Enzym

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 312 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Pyridoxal-5′-phosphat (PLP) ist ein vielseitiger Cofaktor, der verschiedene Arten enzymatischer Reaktionen unterstützt. Es wurde auch berichtet, dass PLP mit Substraten reagiert und einige dieser Reaktionen unabhängig von Enzymen katalysiert. Eine solche katalytische Reaktion ist der Abbau von Cystein unter Bildung von Schwefelwasserstoff (H2S) in Gegenwart mehrwertiger Metallionen. Die enzymunabhängige katalytische Aktivität von PLP beim Abbau von Cystein in Abwesenheit multivalenter Ionen ist jedoch unbekannt. In dieser Studie zeigen wir, dass PLP mit Cystein unter Bildung eines Thiazolidinprodukts reagiert, was durch quantenchemische Berechnungen des Absorptionsspektrums gestützt wird. Die Reaktion von PLP mit Cystein hängt von der Ionenstärke und dem pH-Wert ab. Das Thiazolidinprodukt zersetzt sich langsam unter Bildung von H2S und das PLP regeneriert sich nach längeren Reaktionszeiten (> 24 Stunden) in seine aktive Form, was darauf hindeutet, dass PLP als Katalysator wirken kann. Wir schlagen einen enzymunabhängigen, plausiblen Reaktionsmechanismus für den PLP-katalysierten Cysteinabbau zur Bildung von H2S vor, der über die Bildung von Thiazolidinring-Zwischenprodukten abläuft, die später langsam hydrolysieren, um das PLP zu regenerieren. Diese Arbeit zeigt, dass PLP den Cysteinabbau in Abwesenheit von Enzymen, Basen und mehrwertigen Metallionen katalysiert, um H2S zu produzieren.

1942 von Snell et al. entdeckt. Pyridoxal-5′-phosphat (PLP) ist die stoffwechselaktive Form von Vitamin B6. Es ist einer der vielseitigsten Cofaktoren für Enzyme, die eine Vielzahl von Reaktionen mit Aminosäuren katalysieren1. PLP wird als Cofaktor bei fast 4 % aller Enzymaktivitäten verwendet2. PLP-abhängige Enzyme katalysieren Transaminierungen, Racemisierungen, Decarboxylierungen, α-, β- und γ-Substitutionen und Eliminierungen, Transaldolationen, Claisen-Kondensationen und neuerdings auch oxidative Desaminierungen in Gegenwart von Aminosäuren3. Interessanterweise ist PLP auch in der Lage, einige dieser Reaktionen enzymunabhängig zu katalysieren. Transaminierungen, α-, β-Substitutionen und Decarboxylierungen mit Aminosäuren werden durch PLP und mehrwertige Metallionen nichtenzymatisch in wässrigen Lösungen katalysiert4,5,6,7,8,9,10,11, es wurde jedoch auch berichtet, dass sie ablaufen langsam ohne Metallionen12. Beispielsweise unterliegt PLP in Abwesenheit von Enzymen einer langsamen Transaminierung, wenn es mit Aminosäuren erhitzt wird, um Pyridoxamin4 zu erzeugen. Diese Studien kamen zu dem Schluss, dass die Aldehydgruppe von PLP als aktives Zentrum fungiert und leicht und reversibel mit Aminosäuren unter Bildung von Schiff-Basen reagiert, die abhängig von anderen Reaktionsbedingungen weiter zu Produkten reagieren. Da PLP diese Produkte unabhängig vom Enzym erzeugt, ist es wichtig, die direkte Wechselwirkung von PLP mit essentiellen Aminosäuren zu verstehen.

Die enzymunabhängige katalytische Rolle von PLP bei der Reaktion mit Cystein in Abwesenheit multivalenter Metallionen wurde noch nicht untersucht. Dies liegt daran, dass bei der Reaktion von PLP mit Cystein weithin berichtet wurde, dass durch Kondensation ein stabiles Produkt, ein Thiazolidinring, entsteht13,14,15,16,17. Frühe Studien kamen zu dem Schluss, dass die Bildung des Thiazolidinrings in drei Schritten abläuft: erstens die Addition einer Amingruppe von Cystein an die Aldehydgruppe des PLP, zweitens die Entfernung von Wasser unter Bildung einer aldiminischen Schiff-Base und drittens der Ringschluss (Abb. 1A). . Es wurde berichtet, dass der Thiazolidinring länger als 24 Stunden stabil sei, es wurden jedoch keine längeren Studien gemeldet15. Alternativ kann die Thiolgruppe von Cystein auch mit der Aldehydgruppe des PLP reagieren, um ein Hemimercaptal- oder Mercaptal-Zwischenprodukt zu bilden17. Wenn Cysteinderivate wie S-(p-substituierte Phenyl)-Cysteine ​​mit PLP unter leicht alkalischen Bedingungen umgesetzt werden, unterliegen sie interessanterweise einer α-, β-Eliminierung, wodurch Ammoniak, Pyruvat und S-(p-substituierte Phenyl)-Analoga entstehen PLP wird regeneriert (Abb. 1B). Dies bestätigte die katalytische Rolle von PLP beim Abbau von S-substituiertem Cystein unter leicht alkalischen Bedingungen18,19.

Vorgeschlagener Reaktionsmechanismus der enzymunabhängigen chemischen Wechselwirkung von PLP mit Cystein. (A) Mechanismus der Bildung des Thiazolidinrings mit PLP und Cystein in Abwesenheit einer Base und von Metallionen. Die Bildung der Schiffschen Base ist ein Zwischenschritt. (B) Mechanismus für das katalytische Verhalten von PLP bei Reaktion mit S-substituierten Cysteinen unter leicht alkalischen Bedingungen. PLP wird regeneriert und produziert S-substituierte Analoga, Ammoniak und Pyruvat.

Kürzlich haben Hine et al. untersuchten die nicht-enzymatische Rolle von PLP beim Cysteinabbau zur Bildung von Schwefelwasserstoff (H2S) in Gegenwart dreiwertiger Metallionen9. Endogenes H2S wird überwiegend aus Cystein und Homocystein durch Enzyme wie Cystathionin-β-Synthase (CBS), Cystathionin-γ-Lyase (CGL) und 3-Mercaptopyruvat-Schwefeltransferase (3-MST) mit PLP als Cofaktor produziert20. H2S ist ein essentieller Nährstoff für den Körper und Mängel bei der endogenen enzymatischen H2S-Produktion oder der Aktivität von CBS, CGL und 3-MST sind mit mehreren schädlichen Auswirkungen auf die Gesundheit verbunden, einschließlich neurodegenerativer Erkrankungen21,22. Daher steht die Untersuchung der enzymunabhängigen katalytischen Rolle von PLP beim Cysteinabbau unmittelbar bevor, um seine Fähigkeit zur Behebung potenzieller Enzymmängel zu beurteilen, die für das Fortschreiten neurodegenerativer Erkrankungen verantwortlich sind.

In der aktuellen Literatur zur enzymunabhängigen katalytischen Rolle von PLP bei der Metabolisierung von Cystein fehlen Untersuchungen dieser Wechselwirkung unter physiologischen Bedingungen. Die katalytische Rolle von PLP in Gegenwart einer Base oder mehrwertiger Metallionen ist gut belegt. Für ein ganzheitliches Verständnis der PLP-Wechselwirkungen mit Cystein muss jedoch das zeitabhängige katalytische Verhalten von PLP in Abwesenheit beider bestimmt werden. Daher untersuchten wir in dieser Studie die Wechselwirkungen von PLP mit Cystein unter physiologischen Bedingungen. 1H-NMR- und UV-Vis-Spektroskopie wurden verwendet, um den Fortschritt der Reaktion zu überwachen. Zur Überwachung der Entwicklung des H2S-Produktgases wurde eine Papierchromatographie durchgeführt. An den wahrscheinlichen Zwischenprodukten wurden quantenchemische Berechnungen durchgeführt, um deren UV-Vis-Absorption vorherzusagen, und mit experimentellen Daten verglichen.

In der Literatur werden verschiedene Zwischenprodukte der PLP-Reaktion mit Cystein vermutet13,14,15,16,17, darunter die Bildung einer Schiff-Base, eines Hemimercaptals und einer Thiazolidinstruktur mit geschlossenem Ring (Abb. 2A). Diese verschiedenen potenziellen PLP-Cys-Produkte wurden mittels 1H-NMR- und UV-Vis-Spektroskopie untersucht.

1H-NMR-gezoomtes Spektrum einer 1:1 molaren Reaktionsmischung aus PLP und (A) Cystein, (B) S-Methylcystein (SMC) und (C) N-Acetylcystein (NAC) in D2O, die 2 Stunden lang bei 37 °C reagierte . Bei der Reaktion von PLP und SMC entsteht eine Schiff-Base. Das aldiminische Proton einer Schiffschen Base wird bei δ ≈ 8 ppm beobachtet. Hemimercaptal entsteht durch die Reaktion von PLP und NAC. Das enolische Proton des Hemimercaptals wird bei δ ≈ 6,5 ppm beobachtet. Bei der Reaktion von PLP und Cystein wird das Vorhandensein einer Schiffschen Base, eines Hemimercaptals und eines Thiazolidinrings (δ = 6,05, 6,10 ppm) beobachtet.

Im Fall der 1H-NMR-Spektroskopie wurden PLP und Cystein in deuteriertem Wasser (D2O) bei 37 °C im molaren Verhältnis 1:1 2 Stunden lang umgesetzt. Die vergrößerte Version des 1H-NMR-Spektrums ist in Abb. 2A dargestellt (vollständiges Spektrum in Abb. S1). PLP zeigt über pH 5 eine Keto-Enol-Tautomerie durch seine Aldehydeinheit, deren α-Wasserstoff (4) bei δ = 10,4 ppm und die der Enolform von PLP (4′) bei δ = 6,45 ppm beobachtet wird (Abb. S2). )23. PLP zeigt bei der Reaktion mit Cystein zwei neue Peaks, die bei δ = 6,05 ppm und 6,10 ppm erscheinen und dem Methinproton (z) der racemischen Mischung des mit PLP und Cystein gebildeten Thiazolidinrings entsprechen24. Ein dritter neuer Peak (x) wurde bei δ = 8,09 ppm beobachtet, der möglicherweise dem aldiminischen Proton der zwischen PLP und Cystein gebildeten Schiff-Base entspricht. Bei der Reaktion von PLP und Cystein in einem Molverhältnis von 1:10 wurden keine den Zwischenprodukten entsprechenden Peaks beobachtet, stattdessen wurden Peaks für den Thiazolidinring beobachtet (Abb. S3). Um die Position des Aldimin-Protons und damit die Bildung der Schiff-Base zu bestätigen, wurden PLP und S-Methylcystein (SMC), ein Cystein-Analogon, das kein freies Thiol zum Ringschluss aufweist, auf ähnliche Weise umgesetzt. Diese Reaktion erzeugte einen neuen Peak (x) bei δ = 8,05 ppm, der dem aldiminischen Proton der zwischen SMC und PLP gebildeten Schiff-Base entspricht (Abb. 2B, vollständiges Spektrum in Abb. S4). SMC und PLP bilden innerhalb von 2 Stunden Reaktionszeit eine Schiff-Base, was durch die Verschiebung des Absorptionsmaximums im UV-Vis-Spektrum der Reaktionsmischung von 388 nm, Übergänge, die typischerweise der Aldehydgruppe zugeschrieben werden, auf 401 nm beobachtet wird (Abb. S5). ). Daher wird der Peak, der bei δ ≈ 8 ppm für die PLP-Cystein-Reaktion auftritt, auf das Vorhandensein der Schiff-Basenstruktur zurückgeführt. Alternativ kann das Cystein auch mit PLP unter Bildung eines Hemimercaptals reagieren (Abb. 2A)17, was durch die Wechselwirkung des freien Elektronenpaars am Schwefel mit dem enolischen Proton des PLP möglich ist. In Abb. 2A wurde bei δ = 6,49 ppm ein kleiner Schulterpeak (y) beobachtet, der auf die Möglichkeit der Bildung eines Hemimercaptals hinweist. Um die Bildung eines Hemimercaptals zu bestätigen, wurden PLP und N-Acetylcystein (NAC), ein Cystein-Analogon, das über freies Thiol zur Hemimercaptal-Bildung, aber kein freies Amin zur Bildung der Schiff-Base verfügt, zur Reaktion gebracht und ein neuer Peak (y) bei δ beobachtet = 6,47 ppm, was dem enolischen Proton des zwischen NAC und PLP gebildeten Hemimercaptals entspricht (Abb. 2C, vollständiges Spektrum in Abb. S6). Nach 2-stündiger Reaktion von NAC und PLP wurde keine Änderung der Intensität des PLP-Peaks bei 388 nm im UV-Vis-Spektrum beobachtet (Abb. S7). Um sicherzustellen, dass das sekundäre Amin aus NAC keine Schiff-Base bildet, die den neuen Peak bei δ = 6,47 ppm erzeugt, wurden PLP und N-Acetylmethionin (NAM), ein Cystein-Analogon ohne freies Amin oder Thiol, umgesetzt und es wurden danach keine neuen Peaks beobachtet 2 h Reaktion, die die Position des Hemimercaptal-Protons bei δ ≈ 6,47 ppm bestätigt (Abb. S8). Basierend auf diesen Beobachtungen können wir vorschlagen, dass die Reaktion von Cystein und PLP in Wasser zur Bildung aller drei Produkte führt: Thiazolidin-Ringstruktur, Schiff-Base und Hemimercaptal.

Die Wechselwirkung von PLP mit Cystein unter physiologischen Bedingungen von Ionenstärke und Temperatur wurde mittels Absorptionsspektroskopie bestimmt. PLP und Cystein wurden 2 Stunden lang in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei 37 °C umgesetzt. Um die potenziellen Reaktionsprodukte aus Experimenten zu bestimmen, wurde das UV-Vis-Spektrum für potenzielle Produkte rechnerisch (xyz-Koordinaten für Strukturen in Abb. S9) mit hybrider Dichtefunktionaltheorie berechnet.

Das berechnete PLP-Absorptionsspektrum (Abb. 3A) zeichnet sich durch eine starke optische Reaktion im UV-Bereich mit dominanten Peaks bei 228 nm und 392 nm aus. Weniger intensive Peaks treten bei 205 nm und 250 nm auf. Der HOMO-LUMO-Übergang für PLP wird mit 2,33 eV oder 532 nm berechnet, was einer Übertragung der Elektronendichte von der Phosphatgruppe auf die aromatische Gruppe entspricht (Abb. S10A). Am interessierenden Höhepunkt (392 nm) zeigen die natürlichen Übergangsorbitale die Neuverteilung der Elektronendichtezustände in der aromatischen Gruppe (Abb. 3A). Das experimentelle Spektrum für PLP-Lösung in PBS weist zwei dominante Peaks bei 225 nm und 388 nm auf, was gut mit dem berechneten Spektrum übereinstimmt (Abb. 3A). Das experimentelle Spektrum weist außerdem einen Schulterpeak bei 328 nm auf, der im berechneten Spektrum fehlt. Dieser zusätzliche Peak könnte auf zusätzliche zwitterionische Gleichgewichtszustände von PLP25,26,27 zurückgeführt werden. Neben dem Schulterpeak wird das experimentelle Spektrum in Berechnungen gut reproduziert. Da PLP über seinen Aldehydanteil oberhalb von pH 5 eine Keto-Enol-Tautomerie zeigen kann, wurde auch das UV-Vis-Spektrum für die Enolform von PLP berechnet (Abb. S11). Das berechnete Spektrum weist dominante Peaks bei 451 nm, 290 nm und 223 nm auf. Die berechneten Peaks stimmen nicht mit experimentellen Daten überein und legen daher nahe, dass PLP unter physiologischen Bedingungen von Ionenstärke und Temperatur nur als Aldehydform vorliegt.

Vergleich experimenteller (durchgezogene Linien) und berechneter (gestrichelte blaue Linien) Absorptionsspektren für (A) PLP, (B) PLP-Cystein-Schiffsche Base und (C) PLP-Cystein-Thiazolidin-Ringstrukturen. Die linke Seite jedes Panels zeigt die Molekülstruktur und die rechte Seite jedes Panels zeigt die natürlichen Übergangsorbitale am interessierenden Peak. Das experimentelle Spektrum von PLP stimmt gut mit dem berechneten Spektrum überein. Das experimentelle Spektrum der PLP-Cystein-Reaktion nach 2 Stunden in PBS stimmt mit der Bildung der Thiazolidinstruktur und nicht mit der Schiff-Base überein.

Das berechnete Absorptionsspektrum für die PLP-Cys-Schiff-Base (Abb. 3B) zeigt dominante Peaks bei 441 nm und 387 nm, die zusammen einen Gaußschen Peak bei 428 nm ergeben. Mehrere weniger intensive Peaks im Bereich von 201–262 nm verstärken den breiten Gaußschen Peak bei 203 nm. Der HOMO-LUMO-Übergang für die Schiff-Basenstruktur von PLP-Cys wird mit 1,46 eV oder 849 nm berechnet, was einer Übertragung der Elektronendichte von der Phosphatgruppe auf die aromatische Gruppe und das mit der Schiff-Base verbundene Cystein entspricht (Abb. S10B). Am interessierenden Peak (441 nm) zeigen die natürlichen Übergangsorbitale eine Umverteilung der Elektronendichtezustände in der aromatischen Gruppe sowie einen Transfer von der Carbonsäuregruppe zur Aldiminstruktur (Abb. 3B). In ähnlicher Weise weist das berechnete Absorptionsspektrum für die PLP-Cys-Thiazolidinstruktur (Abb. 3C) dominante Peaks bei 333 nm und 212 nm auf. Mehrere weniger intensive Peaks im Bereich von 204–220 nm verstärken den breiten Gaußschen Peak bei 210 nm. Der HOMO-LUMO-Übergang für die PLP-Cys-Thiazolidinstruktur wird mit 2,49 eV oder 497 nm berechnet, was einer Übertragung der Elektronendichte von der Phosphatgruppe auf die aromatischen und Thiophengruppen entspricht (Abb. S10C). Am interessierenden Peak (333 nm) zeigen die natürlichen Übergangsorbitale eine Umverteilung der Elektronendichtezustände in der aromatischen Gruppe sowie einen Transfer zur Thiophengruppe (Abb. 3C).

Das experimentelle Spektrum für die PLP-Cysteinmischung in PBS zeigt einen breiten Peak bei 203 nm mit einem Schulterpeak bei 220 nm und einen zweiten dominanten Peak bei 333 nm mit einem Schulterpeak bei 294 nm. Das Vorhandensein eines Peaks bei 333 nm und das Fehlen jeglicher Absorption über 400 nm legen nahe, dass entweder PLP und Cystein keine Schiff-Base bilden oder die Schiff-Base instabil ist und schnell zyklisiert, um den Ring zu bilden17. Interessanterweise stimmen die experimentellen Daten mit dem berechneten PLP-Cys-Thiazolidin-Absorptionsspektrum überein. Der Schulterpeak bei 294 nm wurde nicht vorhergesagt und könnte auf verschobene zwitterionische Gleichgewichtszustände von PLP zurückgeführt werden.

Die Ergebnisse der 1H-NMR- und UV-Vis-Spektroskopie sowie berechnete Absorptionsspektren bestätigen das Vorhandensein des Thiazolidinrings bei der PLP-Cys-Reaktion. Ebenso wird die Bildung von Hemimercaptal durch 1H-NMR-Spektroskopie unterstützt. Es ist jedoch interessant festzustellen, dass die Aldiminstruktur der Schiff-Base bei der NMR-Spektroskopie beobachtet wird, wenn das Lösungsmittel D2O war, nicht jedoch bei der UV-Vis-Spektroskopie, bei der das Lösungsmittel PBS war. Dies könnte auf Unterschiede in der Konzentration der Reaktanten, der Ionenstärke des Lösungsmittels oder dem pH-Wert zurückzuführen sein, unter dem die Schiff-Base instabil ist und schnell zyklisiert, um den Thiazolidinring zu bilden17. Es wurden unterschiedliche PLP-Konzentrationen verwendet, da eine PLP-Konzentration unter 10 mM im 1H-NMR-Spektrum nicht nachweisbar ist und eine Konzentration über 0,1 mM das UV-Vis-Signal bei 388 nm, dem interessierenden Peak, sättigt. Um die Bildung verschiedener Zwischenprodukte zwischen PLP und Cystein zu verifizieren, wurden Reaktionsmischungen von PLP und Cystein in entionisiertem Wasser und PBS mit LC/MS analysiert. Es wurde eine sehr geringe Häufigkeit von Zwischenionen mit Massen beobachtet, die mit der PLP-Cys-Schiff-Base, dem Thiazolidinring und dem Hemimercaptal übereinstimmen (Abb. S12). Das Signal für die PLP-Cys-Schiff-Base war nicht signifikant höher als bei der Kontrolle. Obwohl das Vorhandensein dieser Zwischenprodukte mit der NMR- und UV-Vis-Spektroskopie übereinstimmt, ist zu beachten, dass die detektierten LC/MS-Signale nicht stark genug waren, um die Bildung dieser Zwischenprodukte zu bestätigen. Die Zwischenprodukte sind während der MS-Analyse in der Säule oder Gasphase möglicherweise nicht stabil, insbesondere da die mobile Phase sauer war: 0,1 % Ameisensäure (95 % in Wasser und 5 % in Acetonitril).

Die zeitabhängige Wechselwirkung von PLP mit Cystein wurde mittels UV-Vis-Spektroskopie untersucht. PLP und Cystein wurden 14 Tage lang in PBS bei 37 °C im Molverhältnis 1:10 umgesetzt. Ihr Absorptionsspektrum wurde zur Überwachung der Reaktion aufgenommen (Abb. 4A). Das Absorptionsspektrum für PLP bei pH = 7,2 zeigt ein Maximum bei 388 nm, wie oben diskutiert28. Nach der Zugabe von Cystein nimmt die Absorption bei 388 nm sofort ab, was auf die Bildung von Hemimercaptal- und Thiazolidinstrukturen schließen lässt17. Dieser Peak verschwindet innerhalb von 2 Stunden vollständig, was darauf hindeutet, dass die Aldehydgruppe von PLP vollständig mit dem Cystein reagiert und einen Thiazolidinring gebildet hat, wobei ein Peakanstieg bei 333 nm beobachtet wurde. Das UV-Vis-Spektrum zeigt den gleichen Trend bis 24 Stunden Reaktionszeit mit stärkerer Absorption für den Thiazolidinring, was mit der Literatur übereinstimmt15. Bei 24 ha erscheint jedoch ein kleiner Peak bei 388 nm, der der Aldehydgruppe von PLP entspricht. Die Intensität des Peaks bei 388 nm nimmt mit der Zeit (7 und 14 Tage) zu, wobei gleichzeitig der Thiazolidin-Peak bei 333 nm abnimmt. Diese Umkehrung deutet darauf hin, dass der Thiazolidinring wieder in seine PLP-Form umgewandelt wird. S-(p-substituierte Phenyl)-Analoga wurden als Nebenprodukt beobachtet, wenn S-(p-substituierte Phenyl)-Cysteine ​​mit PLP unter leicht alkalischen Bedingungen umgesetzt wurden, wodurch das PLP18 regeneriert wurde. Daher schlagen wir vor, dass PLP als schwacher Katalysator für die Katabolisierung von Cystein in Abwesenheit von Metallionen unter Bildung von Schwefelwasserstoff (H2S) fungiert.

(A) UV-Vis-Spektrum der chemischen Wechselwirkung zwischen PLP und Cystein unter physiologischen Bedingungen, überwacht bei 0 h, 2 h, 24 h und 14 Tagen. (B) H2S-Produktion aus der Reaktion von PLP und Cystein in entionisiertem Wasser, einzelnen Komponenten von PBS und PBS bei 37 °C und 24 Stunden. Die H2S-Produktion ist in PBS neunmal höher als in DI-Wasser.

Um die Fähigkeit von PLP zu überprüfen, den Cysteinabbau zur Produktion von H2S zu katalysieren, führten wir eine Papierchromatographie (Bleiacetat-Assay) durch, um die Produktion von H2S-Gas als eines der Nebenprodukte nachzuweisen. Es ist zu beachten, dass weniger als 20 % des produzierten H2S bei einem physiologischen pH-Wert von 29,30 in der Gasphase vorliegen. Die Reaktion von PLP und Cystein unter physiologischen Bedingungen in PBS erzeugte in 24 Stunden fast 70 µM H2S (Abb. 4B). In Abwesenheit von PLP wurde keine H2S-Produktion beobachtet (Abb. S13A). Interessanterweise betrug die H2S-Entwicklung 8,8 µM, wenn die Reaktion in entionisiertem (DI) Wasser durchgeführt wurde (Abb. 4B). PBS hat einen pH-Wert von 7,4 und besteht aus 137 mM Natriumchlorid (NaCl), 2,7 mM Kaliumchlorid (KCl), 8 mM Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) und 2 mM Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4). Die Reaktion von PLP und Cystein in Gegenwart jedes einzelnen Salzes erzeugte in 24 Stunden nahezu 7,6 µM H2S mit 137 mM NaCl, 58,9 µM H2S mit 8 mM Na2HPO4 und 11,1 µM H2S mit 2 mM KH2PO4. Diese Ergebnisse legen nahe, dass das Vorhandensein von Na2HPO4 in PBS einen wesentlichen Beitrag zur H2S-Produktion leistet. Dies kann daran liegen, dass Na2HPO4 in Wasser mäßig basisch ist (pH 8,86) und ein Hydroxidion freisetzt, das Phosphorsäure bildet. Das freigesetzte Hydroxidion kann als Base bei der Extraktion des α-Protons aus der PLP-Cys-Schiff-Base (siehe Abb. 5) fungieren und die Reaktion zur Bildung von H2S vorantreiben. Da der durch PLP katalysierte Cysteinabbau in basischem Medium beschleunigt wird18, ist zu erwarten, dass die H2S-Produktion bei leicht alkalischen Bedingungen zunimmt. Darüber hinaus weisen PLP-Lösungen unter alkalischen Bedingungen eine tiefere gelbe Farbe auf, wie sie bei PLP-Lösungen in PBS im Vergleich zu PLP-Lösungen in entionisiertem Wasser zu sehen sind (Abb. S13B)28.

Vorgeschlagener plausibler Reaktionsmechanismus für den enzymunabhängigen PLP-katalysierten Abbau von Cystein zur Produktion von H2S unter physiologischen Bedingungen in Abwesenheit von Metall.

Nach 14 Tagen Reaktionszeit nimmt der Absorptionspeak der Thiazolidingruppe bei 333 nm ab und der der Aldehydgruppe bei 388 nm steigt proportional an. Dies deutet darauf hin, dass PLP neben der Produktion von H2S unter physiologischen Bedingungen auch in der Lage ist, sich langsam zu regenerieren und als Katalysator zu fungieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass PLP unter physiologischen Bedingungen als Katalysator für den Abbau von Cystein zur Bildung von H2S fungieren kann. Am wichtigsten ist, dass wir zum ersten Mal zeigen, dass PLP den Cysteinabbau in Abwesenheit von (i) Enzymen, (ii) Basen und (iii) Metallionen katalysiert, um H2S zu produzieren.

Basierend auf unseren Ergebnissen und der Literatur schlagen wir einen plausiblen Reaktionsmechanismus für den PLP-katalysierten Cysteinabbau in PBS zur Bildung von H2S vor, wie in Abb. 5 dargestellt. Da die PLP- und Cysteinreaktion innerhalb von 2 Stunden unter Bildung eines Thiazolidinrings abgeschlossen ist, ist der Der H2S-Produktionsweg muss über den Ringöffnungsmechanismus verlaufen. In Abwesenheit von Enzymen, Basen und Metallionen kann sich der Thiazolidinring durch Hydrolyse öffnen (Abb. S14)31. Wie in Abb. 5 dargestellt, kann die Ringhydrolyse über den Angriff von Wasser auf die positiv geladene Stickstoffgruppe von I ablaufen, um das Hydroniumion zu erzeugen, das den Schwefel am Ring von II angreift, wodurch sich der Ring öffnet und wahrscheinlich eine Schiff-Base bildet III. Da die Schiff-Base äußerst instabil ist17, können Wassermoleküle oder schwache Basen das α-Proton vom aktivierten Methin von Cystein aus III abstrahieren und Hydroniumionen und eine Chinonstruktur IV erzeugen. Diese chinoide Struktur kann sich dann durch β-Eliminierung der Thiolgruppe stabilisieren, um V zu bilden und H2S zu erzeugen. Die gebildete Struktur V kann sich dann unter Bildung von Ammoniak und Pyruvat zersetzen, um das PLP VI zu regenerieren. Diese Reaktionszwischenprodukte oder Nebenprodukte wurden mit 1H-NMR- oder UV-Vis-Spektroskopie nicht beobachtet und erfordern weitere Untersuchungen.

Wir haben zum ersten Mal gezeigt, dass PLP den Cysteinabbau in Abwesenheit von (i) Enzymen, (ii) Basen und (iii) Metallionen katalysiert, um unter physiologischen Bedingungen H2S zu produzieren. PLP reagiert vollständig mit Cystein und bildet innerhalb von 2 Stunden nach der Reaktion einen Thiazolidinring. Die Ringbildung wurde mit 1H-NMR- und UV-Vis-Spektroskopie beobachtet. Die rechnerisch erhaltenen UV-Vis-Spektren halfen bei der Bestätigung der Bildung der Thiazolidin-Ringstruktur zwischen PLP und Cystein. Über eine direkte Beobachtung der Schiff-Basen- und Hemimercaptalbildung zwischen Cystein und PLP wurde bisher nicht berichtet. Der Thiazolidinring zersetzt sich langsam und erzeugt innerhalb von 24 Stunden 70 µM H2S. Interessanterweise wurde in entionisiertem Wasser weniger H2S (8,8 µM) produziert, was darauf hindeutet, dass die Ionenstärke und der pH-Wert eine dominierende Rolle spielen. Über 24 Stunden hinaus werden mit der UV-Vis-Spektroskopie Hinweise auf eine Regeneration von PLP beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass PLP neben der Produktion von H2S unter physiologischen Bedingungen auch in der Lage ist, sich langsam zu regenerieren und als Katalysator zu fungieren. Basierend auf den bereitgestellten spektroskopischen und rechnerischen Beweisen wurde ein plausibler Reaktionsmechanismus für die PLP-Katalyse vorgeschlagen. Diese chemische Untersuchung der enzymunabhängigen PLP-Katalyse ist aufgrund ihrer biologischen Relevanz für die Produktion von H2S wichtig, einem essentiellen Nährstoff für den Körper, dessen endogener Mangel mit mehreren gesundheitsschädlichen Auswirkungen verbunden ist.

Pyridoxal-5′-phosphathydrat (PLP), L-Cystein (Cys), Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) und Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) wurden von Alfa Aesar (MA, USA) bezogen. Deuteriumoxid (D2O), N-Acetylcystein (NAC), N-Acetylmethionin (NAM), Natriumchlorid (NaCl) und Blei(II)-acetat-Trihydrat wurden von Sigma-Aldrich (MO, USA) bezogen. S-Methylcystein (SMC) wurde von TCI America (OR, USA) bezogen. Alle Chemikalien wurden ohne weitere Reinigung verwendet.

Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) 20 mM PLP und 20 mM Cys in D2O wurden in einem NMR-Röhrchen gemischt und in einen Inkubator bei 37 °C gestellt. Zur Überwachung der Reaktionsprodukte wurde 1H-NMR-Spektroskopie eingesetzt. Zur Aufnahme der 1H-NMR-Spektren in D2O mit 16 Scans wurde ein 400-MHz-Spektrometer von Bruker (MA, USA) verwendet. Ein ähnliches Experiment wurde unter Verwendung von 20 mM PLP und 20 mM SMC, 20 mM NAC bzw. 20 mM NAM durchgeführt, um ihre Reaktionsprodukte zu überwachen.

UV-Vis-Spektroskopie 0,1 mM PLP und 1 mM Cys in PBS (pH = 7,2), vorgeheizt auf 37 °C, wurden in einer Quarzküvette gemischt. Das Grundzustandsabsorptionsspektrum der Reaktionsprodukte wurde mit einem Perkin Elmer Lambda 1050 UV-Vis-NIR-Spektrophotometer (Waltham, MA) und einem temperaturgesteuerten Küvettenhalter bei 37 °C erhalten.

Papierchromatographie-Assay zur H2S-Messung 1 mM PLP und 10 mM Cys in entionisiertem Wasser wurden in einer 96-Well-Polypropylenplatte in einem Inkubator bei 37 °C 24 Stunden lang reagieren lassen. Ein ähnliches Experiment wurde mit Reaktanten durchgeführt, die in 137 mM NaCl, 8 mM Na2HPO4, 2 mM KHPO4 und PBS hergestellt wurden. Das bei der Reaktion entstehende gasförmige H2S wurde mithilfe eines Bleiacetat-Papiertests quantifiziert. Der Bleiacetat-Papiertest und seine Analyse wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt32.

Computergestützte Studie zu PLP-Cystein-Wechselwirkungen Alle Berechnungen für diese Studie wurden mit dem General Atomic and Molecular Electronic Structure System (GAMESS) 2018-R1-Code33 unter Verwendung der Dichtefunktionaltheorie (DFT) und der hybriden B3LYP-Funktion34,35,36,37 durchgeführt. Für alle Berechnungen wurde ein standardmäßiges polarisierbares Kontinuumsmodell (PCM) mit Wasser als Lösungsmittel verwendet. Die anfänglichen kartesischen Koordinaten der Moleküle wurden mit Avogadro (einem Open-Source-Tool zum Erstellen und Visualisieren von Molekülen) erhalten38 und die Molekülstrukturen im Grundzustand wurden mit einem 6-311G(d, p)-Basissatz optimiert. Zeitabhängige Dichtefunktionaltheorie-Berechnungen (TDDFT) für die geometrieoptimierten Moleküle wurden mit geschlossenschaligen eingeschränkten Hartree-Fock-Wellenfunktionen (RHF) durchgeführt. Die natürlichen Übergangsorbitale sowie Spektren, die die Oszillatorstärke als Funktion der Wellenlänge (Anregungsenergie) und die durch eine Gaußsche Verbreiterung erhaltene Kurve (mit einer Halbwertsbreite von 0,08 eV) darstellen, wurden mit der Software Chemissian erfasst.

Flüssigkeitschromatographie-Massenspektroskopie Die Flüssigkeitschromatographie-Massenspektroskopie (LC-MS) wurde in der Kerneinrichtung für Proteomik und Metabolomik des Lerner Research Institute durchgeführt. Eine ungezielte Metabolomik mittels Umkehrphasenchromatographie wurde durchgeführt, indem 4 µL jeder Probe auf eine Thermo Accucore Vanquish C18-Säule mit den Abmessungen 100 × 2,1 mm und einer Partikelgröße von 1,5 µm (Thermo P/N 27101-102130) bei 60 °C in Verbindung mit einem Thermo injiziert wurden Vanquish UHPLC durch Gradientenelution, wobei die mobile Phase A aus 0,1 % Ameisensäure in Wasser und die mobile Phase B aus 0,1 % Ameisensäure in Acetonitril besteht. Der Orbitrap Q Exactive HF wurde im positiven und negativen Elektrospray-Ionisationsmodus in verschiedenen LC-MS-Läufen über einen Massenbereich von 56–850 Da unter Verwendung gezielter ausgewählter Ionenüberwachung (t-SIM) mit MS1 bei einer Auflösung von 120.000 betrieben.

Die Autoren erklären, dass alle weiteren Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, in der Arbeit und in den Zusatzinformationen verfügbar sind.

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Die Autoren danken der Puzzitelio Family Foundation, der Barney Family Foundation, dem Center for Transformative Nanomedicine und den Startkapitalfonds des Lerner Research Institute für die finanzielle Unterstützung. CC wurde teilweise durch die Unterstützung von Undergraduate Research & Creative Endeavors der Case Western Reserve University unterstützt. Die Autoren danken Dr. Belinda Willard und Rebecca Williams vom Metabolomic Core der Cleveland Clinic für die LC-MS-Analyse von PLP-Cystein-Mischungen. Die Autoren danken außerdem Alan Chen für die Vorbereitung der Proben für die LC-MS-Analyse. Alle hier geäußerten Meinungen, Erkenntnisse, Schlussfolgerungen oder Empfehlungen sind die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten der Förderagenturen wider.

Abteilung für Biomedizintechnik, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, Cleveland, OH, 44195, USA

Prajakatta Mulay, Cindy Chen und Vijay Krishna

Abteilung für Biomedizintechnik, Cleveland Clinic Lerner College of Medicine, Case Western Reserve University, Cleveland, OH, 44106, USA

Vijay Krishna

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PM, CC und VK konzipierten die Idee, gestalteten die Experimente und analysierten die Daten. CC und PM führten die UV-Vis-Spektroskopie und Bleiacetat/Bleisulfid-Experimente durch. PM führte die NMR-Experimente und -Analysen durch. VK führte die quantenchemischen Berechnungen durch. PM, CC und VK haben das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit Vijay Krishna.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Mulay, P., Chen, C. & Krishna, V. Enzymunabhängiger Katabolismus von Cystein mit Pyridoxal-5′-phosphat. Sci Rep 13, 312 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-022-26966-6

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Eingegangen: 05. August 2022

Angenommen: 22. Dezember 2022

Veröffentlicht: 06. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-26966-6

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GeroScience (2023)

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