Heterologe Produktion des D - Coastwise Ventures Group Co., Ltd

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 8551 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Tuberkulose (TB) ist nach COVID-19 die zweithäufigste Todesursache durch eine einzelne Infektionskrankheit. Trotz jahrhundertelanger Bemühungen verhindert der aktuelle Tuberkulose-Impfstoff Lungentuberkulose nicht wirksam, fördert die Herdenimmunität und verhindert keine Übertragung. Daher sind alternative Ansätze erforderlich. Wir wollen eine Zelltherapie entwickeln, die als Reaktion auf eine Tuberkuloseinfektion ein wirksames Antibiotikum produziert. D-Cycloserin (D-CS) ist ein Zweitlinien-Antibiotikum gegen Tuberkulose, das die bakterielle Zellwandsynthese hemmt. Wir haben festgestellt, dass D-CS aufgrund seiner Wirksamkeit gegen Tuberkulose, seines relativ kurzen Biosynthesewegs und seiner geringen Resistenzhäufigkeit der optimale Kandidat für die Anti-TB-Zelltherapie ist. Der erste Schritt zur D-CS-Synthese wird durch die L-Serin-O-Acetyltransferase (DcsE) katalysiert, die L-Serin und Acetyl-CoA in O-Acetyl-L-Serin (L-OAS) umwandelt. Um zu testen, ob der D-CS-Weg eine wirksame Prophylaxe für Tuberkulose sein könnte, haben wir versucht, funktionelles DcsE in A549-Zellen als menschliches Lungenmodell zu exprimieren. Wir beobachteten die DcsE-FLAG-GFP-Expression mittels Fluoreszenzmikroskopie. Aus A549-Zellen gereinigtes DcsE katalysierte die Synthese von L-OAS, wie durch HPLC-MS beobachtet. Daher synthetisieren menschliche Zellen funktionelles DcsE, das in der Lage ist, L-Serin und Acetyl-CoA in L-OAS umzuwandeln, was den ersten Schritt zur D-CS-Produktion in menschlichen Zellen darstellt.

Tuberkulose (TB) ist eine primär respiratorische Infektionskrankheit, die durch das Bakterium Mycobacterium tuberculosis (Mtb)1 verursacht wird. TB bleibt eine der häufigsten Todesursachen durch eine übertragbare Krankheit weltweit, infizierte 10 Millionen Menschen und tötete 1,5 Millionen Menschen im Jahr 20212. Die aktuelle Der Bacillus Calmette-Guérin (BCG)-Impfstoff gegen Tuberkulose bietet unterschiedliche Schutzraten bei Lungentuberkulose, die nicht bis ins Erwachsenenalter anhalten und zu Nebenwirkungen führen können (Übersicht siehe Ref. 3). Andere Impfstoffversuche, wie der MVA85A-Impfstoff, wurden zur Ergänzung von BCG entwickelt, scheiterten jedoch in Phase-IIIb-Studien, sodass eine Tuberkulose-Prophylaxe weiterhin schwer zu erreichen ist4.

Die Entwicklung einer wirksamen Tuberkulose-Prophylaxe bietet eine wichtige Chance für alternative Ansätze. Die erfolgreiche Geschichte der Chemoprophylaxe und neuer Gentherapien haben den Grundstein für die Möglichkeit gelegt, eine genetische Prophylaxe zu entwickeln, die ein Antibiotikum in menschlichen Zellen produziert (genetische Chemoprophylaxe). Isoniazid wurde als Chemoprophylaxe eingesetzt, die das Risiko, an Tuberkulose zu erkranken, über einen Zeitraum von zwei oder mehr Jahren um 40 % senkt5. Kürzlich wurde entdeckt, dass Gentherapien wirksam gegen Krebs sind. Bei der Therapie mit chimären Antigenrezeptor-T-Zellen (CAR-T) werden T-Zellen genetisch so verändert, dass sie einen chimären Antigenrezeptor enthalten. Dies hilft T-Zellen dabei, Krebszellen anzugreifen, insbesondere akute lymphoblastische Leukämie und großzellige B-Zell-Lymphome6. In einer klinischen Studie, in der Kinder mit akuter lymphoblastischer B-Leukämie für CAR T-22-Behandlungen rekrutiert wurden, erreichten 17 von 20 Teilnehmern eine Remission von mindestens einem Jahr7. Nachdem die CAR-T-Therapie gezeigt hat, dass es möglich ist, Zellen genetisch zu verändern, um Krebszellen anzugreifen, wurden zahlreiche alternative Verabreichungsmethoden und zellbasierte Therapien entwickelt8. Aufgrund der Wirksamkeit der Chemoprophylaxe und des Aufkommens der Gentherapie möchten wir die Machbarkeit einer genetischen Chemoprophylaxe untersuchen, die ein Antibiotikum zur Vorbeugung von Tuberkulose produziert.

Nach der Bewertung aller Erst- und Zweitlinien-TB-Antibiotika wählten wir den D-Cycloserin (D-CS)-Biosyntheseweg als optimalen Kandidaten für die genetische Chemoprophylaxe. In dieser Studie konzentrierten wir uns auf das erste Enzym im Biosyntheseweg, L-Serin-O-Acetyltransferase (DcsE), das O-Acetyl-L-Serin (L-OAS) aus L-Serin und Acetyl-CoA9 produziert (Abb . 1). Wir wollten testen, ob funktionelles DcsE in A549-Zellen, einem Modell menschlicher Lungenzellen vom Typ II, exprimiert werden kann10. Wir transfizierten mit FLAG und Green Fluorescent Protein (GFP) markiertes DcsE in A549-Zellen und beobachteten mithilfe der Fluoreszenzmikroskopie eine hohe Produktion von DcsE-FLAG-GFP. Wir beobachteten die In-vitro-Synthese von L-OAS spezifisch durch gereinigtes DcsE mittels HPLC-MS. Wir liefern Beweise dafür, dass funktionelles DcsE in menschlichen Zellen als erster Schritt für die prophylaktische D-CS-Synthese synthetisiert werden kann.

Biosyntheseweg für D-CS9,14. Durch DcsE katalysierte Boxreaktion. D-Cycloserin kann biosynthetisch mithilfe von sechs Enzymen, DcsA-G (in Fettdruck), und biologisch verfügbaren Reagenzien hergestellt werden: L-Serin, L-Arginin und Acetyl-CoA12.

Um das optimale Antibiotikum für die Synthese in menschlichen Zellen zu identifizieren, haben wir bekannte TB-Antibiotika mit geringem Resistenzprofil, kurzen Biosynthesewegen und in menschlichen Zellen vorhandenen Vorläufern ausgewählt. Aufgrund ihrer bekannten Wirksamkeit gegen Tuberkulose haben wir unsere Suche auf die zwölf Anti-Tuberkulose-Medikamente der ersten und zweiten Wahl beschränkt (Tabelle 1). Wir haben Chemotherapeutika und halbsynthetische Antibiotika ausgeschlossen, die nicht biosynthetisch hergestellt werden konnten (Tabelle 1). Beispielsweise wird Isoniazid durch organische Synthese hergestellt und es ist kein biosynthetischer Weg für die Produktion bekannt11. Ebenso wird die halbsynthetische Verbindung Amikacin aus Kanamycin A über eine Acylierungsreaktion mit L-(-)-4-Amino-2-hydroxybuttersäure abgeleitet, die im menschlichen Metabolom nicht nachgewiesen wird12. Da Amikacin ohne zusätzliche Synthese von L-(-)-4-Amino-2-hydroxybuttersäure nicht biosynthetisch hergestellt werden kann, wird es daher ausgeschlossen. Von den zwölf Erst- und Zweitlinientherapien konnten nur Capreomycin IA/IB, D-CS, Kanamycin A, Streptomycin und Rifamycin SV in menschlichen Zellen produziert werden, da ihre Vorläufer in menschlichen Zellen vorhanden waren und ihre Wege vollständig biosynthetisch sind. Unter diesen Wegen ist D-CS der kürzeste Weg, der nur sechs Syntheseschritte erfordert (Tabelle 1). Im Gegensatz dazu erfordert Capreomycin IA/IB vierzehn Schritte, Kanamycin acht Schritte, Streptomycin fünfundzwanzig Schritte und Rifamycin SV siebenundzwanzig Schritte. D-CS ist ein Zweitlinien-Antibiotikum zur Behandlung multiresistenter Tuberkulose und wird von mehreren Streptomyces-Arten produziert13. S. lavendulae produziert D-CS unter Verwendung von L-Serin, Acetyl-CoA, L-Arginin und sechs von DcsABCDEG kodierten Enzymen (Abb. 1). Dieser Biosyntheseweg wurde heterolog in Escherichia coli reproduziert und es wurde gezeigt, dass er mikromolare Konzentrationen von D-CS14 synthetisiert. Darüber hinaus hemmt D-CS zwei essentielle Enzyme für die Zellwandsynthese von Bakterien, Alaninracemase und D-Alanyl-D-Alaninligase15, was zu der geringen Resistenzhäufigkeit gegenüber D-CS16 beiträgt. Da D-CS auf einem relativ kurzen Weg synthetisiert wird, die Vorläufer in menschlichen Zellen vorhanden sind und die Häufigkeit von Resistenzen gering ist 16, ist der D-CS-Weg optimal für die vorgeschlagene genetische Chemoprophylaxe.

Wir wollten testen, ob DcsE, das erste Enzym des D-CS-Biosynthesewegs von S. lavendulae, bei der Synthese in menschlichen Zellen funktionsfähig ist. Um DcsE-FLAG-GFP in menschlichen Lungenzellen (A549) zu exprimieren, transfizierten wir die Zellen mit Plasmid-DNA, die DcsE-FLAG-GFP oder FLAG-GFP als Negativkontrolle enthielt. Die GFP-Fluoreszenz kann als Maß dafür verwendet werden, ob DcsE exprimiert wird und wo es sich innerhalb der Zelle befindet. Nach zwölf Stunden Transfektion beobachteten wir diffuse GFP-Fluoreszenz in den FLAG-GFP-transfizierten Zellen (Abb. 2a). Im Gegensatz dazu beobachteten wir sowohl diffuse GFP-Fluoreszenz als auch Puncta in den DcsE-FLAG-GFP-transfizierten Zellen (Abb. 2b). Basierend auf diesen Beobachtungen schließen wir, dass DcsE-FLAG-GFP in A549-Zellen exprimiert wird.

A549-Zellen exprimieren FLAG-GFP und DcsE, markiert mit FLAG und GFP. (a) GFP in FLAG-GFP-transfizierten A549-Zellen (Negativkontrolle) zeigt die Expression von GFP-FLAG und stärker diffundiertem Protein an. (b) GFP in DcsE-FLAG-GFP-transfizierten A549-Zellen weist auf eine stärker punktuelle Expression von DcsE-FLAG-GFP hin. Lichtmikroskopie (LM), Grün Fluoreszierendes Protein (GFP). Der Maßstabsbalken beträgt 100 µm.

Wir haben eine Methode zum Nachweis von L-OAS und den Reaktanten in einem für DcsE geeigneten Reaktionspuffer mithilfe von HPLC-MS/MS entwickelt. Wir beobachteten spezifische Retentionszeiten für L-Serin bei 0,9 Minuten (Abb. 3a), L-OAS bei 1,1 Minuten (Abb. 3b) und Acetyl-CoA (Abb. S1) mit Massen, die L-Serin und L-OAS entsprechen (Abb. 3c–f). Ein Elternion eines L-Serin-Standards ergab eine Masse von 106,049 m/z und fragmentierte in eine Masse von 88,0396 m/z, was mit dem Verlust einer Alkoholgruppe vereinbar ist (Abb. 3e). Ein Elternion eines L-OAS-Standards ergab eine Masse von 148,06 m/z mit drei Fragmentionen von 130,05 m/z (im Einklang mit dem Verlust einer Alkoholgruppe aus L-OAS), 106,049 m/z (im Einklang mit dem Verlust). der Acetylgruppe auf L-OAS) und 88,0396 m/z (im Einklang mit dem Verlust einer Alkoholgruppe aus deacetyliertem Serin; Abb. 3f).

Retentionszeiten, MS, MSMS-Ergebnisse und Standardkurven für L-Serin und L-OAS im Reaktionspuffer mittels HPLC-MS. (a) HPLC-Chromatogramm, das die Retentionszeit im Vergleich zu den Zählwerten für 500 µM L-Serin (0,9 Min.) zeigt. (b) HPLC-Chromatogramm eines reinen 125 µM L-OAS-Standards. L-OAS (schwarz) und die Fragmentierung von L-OAS zu L-Serin (rot) treten bei einer Retentionszeit von 1,1 Minuten auf. (c) ESI-TOF-Peak im positiven Modus für L-Serin 106,05 m/z (Molekulargewicht (MW) von L-Serin 105,09). (d) ESI-TOF-Peak im positiven Modus für L-OAS 148,0581 m/z (MW von L-OAS 147,13) und fragmentiertes L-OAS zu L-Serin 106,0499 m/z. (e) Tandem-MS für L-Serin bei 5 V zeigt ein einzelnes Fragment von 88,0396 m/z und intaktes L-Serin bei 106,0499 m/z. (f) Tandem-MS für L-OAS bei 5 V zeigt Fragmente von 88,0396, 106,0499, 130,0500 und intaktes L-OAS bei 148,0602 m/z. (g) Lineare Beziehung zwischen der Peakfläche von L-OAS aus der Standardkurve und der Peakfläche von fragmentiertem L-OAS zu L-Serin. (h) Standardkurve von L-OAS (Konzentrationen im Bereich von 1 mM bis 7,8 µM). Das eingefügte chemische Schema zeigt die Fragmentierung, die mit den beobachteten Fragmentionen übereinstimmt.

Ein reiner L-Serin-Standard zeigt nur eine Masse für L-Serin bei 0,9 min (Abb. 3c). Ein reiner L-OAS-Standard zeigt Massen von L-Serin und L-OAS bei einer Retentionszeit von 1,1 Minuten ohne Serin-Peak bei 0,9 Minuten (Abb. 3b, d). Diese Beobachtung steht im Einklang mit der Deacetylierung des L-OAS-Standards zu L-Serin durch den Elektrospray-Ionisator nach der HPLC-Elution. Wäre Serin im ursprünglichen L-OAS-Standard vorhanden, wäre eine separate Retentionszeit einzuhalten.

Um zu testen, ob die Deacetylierung durch ESI die Quantifizierung von L-OAS beeinflusst, verglichen wir das Verhältnis der L-Serin-Peakfläche (bei 1,1 Min.) und der L-OAS-Peakfläche (bei 1,1 Min.) über unsere L-OAS-Standardkurve. Wir beobachteten, dass die Fragmentierung von L-OAS in L-Serin proportional zur Konzentration ist (Abb. 3g). Daher eignet sich unsere Methode für den Nachweis und die Quantifizierung von L-OAS (Abb. 3h).

Nachdem wir die Expression von DcsE-FLAG-GFP in A549-Zellen beobachtet hatten, wollten wir feststellen, ob L-OAS aus den Transfektionsmedien nachgewiesen werden konnte. Medien von A549-Zellen, die DcsE-FLAG-GFP und FLAG-GFP als Negativkontrolle exprimierten, wurden mittels HPLC-MS analysiert, um L-OAS nachzuweisen. L-OAS wurde im Medium von mit DcsE-FLAG-GFP transfizierten Zellen im Vergleich zu FLAG-GFP nicht nachgewiesen (Abb. 4). In beiden Proben wurde eine Masse von 148,058 m/z mit ähnlicher relativer Häufigkeit nachgewiesen (Abb. 4b, c), es wurden jedoch nicht genügend Fragmentionen identifiziert, die mit einem L-OAS-Standard (Abb. 3f) assoziiert waren (Abb. 4d, e). ). Ein Fragment von 130 m/z wurde im FLAG-GFP-Transfektionsmedium nachgewiesen, was auf den Verlust einer Alkoholgruppe aus der Verbindung mit einer Masse von 148 m/z hinweist; Der Serin-Peak (106 m/z) und das Serin-Fragment-Ion wurden jedoch nicht nachgewiesen (Abb. 4d). In DcsE-FLAG-GFP-Transfektionsmedien wurden keine Fragmentionen nachgewiesen, was darauf hinweist, dass die Verbindung mit einer Masse von 148 m/z kein L-OAS war (Abb. 4e). Zusammenfassend kommen wir zu dem Schluss, dass L-OAS im Transfektionsmedium nicht nachgewiesen werden konnte.

Kein Nachweis von L-OAS aus den Medien von A549-Zellen, die mit DcsE-FLAG-GFP oder FLAG-GFP transfiziert wurden. (a) Chromatogramm des vermuteten L-OAS (148 m/z), nachgewiesen aus den Transfektionsmedien FLAG-GFP (rot) und DcsE-FLAG-GFP (schwarz). (b, c) ESI-TOF-Peaks von 148,058 m/z, die vermutetes L-OAS bei 1,14 Minuten aus den Transfektionsmedien FLAG-GFP (b) und DcsE-FLAG-GFP (c) darstellen. (d,e) Tandem-MS von 148 m/z aus (b) bzw. (c) zeigen Fragmente von 84,0444, 102,0545, 130,0497 und 148,06 m/z bei 5 V. Die erwarteten Fragmentionen von 88,0396 und 106,05 von an L-OAS-Standards wurden nicht erkannt.

Um zu verstehen, ob in A549-Zellen produziertes DcsE-FLAG-GFP in der Lage ist, die Reaktion von L-Serin und Acetyl-CoA zur Bildung von L-OAS zu katalysieren, haben wir das Enzym mithilfe des FLAG-Tags aus Zellen gereinigt. Um festzustellen, ob FLAG-GFP und DcsE-FLAG-GFP nach der Immunpräzipitation gereinigt wurden, führten wir eine Immunblot-Analyse des gesamten Zelllysats durch und wählten Fraktionen aus der Immunpräzipitation aus (siehe Materialien und Methoden sowie Abb. 5). Wie erwartet werden DcsE-FLAG-GFP (67 kDa) und FLAG-GFP (28 kDa) in ihren jeweiligen Lysaten beobachtet (Abb. 5). FLAG-GFP und DcsE-FLAG-GFP werden im Durchfluss oder in den Waschflüssigkeiten nicht nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass das FLAG-Affinitätsgel exprimiertes Protein einfängt. Nach der Elution mit 3 × FLAG-Peptid weist das Vorhandensein von FLAG-GFP und DcsE-FLAG-GFP darauf hin, dass 3 × FLAG-Peptid das Zielprotein eluiert. Das Vorhandensein zusätzlicher Banden in den konzentrierten Elutionen weist auf einen teilweisen Proteinabbau hin. Das Vorhandensein von Tubulin im Lysat und in den Durchflussfraktionen sowie das Fehlen von Tubulin in den Elutionen weisen darauf hin, dass FLAG-GFP und DcsE-FLAG-GFP von anderen zellulären Proteinen gereinigt werden (Abb. 5). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass FLAG-Fällung und Elution FLAG-GFP und DcsE-FLAG-GFP reinigt.

DcsE-FLAG-GFP wird nach der FLAG-Immunpräzipitation gereinigt und konzentriert. Western-Blot-Analyse der angegebenen Fraktionen aus der Reinigung von DcsE-FLAG-GFP (67 kDa) oder FLAG-GFP (28 kDa) aus transfizierten A549-Zellen. Pro Spur wurden 7 µl der angegebenen Fraktion geladen. Die Membran wurde zunächst mit einem Anti-FLAG-Antikörper untersucht und dann abgelöst und erneut mit Anti-Tubulin untersucht, wie in den Materialien und Methoden beschrieben. Als ergänzende Daten werden Blots und Leiterbilder in voller Größe bereitgestellt (Abb. S2).

Um zu testen, ob gereinigtes DcsE, das in A549-Zellen produziert wird, die Reaktion von L-Serin und Acetyl-CoA zu L-OAS katalysieren kann, haben wir L-Serin und Acetyl-CoA in Gegenwart von gereinigtem DcsE-FLAG-GFP oder FLAG-GFP as umgesetzt eine Kontrolle und nutzte HPLC-MS, um das erwartete Produkt L-OAS nachzuweisen. Wir beobachteten L-OAS in der Probe, die DcsE-FLAG-GFP, aber kein FLAG-GFP enthielt (Abb. 6a). Mit DcsE-FLAG-GFP hergestelltes L-OAS hatte eine Retentionszeit von 1,117 min (Abb. 6a) und 148,0606 m/z (Abb. 6c). Tandem-MS zeigt L-OAS, das durch DcsE-FLAG-GFP-Fragmente in Fragmente mit 131,0335, 106,0498 und 88,0395 m/z erzeugt wird (Abb. 6d), was mit den Tandem-MS-Daten für einen L-OAS-Standard übereinstimmt (Abb. 3f). In der FLAG-GFP-Reaktion wurde kein L-OAS nachgewiesen (Abb. 6b). Gleichzeitig führten wir eine Standardkurve von L-OAS durch (Abb. 3h), um das von DcsE-FLAG-GFP erzeugte L-OAS zu berechnen. Wir beobachteten, dass DcsE-FLAG-GFP nach einer einstündigen Reaktion bei 30 °C 40,3 µM L-OAS produzierte. Daraus schließen wir auf eine aktive heterologe Produktion von DcsE-FLAG-GFP in A549-Zellen.

Synthese des D-CS-Zwischenprodukts L-OAS durch heterolog gereinigtes DcsE-FLAG-GFP. Gereinigtes DcsE, das mit L-Serin und Acetyl-CoA reagierte, war funktionsfähig, wie durch die Anwesenheit des Enzymprodukts L-OAS mittels HPLC-MS bestimmt wurde, wie von MassHunter analysiert. (a) HPLC-Chromatogramm von L-OAS, erzeugt durch DcsE-FLAG-GFP (in Schwarz) bei 1,117 min. L-OAS wurde in einer Reaktion mit FLAG-GFP (in rot) nicht nachgewiesen. (b) FLAG-GFP-haltige Proben erzeugen keinen nachweisbaren Peak von 148,06 m/z bei 1,117 Minuten, was darauf hindeutet, dass keine L-OAS-Produktion erfolgt. (c) DcsE-FLAG-GFP-haltige Proben erzeugen einen ESI-TOF-Peak von 148,06 m/z bei 1,117 min, was der Masse von L-OAS entspricht. (d) Tandem-MS von L-OAS, hergestellt durch DcsE, erzeugt Fragmente bei 88,04, 106,05 und 131,03 m/z.

In dieser Studie haben wir beobachtet, dass mit DcsE-FLAG-GFP transfizierte menschliche Lungenzellen in der Lage sind, funktionelles DcsE zu synthetisieren, das den ersten Schritt zur D-CS-Synthese katalysiert. D-CS ist ein optimaler Kandidat für eine genetische Chemoprophylaxe gegen Tuberkulose, da es der kürzeste bekannte Weg für ein Anti-TB-Antibiotikum mit biologisch verfügbaren Vorläufern ist (Tabelle 1). Mit FLAG-GFP markiertes DcsE kann in A549-Zellen exprimiert werden (Abb. 2), es gibt jedoch keinen nennenswerten Unterschied zwischen dem L-OAS, das aus DcsE-FLAG-GFP- und FLAG-GFP-Transfektionsmedien nachgewiesen wird (Abb. 4). Gereinigtes DcsE-FLAG-GFP (Abb. 5) katalysiert jedoch die Bildung von L-OAS aus L-Serin und Acetyl-CoA (Abb. 6). Durch gereinigtes DcsE-FLAG-GFP hergestelltes L-OAS hat die erwartete Retentionszeit von 1,1 min (Abb. 6a), eine Masse von 148,13 m/z (Abb. 6c) und erzeugte die gleichen 106 m/z und 131 m/z Fragmente bei 5 V (Abb. 6d) als 0,5 mM L-OAS-Standard in Reaktionspuffer (Abb. 3f). Bei einer Reaktion mit gereinigtem FLAG-GFP wurde kein L-OAS nachgewiesen (Abb. 6b).

Die Produktion eines aktiven DcsE-Enzyms in menschlichen Lungenzellen zeigt Fortschritte auf dem Weg zu einer genetischen Chemoprophylaxe gegen Tuberkulose. Frühere Studien haben gezeigt, dass andere Tuberkulose-Antibiotika wie Isoniazid prophylaktisch zur Vorbeugung einer Tuberkuloseinfektion bei HIV-Infizierten und Menschen eingesetzt werden können, deren Tuberkulose-Hauttest positiv auf Tuberkulose getestet wurde26. Isoniazid ist nicht das einzige TB-Antibiotikum, das chemoprophylaktisch eingesetzt wird; Es wurde auch gezeigt, dass Rifampicin, Pyridoxin und Kombinationen von Rifampicin und Pyridoxin die Inzidenz von TB-Infektionen im Vergleich zu einem Placebo verringern27.

Eine Einschränkung bei der Verwendung von D-CS für die vorgeschlagene Gentherapie ist die vergleichsweise hohe minimale Hemmkonzentration (MHK) für Mtb von 10–50 µg/ml, die die Wirksamkeit der Therapie einschränken könnte, je nachdem, wie viel D-CS produziert werden kann Menschen. In dieser Studie wurden nach einer einstündigen Reaktion bei 30 °C 40,3 µM L-OAS produziert, was 5,94 µg/ml L-OAS entspricht, was bedeutet, dass die Konzentration eines Vorläufers niedriger ist als die MHK von D-CS. Darüber hinaus wurde in Medien aus FLAG-GFP- und DcsE-FLAG-GFP-transfizierten Zellen kein L-OAS nachgewiesen (Abb. 4), sodass DcsE und andere D-CS-Biosynthesegene optimiert werden müssen.

Allerdings muss die D-CS-Expression nicht die volle MHK-Konzentration erreichen, um wirksam zu sein. Typischerweise erreicht D-CS bei Patienten keine MHK-Konzentrationen, was darauf hindeutet, dass das Erreichen der MHK für die therapeutische Wirksamkeit nicht erforderlich ist. D-CS ist für seine schlechte Penetration in die Lungenhöhle bekannt. Die klinische Dosis von 250 mg für Erwachsene erreicht nur Konzentrationen von weniger als 2 µg/ml in der Lunge28, was bedeutet, dass geringe Mengen an D-CS, die intrazellulär produziert werden, während die Infektion mild ist, klinisch relevant sein könnten. Zukünftige Experimente unter Bedingungen, die die komplexe Umgebung des menschlichen Systems genauer modellieren, könnten die realistischen Konzentrationen von D-CS, die produziert werden könnten, besser bestimmen. Beispielsweise könnten nichtkrebsartige Zellmodelle wie Beas-2B, Makrophagen und In-vivo-Modelle verwendet werden. Darüber hinaus werden In-vivo-Modelle besser darstellen, wie die lokale D-CS-Expression auf Organebene in Körpersystemen schützen könnte.

Um die genetische Chemoprophylaxe bei Tuberkulose sicher anzuwenden, schlagen wir die Entwicklung einer herausschneidbaren Gentherapie vor, die D-CS speziell bei Vorliegen einer Tuberkuloseinfektion abgibt, wie in Abb. 7 dargestellt. Eine solche Gentherapie muss im Falle von Nebenwirkungen herausschneidbar sein. im Falle einer Infektion induzierbar und spezifisch als Reaktion auf Tuberkulose aktiv. Die ortsspezifische Rekombination des CRE/loxP1-Systems könnte genutzt werden, um dcsABCDEG im Falle unerwünschter Wirkungen dauerhaft zu entfernen. Wie in Abb. 7a dargestellt, wird die Expression der Rekombinase CRE durch das Medikament Tamoxifen29 aktiviert. Bei der Expression spaltet CRE die beiden loxP-Stellen und schneidet so das Konstrukt heraus, das für die Produktion von D-CS verantwortlich ist (Abb. 7b). Das CRE/loxP1-System ist ein geeignetes System für diese Anwendung, da es präzise ist, durch ein Arzneimittel gesteuert wird, das in menschlichen Zellen natürlicherweise nicht vorkommt, und in der Lage ist, die D-CS-Expression schnell und dauerhaft zu stoppen. Darüber hinaus wird dcsABCDEG bei Vorliegen einer Infektion selektiv über ein geeignetes, auf eine Infektion reagierendes Promotorelement exprimiert (InfRE; Abb. 7c). Beispielsweise könnte der MIP-2-Promotor verwendet werden, um das Plasmid in Gegenwart intrazellulärer Bakterien wie Mtb30,31 zu aktivieren. Da der MIP-2-Promotor auf alle intrazellulären Infektionen reagiert, ist zusätzliches molekulares Engineering erforderlich. Um dies zu erreichen, könnte die von Mtb produzierte MycP1-Protease32 zur Steuerung der Expression funktioneller Enzyme eingesetzt werden. Durch die Verknüpfung von DcsABCDEG mit dem MycP1-spezifischen Polypeptid SLKPASAGGG gehen wir davon aus, dass aktives Enzym nur in Gegenwart von Tuberkulose produziert wird. Durch die Einbeziehung eines infektionsinduzierten Promotors, von MycP1-Stellen zwischen den einzelnen Enzymen zur Steuerung der Funktionalität von Enzymen in Gegenwart von Tuberkulose und eines durch CRE/loxP1 kontrollierten herausschneidbaren Plasmids in unser Design wird die Expression von D-CS-Synthesegenen kontrolliert.

Vorgeschlagenes herausschneidbares D-CS-Plasmid für die TB-induzierbare Expression. (a) Karte des vorgeschlagenen D-CS-Plasmids. Promotor des auf Infektionen reagierenden Elements (grau: InfRE), Tamoxifen-induzierbarer Promotor (grau: TAM), DcsABCDEG- und CRE-Gene (rot), herausschneidbare loxP-Stellen (gold), Mtb-MycP1-Spaltstellen SLKPASAGGG (gepunktete Linien). (b) Zelle mit herausgeschnittenem Plasmid, das durch Tamoxifen aktiviert wurde und CRE-Rekombinase exprimiert, um an loxP-Stellen zu schneiden. (c) Zelle, die DcsABCDEG nicht exprimiert, wenn keine TB-Infektion vorliegt. (d) Zelle, die DcsABCDEG im Falle einer TB-Infektion exprimiert.

Ein weiterer wichtiger Sicherheitsfaktor ist die Toleranz des Gastgebers. Wie in Abb. 1 dargestellt, synthetisieren DcsA und B Hydroxyharnstoff aus L-Arginin14. Es ist bekannt, dass Hydroxyharnstoff in Konzentrationen von 2–10 mM zytotoxisch für menschliche Zellen ist 33. Während diese Konzentrationen die erwartete In-vivo-Konzentration von D-CS von etwa 50 µM bei weitem übersteigen, wird ein wichtiger zukünftiger Forschungsbereich die Bestimmung sein, ob Hydroxyharnstoff toxisch wird oder wird von DcsD schnell genug verbraucht, um zytotoxische Wirkungen zu vermeiden.

Das zur Durchführung der genetischen Chemoprophylaxe verwendete System muss langlebig und gut verträglich sein. Adeno-assoziierte Viren (AAV) sind eine Möglichkeit, ein Konstrukt ähnlich dem in Abb. 7a vorgeschlagenen zu liefern. AAV sind eine vielseitige und effektive Möglichkeit, genetisches Material über eine Proteinhülle mit einzelsträngiger DNA34 zu transportieren. Die Genomkapazität von AAV wird im Allgemeinen auf etwa 4,5–5 kb geschätzt, was unter der geschätzten Größe des in Abb. 7 vorgeschlagenen Plasmids liegt. Es wurde jedoch gezeigt, dass AAV5, ein Serotyp von AAV, Genomgrößen von bis zu 8,9 kb enthält35 Das ist größer als das in Abb. 7 vorgeschlagene Plasmid. Kationische Liposomen (CLs) sind ein weiteres Beispiel für eine Technologie, die eine Gentherapie liefern kann. CLs sind nicht viral und nutzen eine geschlossene Lipiddoppelschichtmembran, um Gene zu transportieren und die DNA vor Abbau zu schützen36. CLs sind sehr anpassbar und können bis zu 1.000 kb36 in Zellen übertragen, was sie zu einer weiteren vielversprechenden Technologie für gentherapeutische Anwendungen macht. Insgesamt handelt es sich sowohl bei AAV als auch bei CL um Verabreichungsmethoden, mit denen das Gewebekonstrukt spezifisch, sicher und zuverlässig verabreicht werden kann. Die In-vivo-Verabreichung von Gentherapie ist ein aktives Forschungsgebiet zur Steigerung der relativ geringen Transfektionseffizienz mithilfe von AAV und CL37. Darüber hinaus wären zukünftige Studien erforderlich, um zu bestimmen, ob Makrophagen oder Lungenzellen aufgrund der Art der TB-Infektion und der Transfektionseffizienz jedes Zelltyps ein besseres Endziel für diesen Ansatz wären.

Durch die Beobachtung der heterologen Produktion von funktionellem DcsE-FLAG-GFP liefern wir den Beweis, dass der erste Schritt zur prophylaktischen D-CS-Synthese in menschlichen Zellen möglich ist. Zu unseren unmittelbaren zukünftigen Zielen gehört die Entwicklung einer Methode zur Beobachtung dieser enzymatischen Aktivität in lebenden A549-Zellen und schließlich die Synthese aller sechs Enzyme im D-CS-Weg über das vorgeschlagene Plasmid. Darüber hinaus könnten zukünftige Studien diese Studie in nicht krebsartigen Zellmodellen wie Beas-2B oder Makrophagen replizieren. Schließlich wären letztendlich In-vivo-Modelle erforderlich, um die Wirksamkeit der vorgeschlagenen genetischen Chemoprophylaxe zu bestimmen. Angesichts des rasanten Wachstums zellbasierter Therapien möchten wir jetzt die Werkzeuge schaffen, um uns auf eine Zukunft vorzubereiten, in der Gentherapien alltäglich, sicher, wirtschaftlich plausibel und gut akzeptiert sind.

A549 respiratorische Epithelzellen (ATCC CCL-185) wurden in komplettem F-12 K-Medium gehalten, bestehend aus Kaighns Modifikation von Hams F-12 K-Medium (ATCC 30–2004), 10 % FBS (v/v; VWR 89.510–186). und 1 % Penicillin-Streptomycin (v/v; ATCC 30–2300). Die Zellen wurden gemäß den ATCC-Handhabungsrichtlinien für A549-Zellen38 gepflegt.

Das DcsE-Gen ist im D-Cycloserin synthetisierenden Bakterium Streptomyces lavendulae vorhanden. S. lavendulae (ATCC #11.924) wurde von ATCC in gefriergetrockneter Form erhalten und gemäß den Anweisungen des Lieferanten (ATCC, nd-c) reanimiert. Der Organismus wurde in Hefe-Malzextrakt-Brühe (5 g Dextrose, 2,5 g Pepton, 1,5 g Malzextrakt und 1,5 g Hefeextrakt, aufgefüllt auf 500 ml in diH2O) wiederbelebt und auf demselben Agarmedium ausgestrichen, wobei das Wachstum zwei Tage später erfolgte Beimpfung bei 26 °C.

Anschließend wurde eine frische Flüssigkultur von S. lavendulae aus einer einzelnen Kolonie kultiviert und nach dem Wachstum wurden die Zellen lysiert. 5 ml Zellen wurden pelletiert und in 200 µl Lysozym-Verdauungspuffer gewaschen. Anschließend wurden die Zellen in ein Zentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss, das 0,1 mm große Glasperlen enthielt, überführt und 30 s lang homogenisiert. Anschließend wurde genomische DNA aus den Bakterien mit dem PureLink Genomic DNA Minikit (Katalog #k182001) extrahiert. Die endgültige eluierte Lösung wurde mit einem Nanotropfen analysiert und zeigte den für DNA charakteristischen sauberen Peak bei 260 nm. Es wurden zwei Konzentrationsmessungen durchgeführt, die eine ungefähre Konzentration von 15 ng/µl ergaben.

DcsE wurde zuerst durch Gibson-Assemblierung (https://www.nature.com/articles/nmeth.1318) unter Verwendung des NEB HiFi-DNA-Systems (Katalog-Nr. E2621S) in den Vektor pCOOFY50 (Addgene-Plasmid Nr. 55,189) kloniert. 20 ng des PCOOFY50-Rückgrats wurden unter Verwendung der Primer AB0001 und AB0002 (Tabelle 2) und pHusion High-Fidelity-Polymerase (NEB # M0530S) gemäß dem in Tabelle 3 beschriebenen PCR-Protokoll amplifiziert. Ebenso wurde ein DcsE-Fragment unter Verwendung von 50 ng Genom amplifiziert DNA aus S. lavendulae und den Primern AB0009 und AB0010 unter Verwendung desselben Protokolls. Nach der PCR-Produktreinigung mit dem Zymo Clean and Concentrator Kit (Zymo #D4004) wurden homologe Enden der beiden Produkte mit dem NEB HiFi-DNA-System (Katalog #E2621S) annealt und wie unten beschrieben in DH5α E. coli transformiert.

Weder DcsE noch GFP wurden unter Verwendung des pCOOFY50-Vektors exprimiert, daher wurde DcsE in pCS2 + (https://www.addgene.org/vector-database/2295/) subkloniert, das FLAG-GFP stromabwärts des CMV-Promotors enthielt. DcsE wurde mittels PCR-Amplifikation in pCS2 + subkloniert, gefolgt von der oben beschriebenen Gibson-Assemblierung mit den folgenden Modifikationen: Die Primer ASB001 und ASB002 wurden zur Amplifikation des pCS2-FLAG-GFP-Rückgrats verwendet und die Primer ASB011 und ASB012 wurden zur Amplifikation von DcsE aus pCOOFY50-DcsE verwendet. Die resultierenden Plasmide wurden pCS2-FLAG-GFP und pCS2-DcsE-FLAG-GFP genannt.

Die Promotorsequenzen und offenen Leserahmen von Plasmiden wurden durch Sanger-Sequenzierung in der Sequenzierungseinrichtung des University of Chicago Comprehensive Cancer Center (UCCC) verifiziert.

Um kompetentes DH5α mit DcsE-FLAG-GFP oder FLAG-GFP zu transformieren, wurden 50 µl kompetentes DH5α und 2 µl gereinigtes Plasmid kombiniert und 30 Minuten auf Eis inkubiert. Die Proben wurden 45 Sekunden lang einem Hitzeschock bei 42 °C ausgesetzt und 5 Minuten lang auf Eis gelegt. 800 µl SOC wurden hinzugefügt und eine Stunde lang bei Raumtemperatur geschüttelt. 150 µl dieser Lösung wurden auf LB-Agarplatten mit 100 µg/ml Ampicillin ausplattiert und über Nacht bei 37 °C wachsen gelassen. Eine Kolonie wurde in 5 ml sterile LB-Brühe mit 100 µg/ml Ampicillin überführt und 12 Stunden lang bei 37 °C geschüttelt. Das ZymoPURE Plasmid Miniprep Kit wurde gemäß dem Zentrifugationsprotokoll zur Reinigung von reinem Plasmid verwendet.

Um A549-Zellen mit DcsE-FLAG-GFP oder FLAG-GFP zu transfizieren, wurden die Zellen auf mit Gewebekultur behandelten 60-mm-Platten in einer Konzentration von 176.800 Zellen/ml in vollständigem F-12 K-Medium ausplattiert. 12 Stunden nach dem Ausplattieren wurden die Zellen mit Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher L3000) und 6 ug gereinigtem Plasmid gemäß den Thermo Fisher-Richtlinien für A549-Zellen transfiziert39. Die Zellen wurden über Nacht 12 Stunden lang bei 37 °C und 4,5 % CO2 transfiziert. Nach 12 Stunden Transfektion wurden die Medien gesammelt und für die anschließende Analyse aufbewahrt.

A549-Zellen wurden 12 Stunden nach der Transfektion unter Verwendung eines invertierten Phasenkontrastmikroskops Nikon Eclipse TE2000-U (Tokio, Japan) mit einem Nikon TE2-PS100W-Netzteil, einer 100-W-Quecksilberlampe der Chiu Technical Corporation (Kings Park, USA) abgebildet Nikon NIS-Elements-Software. Zellbilder wurden mit dem 10-fachen Objektiv, dem 1,5-fachen Bonuszoom und Phase 1 aufgenommen. Für jede Position wurde ein Bild mit Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) zur Fokussierung der Zellen und blauem Licht zur Abbildung der GFP-Fluoreszenz aufgenommen. ImageJ wurde zum Zusammenführen von Bildern verwendet.

A549-Zellen wurden unmittelbar nach der Transfektion und Bildgebung lysiert. Das Medium wurde entfernt und die Zellen wurden mit 5 ml PBS (ATCC 30–2200) gewaschen. 150 µl kalter Radioimmunpräzipitations-Assay-Puffer (RIPA)-Lysepuffer mit 150 mM NaCl, 1 % IGEPAL CA-630 (NP40), 0,5 % Natriumdesoxycholat, 0,1 % SDS (Natriumdodecylsulfat), 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 wurden hinzugefügt zu jedem Teller. Die Zellen wurden mit einem Zellschaber etwa 30 Sekunden lang auf Eis lysiert. Um sicherzustellen, dass alle Zellen lysiert wurden, wurde ein Umkehrmikroskop verwendet. Die gesamte Flüssigkeit wurde in vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen überführt und 10 Minuten lang bei 4 °C und 13.000 xg zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues Röhrchen überführt und die Reinigung erfolgte sofort.

Das Zelllysat wurde sofort gereinigt, um Proteasen im Rohlysat zu entfernen. Das Protein wurde mit Sigma Monoclonal ANTI-FLAG M2 Affinity Gel gereinigt und das Sigma-Protokoll „Immunpräzipitation von FLAG-Fusionsproteinen unter Verwendung monoklonaler Antikörper-Affinitätsgele“ befolgt. TBS (0,5 M Tris-HCl, pH 7,5, 1 M NaCl) wurde zum Waschen des Gels vor der Immunpräzipitation verwendet. Die Proben wurden dreimal mit 3 × FLAG-Peptid (Rockland Immunochemicals) bei einer Arbeitskonzentration von 150 ng/µL in TBS eluiert. Nach der Elution wurden die Proben unter Verwendung eines 500-µl-10-kDa-Mikrozentrifugenfilters (Amicon) filtriert, um überschüssiges 3 × FLAG-Peptid herauszufiltern, und den Lysepuffer gegen 10 × Reaktionspuffer mit 40 mM Tris-HCl (pH 7,6), 400 mM NaCl und 2 mM auszutauschen EDTA, modifiziert von und zur Konzentration von Proben auf ein Endvolumen von 50 µl.

Das Vorhandensein von FLAG-GFP und DcsE-FLAG-GFP wurde mithilfe des abcam-Western-Blot-Protokolls40 nachgewiesen. 7 µl jeder Fraktion wurden pro Spur zusammen mit 2,5 µl 4 × LDS-Probenpuffer (Thermo Fisher NP0007) geladen. 5 µl vorgefärbte PageRuler-Proteinleiter wurden als Referenz verwendet (Thermo Fisher 26.616). Ein NuPAGE 4–12 % Bis-Tris-Gel (Thermo Fisher NP0321BOX) wurde mit NuPAGE MES SDS-Laufpuffer (Thermo Fisher NP0002) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet41. Die Gele wurden unter Verwendung einer Bio-Rad Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell bei 25 V für 30 Minuten mit Bjerrum Schafer-Nielsen Transferpuffer: Tris Base 48 mM und Glycin 39 mM (pH 9,2) auf eine PVDF-Membran übertragen. Die Membran wurde in 3 % BSA (Gew./Vol.) in PBS 0,1 % Tween 20 blockiert. Primäres Anti-FLAG (Sigma F1804) wurde 1:1000 in 3 % BSA verdünnt und das sekundäre Anti-Maus (Thermo Fisher 31.431) wurde verdünnt 1:10.000. ECL-Substrat (BioRad 1.705.062) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers42 mit einem BioRad ChemiDoc Imaging System verwendet. Western-Blots wurden gestrippt und erneut untersucht, wobei das Abcam-Stripping-for-Reproding-Protokoll43 zum Einsatz kam. Primäres Anti-Tubulin (NOVUS NB600-936) wurde 1:1000 verdünnt und sekundäres Anti-Kaninchen (Promega W401B) wurde 1:2000 verdünnt. Die Blots wurden wie oben beschrieben abgebildet.

Zur Durchführung der In-vitro-L-OAS-Synthese14 wurden 20 µl gereinigtes DcsE-FLAG-GFP und FLAG-GFP in einer 50-µl-Reaktion bei einer Endkonzentration von 1 mM L-Serin und 1 mM Acetyl-CoA in einem Reaktionspuffer umgesetzt44 enthält 4 mM Tris-HCl (pH 7,6), 40 mM NaCl, 0,2 mM EDTA und 1 mM Dithiothreitol (DTT). Die Proben wurden 1 Stunde lang bei 30 °C umgesetzt.

HPLC-MS wurde verwendet, um L-Serin und L-OAS aus In-vitro-L-OAS-Syntheseproben nachzuweisen. Die Proben wurden unter Verwendung einer Agilent 1290 Infinity II HPLC mit einer wässrigen C18-Säule YMC ODS-AQ 2,0 mm × 100 mm, 5 μm (YMC America) und einem Agilent 6545 Quadrupol Time of Flight LC/MS-Massenspektrometer im positiven Modus am Integrierten getrennt Einrichtungen des Molecular Structure Education and Research Center (IMSERC) an der Northwestern University. 1 µl Proben wurden injiziert, beginnend mit einer Konzentration von 100 % Lösungsmittel A (H2O + 0,1 % Ameisensäure (FA)) und 0 % Lösungsmittel B (ACN + 0,1 % FA). Der Anteil des Lösungsmittels B wurde von 2,0 auf 7,0 min linear auf 50 % erhöht. Von 7,0 bis 9,0 min wurde der Anteil an Lösungsmittel B wieder linear auf 99 % erhöht. Von 11,0 Min. bis 11,5 Min. wurde Lösungsmittel A von 1,0 % auf 100 % erhöht. Lösungsmittel A blieb bei 100 %, bis die Gesamtmethode 16 Minuten erreichte. Die Flussrate wurde auf 0,3 ml/min eingestellt und alle Proben wurden bei Raumtemperatur getestet.

Mit dieser Methode wurde eine Standardkurve von 1:1-Reihenverdünnungen für L-Serin und L-OAS im Bereich von 500 µM bis 3,9 µM erstellt. Umgesetzte Proben wurden durch Zugabe eines gleichen Volumens von 0,1 % FA (Sigma 5.43804) in Acetonitril (Sigma 34.851) unmittelbar nach Abschluss der Reaktion hergestellt. Die Proben wurden vortexiert und 10 Minuten lang bei Höchstgeschwindigkeit zentrifugiert, und dann wurden 75 µl des Überstands in Autosamplerfläschchen überführt. Mit der gleichen Methode wie oben wurde HPLC-MS verwendet, um Produkte in Proben nachzuweisen. Für Tandem-MS wurden Spannungen von 2,0 und 5,0 V verwendet. Für den Betrieb des Instruments wurde die Software MassHunter Data Acquisition und für die Datenanalyse MassHunter Qualitative Analysis verwendet (Agilent MassHunter Quantitative Analysis, Version 10.0, Build 10.0.10305.0. RRID:SCR_016657).

Die dieser Arbeit zugrunde liegenden Daten sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Die Autoren danken Dr. Fernando Tobias und Dr. Ben Owen von den Northwestern IMSERC-Einrichtungen für die Unterstützung bei der Verwendung von HPLC-MS und dem DebBurman Lab für ihr Fluoreszenzmikroskop. Die Autoren danken außerdem Rebecca Delventhal und Karen Kirk für die Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde vom Lake Forest College Biochemistry and Molecular Biology Program unterstützt.

Abteilung für Chemie und Biochemie und Molekularbiologieprogramm, Lake Forest College, Lake Forest, USA

Laurel Robbins, Ariane Balaram, Stefanie Dejneka, Matthew McMahon, Zarina Najibi, Peter Pawlowicz und William H. Conrad

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LR und WC haben das Hauptmanuskript geschrieben und Experimente entworfen. LR führte alle Experimente mit Ausnahme des Plasmiddesigns durch. ZN entwarf Experimente und trug zur Reproduktion von Abb. 1 bei. AB führte die Plasmidkonstruktion und -validierung durch. LR erstellte alle Abbildungen mit Ausnahme von Abb. 7 und MM erstellte Tabelle 1. SD und PP trugen zur Einleitung, den Experimenten und Abb. 7 bei. Alle Autoren überprüften das Manuskript.

Korrespondenz mit William H. Conrad.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Robbins, L., Balaram, A., Dejneka, S. et al. Heterologe Produktion des D-Cycloserin-Zwischenprodukts O-Acetyl-L-Serin in einem menschlichen Lungenzellmodell vom Typ II. Sci Rep 13, 8551 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35632-4

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Eingegangen: 19. Oktober 2022

Angenommen: 21. Mai 2023

Veröffentlicht: 26. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35632-4

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