unserem Versuchsaufbau wurde der Einfluss der Exsudat-Supplementierung auf P482 in einem Glucose-haltigen Minimalmedium untersucht. Dies machte Glukose zur am häufigsten vorkommenden Kohlenstoffquelle bei Behandlungen und Kontrollen. Ein ähnlicher Ansatz wurde in der Studie zum Einfluss von B. distachyon-Exsudaten auf verschiedene Pseudomonas spp.31 angewendet. Es ist möglich, dass P482 in Kulturen mit Tomatenexsudaten die Glukose schneller verbrauchte als in den mit Mais ergänzten Proben. Daher würden mit Tomaten behandelte Zellen zum Zeitpunkt der Ernte bereits Aminosäuren verwenden, um ihr Wachstum zu unterstützen. Eine nicht gezielte Analyse mittels 1H-NMR ergab, dass Glukose zwar in großen Mengen in Maisexsudaten (9947 ng mg−1) vorlag, in den Exsudaten von Tomaten jedoch nicht vorhanden war (Tabelle S8, Abb. S6, S7). Es bleibt jedoch fraglich, ob die mit den Exsudaten zugesetzte Glukosemenge ausreichen würde, um einen solchen Einfluss auf die Gesamtverfügbarkeit von Glukose im 1C-Medium zu haben.

Wir schlagen vor, dass eine Umstellung auf den Aminosäurekatabolismus bei mit Tomaten behandeltem P482 darauf abzielt, die Resistenz von Zellen gegenüber Stressfaktoren zu erhöhen, ähnlich wie es für P. aeruginosa in menschlichen Infektionsmodellen berichtet wurde83,84. Das Vorhandensein von NO, das die Fe-S-Cluster in den aktiven Zentren einiger Enzyme schädigt, kann bestimmte Stoffwechselwege beeinträchtigen. In einem solchen Fall wäre die beobachtete Verschiebung im intermediären Metabolismus von P482 nicht auf eine Bevorzugung spezifischer Kohlenstoffquellen und deren Verfügbarkeit in den Exsudaten zurückzuführen, sondern vielmehr auf die Wahl von Stoffwechselwegen, die weniger empfindlich auf den jeweiligen Stressor reagieren. Pflanzliche Stressfaktoren können entweder artspezifisch sein oder mit dem physiologischen Status einer bestimmten Pflanze zusammenhängen. Die Richtigkeit dieser Hypothese erfordert weitere Studien.

In Gegenwart von Tomatenexsudaten war die Expression der Gene, die für Tryptophansynthase, trpA und trpB kodieren, deutlich herunterreguliert, was auf eine verringerte Tryptophansynthese durch P482 schließen lässt. Tryptophan ist eine proteinogene aromatische Aminosäure, die auch eine Vorstufe von Signalmolekülen wie dem Pflanzenhormon Indol-3-Essigsäure (IAA), Kynurenin und dem Pseudomonas-Chinolon-Signal (PQS) sein kann85. Im Gegensatz dazu beobachteten wir eine signifikante Hochregulierung von metE (4,73 log2FC). MetE ist ein 5-Methyltetrahydropteroyltriglutamat, eine Homocystein-S-Methyltransferase, die die Übertragung einer Methylgruppe von 5-Methyltetrahydrofolat auf Homocystein katalysiert, was zur Bildung von Methionin führt. Gene im Zusammenhang mit der Methioninsynthese wurden in E. coli nach der Behandlung mit S-Nitrosoglutathion unter Bedingungen, die nitrosativem Stress nachahmen, hochreguliert. In der letztgenannten Studie zeigten E. coli-Mutanten, deren Methioninsyntheseweg gestört war, eine verringerte Toleranz gegenüber S-Nitrosoglutathion und dass die Zugabe von exogenem Methionin diesen Effekt aufheben könnte86. Dies deutet darauf hin, dass Methionin auch eine Rolle bei der Bekämpfung von nitrosativem Stress in P482 spielen könnte.

Darüber hinaus war die Methioninsynthese für den Aufbau einer Symbiose zwischen dem stickstofffixierenden Sinorhizobium meliloti und seiner Wirtspflanze, Medicago sativa, von entscheidender Bedeutung87. Im Gegensatz zu dem, was wir bei P482 in Gegenwart von Wurzelausscheidungen von Tomaten beobachteten, war die Methioninsynthese bei PAO1 als Reaktion auf Ausscheidungen von Rote Bete25 und bei S. typhimurium als Reaktion auf Ausscheidungen von Salat79 verringert. Dies legt nahe, dass die Rolle der Methioninsynthese in pflanzenassoziierten Bakterien vom untersuchten Pflanze-Mikroben-System abhängt.

Im Zusammenhang mit der Beeinflussung der Aminosäuresynthese und des Katabolismus bei mit Tomaten behandeltem P482 ist zu erwähnen, dass diese möglicherweise auch weniger eindeutige Ursachen haben. In P. fluorescens ist die Phenylalanin-4-hydroxylase (PAH) nicht nur am Abbau von Phenylalanin beteiligt, sondern auch an der Biosynthese des Antioxidans Melatonin aus Tryptophan88,89. Es wurde auch gezeigt, dass Tryptophan, Methionin, Tyrosin und Phenylalanin, die bekannten Vorläufer pflanzlicher Sekundärmetaboliten, zu einer erhöhten Pflanzenresistenz beitragen können90. Man kann spekulieren, dass P482 durch den Abbau von Phenylalanin, die Reduzierung der Tryptophansynthese und den Ausgleich des Methioninspiegels versuchen könnte, dem entgegenzuwirken und es zu beeinflussen, was es als Immunantwort der Pflanze „interpretiert“.

Maisexsudate verursachten die Hochregulierung von drei Membrane Fusion Protein (MFP)-Untereinheiten von RND-Exporteuren: mexE, BV82_1337 und BV82_1618. Besonders hochreguliert war die Expression von mexE (4,12 log2FC). RND steht für Resistance-Nodulation-Division-Superfamilie von Effluxpumpen. Effluxpumpen der RND-Superfamilie und der Omp-Proteine ​​bilden Proteinkomplexe, die es gramnegativen Bakterien ermöglichen, schädliche Medikamente direkt aus der Zelle heraus zu exportieren und nicht, wie bei anderen Effluxsystemen, in den periplasmatischen Raum. Dies macht RND-Effluxpumpen zu wichtigen Determinanten der Multiresistenz91. In P. aeruginosa verleihen mehrere Efflux-Operons dem Bakterium intrinsische Resistenz gegen Antibiotika, wobei das mexE-haltige Operon mexEF-oprN Resistenz gegen Chinolone, Chloramphenicol und Trimethoprim verleiht92. Es ist jedoch wahrscheinlich, dass die Resistenz gegen synthetische Antibiotika nur eine Nebenwirkung der Resistenz gegen natürliche Sekundärmetaboliten ist. Es wurde gezeigt, dass die Expression von smeDEF durch pflanzenproduzierte Flavonoide ausgelöst wird und dass die Inaktivierung der Pumpe durch die Deletion von smeE die Fähigkeit von Stenotrophomona maltophilia beeinträchtigt, die Wurzeln der Rapspflanze zu besiedeln93. Es ist daher plausibel, dass die Überexpression von mexE in P482 als Reaktion auf die Exsudate von Mais dazu beiträgt, dem Vorhandensein bestimmter sekundärer Metaboliten entgegenzuwirken, die für diesen Pflanzenwirt spezifisch sind. Im Einklang mit dem wirtsspezifischen Effekt wurde festgestellt, dass nur bestimmte und nicht alle RND-Transporter in Gegenwart von Mais induziert wurden. Die Hochregulierung von czcA und mdtA, die auch RND-Effluxpumpen kodieren, wurde durch Tomaten vorangetrieben (Tabelle 1). Es ist bekannt, dass Mais und andere Gräser (Poaceae) biozide Benzoxazinoide produzieren und absondern, Verbindungen, die eine nachgewiesene Rolle bei der Gestaltung des Pflanzenmikrobioms spielen27,94. Es erscheint lohnenswert zu untersuchen, ob RND-Transporter eine Rolle bei der Toleranz einiger Bakterien gegenüber Benzoxazinoiden spielen.

Beide Exsudate erhöhten die Expression von copA und copZ in P482. Allerdings war die Induktion dieser Gene als Reaktion auf Mais viel höher (Tabelle 1). CopA ist eine Transmembran-ATPase, die für den Ausfluss von Cu+-Ionen verantwortlich ist, die vom zytoplasmatischen Chaperon CopZ geliefert werden. Beide Proteine ​​sind Elemente gut charakterisierter Cu+-Toleranzsysteme95. Kupfer ist ein essentielles Spurenelement für alle Organismen; Im Übermaß ist es jedoch giftig96. Kupfer in Form von CuSO4 ist ein Bestandteil des Pflanzenwachstumsmediums von Hoagland, das in dieser Studie zur Kultivierung von Tomaten und Mais verwendet wird. Daher muss die Tatsache, dass die Kupfertoleranzreaktion in Maisexsudaten viel robuster ist als in Tomaten, durch wirtsabhängige Faktoren verursacht werden, die entweder die Verfügbarkeit oder die Toxizität von Kupfer beeinflussen. Mavrodi und Mitarbeiter31 zeigten bei 5 von 8 untersuchten Pseudomonaden, die mit den Exsudaten von B. distachyon behandelt wurden, eine erhebliche Hochregulierung eines oder mehrerer Cop-Gene im Zusammenhang mit der Kupfertoleranz. Sowohl Mais als auch B. distachyon sind einkeimblättrige Gräser und beide wurden für die jeweiligen Experimente in Hoagland's kultiviert.

In P482 führten Maisexsudate zu einer Hochregulierung von BV82_2809, das für FimV kodiert, einem Protein, das am Aufbau von Typ-IV-Pili beteiligt ist. Die Pili vom Typ IV sind an der Adhärenz, bestimmten Bewegungsarten (soziales Gleiten bei Myxococcus xanthus und Zuckungen bei Pseudomonas- und Neisseria-Arten) und der Biofilmbildung, der gesteuerten Gewebeinvasion und anderen pathogenetischen Ereignissen beteiligt97. Pili vom Typ IV sind für die endophytische Reisbesiedelung durch den N2-fixierenden Endophyten Azoarcus sp. essentiell. Stamm BH7298. Interessanterweise wurde pilK, das an der Zuckungsmotilität beteiligt ist, in P. aeruginosa als Reaktion auf die Exsudate von Rote Bete herunterreguliert25, was darauf hindeutet, dass Rote-Bete-Exsudate einen dämpfenden Effekt auf die Pili-Bildung in P. aeruginosa haben, im Gegensatz zur stimulierenden Wirkung von Maisverbindungen in P. donghuensis.

Maisexsudate führten zu einer hochregulierten Expression von fliS in P482, was auf eine erhöhte Synthese schwimmbezogener Flagellen schließen lässt. Flagellen sind für einige Pseudomonas-Stämme unerlässlich, um ihre Wirte effizient zu besiedeln. P. fluorescens F113 mit einem gestörten fliS-Gen war nicht beweglich und konnte nicht mit dem Wildtypstamm (WT) um die Besiedlung der Wurzelspitze von Luzerne konkurrieren99.

Anders als in mit Mais behandelten Zellen wurde bei P482, das mit Tomatenexsudaten behandelt wurde, keine Hochregulierung von Genen beobachtet, die mit der Synthese von Pili und Flagellen zusammenhängen. Im Gegenteil, Tomatenexsudate erhöhten die Expression eines vermutlich negativen Regulators des Flagellen-Masteroperons flhDC im Locus BV82_3459. Es zeigte sich, dass Flagellen den Zellen zwar einen Vorteil verschaffen können, ihre Synthese aber auch einige Nachteile mit sich bringen kann. Die Erkennung spezifischer Flagellenantigene kann als Teil der Immunantwort des Wirts eine Überempfindlichkeitsreaktion und den Zelltod auslösen100. Eine Verringerung der Flagellensynthese wird als Hauptmechanismus zur Umgehung der pflanzlichen Immunität angesehen101. Studien an P. putida KT2440 zu den metabolischen Kompromissen bei der Produktion von Flagellen zeigten, dass ein nicht begeißelter Mutantenstamm eine kürzere Verzögerungsphase aufweist und resistenter gegen oxidativen Stress ist als der WT-Stamm. Es wurde vermutet, dass das Fehlen des Stoffwechselaufwands für die Produktion von Flagellen den Zellen einen Energieüberschuss (ATP) liefern und die Energie (NADPH) verringern könnte, die die Zellen für andere Aktivitäten, einschließlich Stressresistenz, bereitstellen können102. Es scheint daher, dass die Vorteile einer geringeren Expression von Flagellengenen die potenziellen Fitnessnachteile bei P482, das mit Tomatenexsudaten behandelt wurde, überwiegen. Tomatenexsudate regulierten auch zwei Gene herunter, die für Methyl-akzeptierende Chemotaxis-Signaldomänenproteine ​​(MCPs) kodieren, die als vorherrschende Chemorezeptoren in Bakterien und Archaeen fungieren103.

Insgesamt steigerten Maisexsudate die Expression motilitätsbezogener Funktionen in P482, während bei Tomatenexsudaten das Gegenteil beobachtet wurde. Es muss noch geklärt werden, ob diese Unterschiede mit der unterschiedlichen Bedeutung der Motilität bei der Besiedlung dieser beiden Wirte zusammenhängen oder ob es vielmehr der physiologische Zustand der in unserer Studie auf Exsudate untersuchten Tomate war, der die Expression dieser Gene ungünstig machte.

Das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Mikroben ist eine wichtige Voraussetzung für die Nutzung des Potenzials von Mikroben zur Unterstützung der Pflanzengesundheit. Die Untersuchung dieser Wechselwirkungen in der gesamten Komplexität natürlicher Systeme bleibt technisch eine Herausforderung. Daher tragen vereinfachte Setups, die ausgewählte Interaktionen isolieren, weiterhin dazu bei, wertvolle Erkenntnisse zu gewinnen31,104. Hier haben wir identifiziert, welche Aspekte des Stoffwechsels von P. donghuensis P482 durch Wurzelexsudate zweier verschiedener Pflanzenwirte unterschiedlich beeinflusst werden: Tomate und Mais (Abb. 4). Die Zusammensetzung der getesteten Exsudate und damit ihr Einfluss auf P482 sind höchstwahrscheinlich das Ergebnis sowohl des Genotyps der untersuchten Pflanzen als auch ihres physiologischen Status. Wir kommen zu dem Schluss, dass der Katabolismus verzweigtkettiger Aminosäuren, der auf Glyoxylat-Shunt umschaltet, die Resistenz gegen Stickoxid, die flexible Nutzung der Atmungskette, die Methioninsynthese und die selektive Aktivierung von Effluxpumpen vom RND-Typ im Hinblick auf ihre Rolle bei der Promiskuität der Wurzel besondere Aufmerksamkeit verdienen Kolonisierende Pseudomonaden passen sich an verschiedene Pflanzenwirte an und wie sie mit einer Veränderung des physiologischen Status des Wirts in Verbindung bleiben.

Gemeinsame und wirtsspezifische transkriptomische Reaktionen von P. donghuensis P482 auf die Exsudate von Tomaten und Mais. Rote Pfeile, die nach oben zeigen, zeigen die Hochregulierung eines Signalwegs an, während blaue Pfeile, die nach unten zeigen, eine Herunterregulierung anzeigen.

Beim Aufbau des Mikrobioms wird der Anziehungskraft zwischen den Mikroben und der Pflanze große Aufmerksamkeit gewidmet. Im Gegensatz zu diesem Trend hängen die meisten wirtsspezifischen Wege, die wir in P482 beschrieben haben, mit Stressresistenz zusammen. Trotzdem stimulierten die Exsudate das Wachstum von P482, hemmten es jedoch nicht. Eine höhere Widerstandsfähigkeit einiger Mikroben gegenüber bestimmten Stressfaktoren kann zu Verschiebungen in pflanzenassoziierten Mikrobenpopulationen führen, insbesondere bei Pflanzen mit aktivierten Stressreaktionen. Parallel zum menschlichen Sozialverhalten kann es ein unterschätzter Faktor sein, sich nicht an den Ausbrüchen des Partners zu stören, wenn es darum geht, bei ihm zu bleiben.

Rohe Sequenzierungslesungen für diese Studie sind in der NCBI Sequencing Read Database (PRJNA868728) verfügbar. Differenzielle Genanalysedateien wurden im NCBI Gene Expression Omnibus (GSE211040) hinterlegt.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Prof. Steven E. Lindow (University of California-Berkeley, Berkeley, CA, USA) für seinen wertvollen Beitrag zur Verbesserung des Manuskripts und der hilfreichen Diskussion, Associate Prof. R. Czajkowski (IFB UG & MUG, Danzig, Polen) für hilfreiche Kommentare zur fast endgültigen Version und Tomasz Krzyżanowski (IT-Spezialist, Warschau, Polen) für das Schreiben eines Skripts zum Extrahieren von Daten aus GenBank-Dateien. Wir freuen uns auch sehr über die Beiträge der anonymen Gutachter.

Diese Forschung wurde vom Nationalen Wissenschaftszentrum (Polen) finanziert, Projekt Nr. 2017/25/B/NZ9/00513 an S. Jafra.

Labor für Pflanzenmikrobiologie, Intercollegiate Faculty of Biotechnology UG und MUG, Universität Danzig, ul. A. Abrahama 58, 80-307, Danzig, Polen

Dorota M. Krzyżanowska, Magdalena Jablonska und Sylwia Jafra

Labor für Strukturbiochemie, Fakultät für Chemie, Universität Danzig, ul. Wita Stwosza 63, 80-308, Danzig, Polen

Zbigniew Kaczynski & Małgorzata Czerwicka-Pach

Labor für Massenspektrometrie, Intercollegiate Faculty of Biotechnology UG und MUG, Universität Danzig, ul. A. Abrahama 58, 80-307, Danzig, Polen

Catherine Macur

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DMK koordinierte die experimentellen Arbeiten, beteiligte sich an der Sammlung von Exsudaten und Pflanzenkulturen, bereitete die Exsudate für Analysen auf, führte Bakterienkulturen, RNA-Isolierung, RT-qPCR, Wurzelbesiedlungsexperiment, funktionelle Anreicherung und Netzwerkanalysen der RNAseq-Daten durch, erstellte alle Abbildungen und Tabellen und verfasste das Manuskript. MJ züchtete Pflanzen unter gnotobiotischen Bedingungen und half beim Sammeln von Exsudaten. ZK führte NMR-Messungen durch. MCP führte GC-MS durch. KM führte die Analyse des Aminosäuregehalts mittels LC-SRM durch. SJ konzipierte die Studie, akquirierte Fördermittel, überwachte und koordinierte das Projekt und überarbeitete das Manuskript. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondentin ist Sylwia Jafra.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Krzyżanowska, DM, Jabłońska, M., Kaczyński, Z. et al. Wirtsadaptive Merkmale des pflanzenbesiedelnden Pseudomonas donghuensis P482, nachgewiesen durch transkriptomische Reaktionen auf Exsudate von Tomaten und Mais. Sci Rep 13, 9445 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36494-6

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Eingegangen: 24. Januar 2023

Angenommen: 05. Juni 2023

Veröffentlicht: 09. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36494-6

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