Modulation des Darmmikrobioms mit Nisin - Coastwise Ventures Group Co., Ltd

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 7899 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Nisin ist ein Breitspektrum-Bakteriocin, das häufig als Lebensmittelkonservierungsmittel verwendet wird und vor fast einem Jahrhundert in Lactococcus lactis identifiziert wurde. Wir zeigen, dass oral aufgenommenes Nisin den Transport durch den Magen-Darm-Trakt von Schweinen intakt übersteht (wie durch Aktivität und Molekulargewichtsbestimmung belegt) und dort sowohl die Zusammensetzung als auch die Funktion der Mikrobiota beeinflusst. Insbesondere führte die Behandlung mit Nisin zu einem reversiblen Rückgang grampositiver Bakterien, was zu einer Umformung der Firmicutes und einem entsprechenden relativen Anstieg gramnegativer Proteobakterien führte. Diese Veränderungen spiegelten sich in der Veränderung der relativen Häufigkeit der an der Acetat-, Butyrat- (verminderten) und Propionat- (erhöhten) Synthese beteiligten Stoffwechselwege wider, die mit einer allgemeinen Verringerung der Konzentration kurzkettiger Fettsäuren im Stuhl korrelierten. Diese reversiblen Veränderungen, die durch die Einnahme von Nisin entstehen, zeigen das Potenzial von Bakteriozinen wie Nisin, das Mikrobiom von Säugetieren zu formen und sich auf die Funktionalität der Gemeinschaft auszuwirken.

Bakteriozine sind antimikrobielle Peptide, die von vielen Bakterienarten produziert werden1. Nisin ist ein Bakteriozin, das von Lactococcus lactis produziert wird und ein breites Wirkungsspektrum gegen grampositive Bakterien aufweist2,3. Nisin A wurde von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) (US Food and Drug Administration, 1988) und der Europäischen Behörde für Lebensmittelsicherheit (EFSA; E-Nummer E234) zur Verwendung als Lebensmittelkonservierungsmittel zugelassen und wird daher vom Menschen konsumiert4. Nisin (in Form des im Handel erhältlichen Nisaplin) wurde ohne Nebenwirkungen in Dosen von bis zu 239 mg pro kg Körpergewicht an Ratten verfüttert5. Nisin ist in vitro wirksam gegen grampositive Darmpathogene wie Clostridioides difficile6 und kontrolliert in Kombination mit Zimtaldehyd und Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) nachweislich das Wachstum von gramnegativen enterotoxigenen Escherichia coli (ETEC)7. Es wurde auch gezeigt, dass Nisin eine In-vivo-Wirksamkeit auf das Mikrobiom von Mäusen8,9 und Hühnern10 sowie eine Ex-vivo-Wirksamkeit auf das menschliche Mikrobiom11 aufweist. Dennoch haben bisher keine Studien seine In-vivo-Wirksamkeit bei großen Säugetieren gezeigt. Aufgrund seiner proteinhaltigen Natur wurde angenommen, dass Nisin aufgrund der Einwirkung proteolytischer Enzyme im oberen Darm abgebaut wird, wie wir zuvor für andere Bakteriozine, nämlich Lacticin 314712 und Thuricin CD13, gezeigt haben. Wenn Nisin den unteren Magen-Darm-Trakt nicht intakt erreicht14,15, sollte es bei oraler Einnahme keinen Einfluss auf die Darmmikrobiota haben. In dieser Studie haben wir hochkonzentriertes Nisin an Ferkel nach dem Absetzen verfüttert, um dessen Einfluss auf die Darmmikrobiota mithilfe von 16S-Sequenzierung, Metagenomik (Shotgun), GC-MS und Maldi-Tof-MS zu bestimmen. Wir haben auch ein auf Ethylcellulose basierendes Präparat zum Schutz (Einkapselung) von Nisin vor einem möglichen Abbau im oberen Gastrointestinaltrakt16 einbezogen und es mit nicht eingekapseltem Nisin verglichen, was in früheren Studien nicht getestet wurde.

Hier zeigen wir, dass intaktes, nicht eingekapseltes Nisin in den unteren Magen-Darm-Trakt von Schweinen gelangt und während des gesamten Behandlungszeitraums erhebliche, aber reversible Veränderungen der mikrobiellen Zusammensetzung, der kurzkettigen Fettsäuren (SCFA) und spezifischer Stoffwechselwege verursacht.

Das Ziel dieser Studie bestand darin, zu bewerten, ob oral aufgenommenes Nisin den Darm intakt erreichen und das Darmmikrobiom von Schweinen modulieren kann (Abb. 1a). Aufgrund der proteinhaltigen Natur von Nisin verwendeten wir sowohl nicht eingekapseltes (Nis-pdr) als auch eingekapseltes Nisin (Nis-en), die direkt dem Schweinefutter zugesetzt wurden. Diese Studie umfasste auch eine Kontrollgruppe ohne Behandlung (Ctl) und eine Gruppe, die mit dem Material gefüttert wurde, das zur Einkapselung des Nisins verwendet wurde (Encap). Schließlich überwachten wir die Zusammensetzung und Funktionalität der Darmmikrobiota nach Beendigung der Behandlung, um festzustellen, wie lange etwaige Veränderungen anhielten.

Überblick über das Experiment, die Ergebnisse der Massenspektroskopie und der Metabolomik. (a) Übersicht über die Behandlungsgruppen und den Probenahmezeitplan. (b) MALDI-TOF-Massenspektrophotometrie-Analyse und Aktivitätstests zum Nachweis von Nisin (Bilder). Nachweis von intaktem Nisin (rote Pfeile) im Kot von Schweinen in der mit Nisinpulver behandelten Gruppe zu Studienbeginn (BL), 24 Stunden nach der Erstbehandlung (T24), 48 Stunden nach der Erstbehandlung (T48), 72 Stunden nach der Erstbehandlung (T72). ), 72 Stunden nach Ende der Erstbehandlung (3 Tage PT) und 10 Tage nach Ende der Erstbehandlung (10 Tage PT). Am 7. Tag wurden kleinere Zonen und Nisin-Massen gefunden und am 14. Tag wurden keine Zonen oder Massen gefunden (1 von 10 Dil). (c) Biologische Aktivität von Nisin und Nisin-Peak-Detektion in Kotproben von Schweinen mithilfe der Maldi-TOF-Massenspektrophotometrie. (d) SCFA-Konzentration (mM) in der Kontrolle (hier Ctl und Encap zusammengefasst) im Vergleich zu Nisin-Gruppen (hier nis-en und nis-pdr zusammengefasst) über BL, T72 und 10 Tage PT (Wilcoxon-Rank-Sum-Test, *p < 0,05). , **p < 0,01, ***p < 0,001).

Sowohl die MALDI-TOF-Massenspektrometrie als auch die Aktivitätstests bestätigten das Vorhandensein von intaktem Nisin und antibakterieller Aktivität im Kot jedes Schweins sowohl in der mit eingekapseltem Nisin als auch in der mit Nisinpulver behandelten Gruppe während des gesamten Behandlungszeitraums (Abb. 1b). Diese Analyse ergab einen Peak, der der Molekülmasse von intaktem Nisin (3331,05 Da) an den Behandlungstagen in den beiden mit Nisin behandelten Gruppen (Nis-en und Nis-pdr) entsprach (siehe ergänzende Abbildung 5 für Nis-en). Die durch Bohrlochdiffusionstests gemessene Bioaktivität wurde drei Tage nach Beendigung der Behandlung im Kot aller Schweine in den Gruppen mit eingekapseltem Nisin und Nisinpulver bestätigt. Allerdings waren die Zonengrößen kleiner als die, die an den Nisin-Behandlungstagen beobachtet wurden (Abb. 1b, c). Intaktes und aktives Nisin wurde in keiner der Basisproben (BL), in der Einkapselungsgruppe (Encap) oder in der Kontrollgruppe ohne Behandlung (Ctl) oder in einer der zehn Tage nach Beendigung der Behandlung entnommenen Proben (10 Tage PT) nachgewiesen. .

Zur Bestimmung der SCFA-Konzentration wurden zu Beginn (BL), nach vier aufeinanderfolgenden Behandlungstagen (T72) und zehn Tage nach Beendigung der Behandlung (10 Tage PT) entnommene Stuhlproben analysiert. Mit einer gezielten Methode wurden die Proben auf 10 verschiedene Verbindungen (Acetat, Ameisensäure, Propionsäure, Butyrat, Isobuttersäure, Isovaleriansäure, Valeriansäure, 4-Methylpentansäure, Hexansäure und Heptansäure) analysiert. 4-Methylpentansäure wurde nur in fünf Proben gefunden, und zwar in allen Fällen in Konzentrationen sehr nahe an der Nachweisgrenze. Hexansäure und Heptansäure wurden von der weiteren Analyse ausgeschlossen, da die Konzentrationen in den Basisproben (BL) bei 50 % oder mehr der Proben unter der Nachweisgrenze lagen. Daher wurden sechs Verbindungen in die statistische Analyse einbezogen: Butyrat, Acetat, Isovaleriansäure, Isobuttersäure, Valeriansäure und Propionsäure (Ergänzungstabelle 2). Um Unterschiede im Zusammenhang mit der Behandlung der Probanden zu testen, wurde ein Wilcoxon-Rank-Sum-Test durchgeführt, bei dem Kontrollgruppen (Ctl und Encap zusammen gruppiert) und Behandlungsgruppen (nis-en und nis-pdr zusammen gruppiert) zu verschiedenen Zeitpunkten verglichen wurden. Die Ergebnisse zeigten eine signifikante Abnahme des Gehalts an Acetat (p = 0,004, Differenz von 40,13 %), Butyrat (p = 0,0012, Differenz von 66,15 %), Isobuttersäure (p = 0,03, Differenz von 36,47 %) und Isovaleriansäure (p). = 0,035, Unterschied von 36,36 %) in der mit Nisin behandelten Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe bei T72 (Abb. 1d). Es wurden keine weiteren signifikanten Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen beobachtet. Zehn Tage nach Beendigung der Behandlung bleibt lediglich der Butyratspiegel deutlich niedriger (p = 0,048). Die größte Variation der SCFA-Werte zwischen den Proben wurde 10 Tage nach der Behandlung beobachtet.

Das Futterverwertungsverhältnis (FCR) ist ein gängiger Index zur Messung der Futtereffizienz bei Schweinen. Die durchschnittliche tägliche Gewichtszunahme und die durchschnittliche tägliche Futteraufnahme stiegen während des Versuchszeitraums an. Es gab keinen Unterschied im Lebendgewicht der Schweine zwischen den Behandlungsgruppen (ergänzende Abbildung S1a). Dies war angesichts der kurzen Dauer der Studie nicht unerwartet. Die Wachstumsleistung der Schweine ist in der ergänzenden Abbildung S1b dargestellt.

Wir haben die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft der verschiedenen Behandlungsgruppen zu drei verschiedenen Zeitpunkten (BL, T72, 10 Tage PT) mithilfe von Shotgun-Metagenomik und 16S-rRNA-Profiling bewertet. Firmicutes war in allen Behandlungsgruppen in den Basisproben der am häufigsten vorkommende Stamm (hauptsächlich Bacillus, Clostridium-Arten, Erysipelotrichia und Negativicutes), gefolgt von Bacteroidetes, wohingegen Actinobacteria und Proteobacteria weniger häufig vorkamen (Abb. 2a, b). Während der gesamten Studie wurden Veränderungen in der Mikrobiota-Zusammensetzung zwischen den Behandlungsgruppen beobachtet. Nach drei aufeinanderfolgenden Behandlungstagen (T72) gab es signifikante Unterschiede in der Gesamtzusammensetzung der Gemeinschaft zwischen unbehandelten und behandelten Gruppen (p < 0,001, PERMANOVA). Insbesondere kam es in den mit Nisin behandelten Gruppen zu einer Umgestaltung der Zusammensetzung der Firmicutes-Familie, mit einem Anstieg der Negativicutes und einem Rückgang der Bacillus-Arten. Es wurde auch ein Anstieg der Proteobakterien (hauptsächlich Gammaproteobakterien) in den mit Nisin behandelten Gruppen beobachtet, wobei die Nis-pdr-Gruppe den größten Anstieg aufwies (360 % im Vergleich zu BL). Diese beobachtete Veränderung in den mit Nisin behandelten Gruppen kehrte zehn Tage nach Beendigung der Behandlungen zu einer Zusammensetzung zurück, die den Ausgangswerten ähnelte. Die Mikrobiota-Zusammensetzung in der Kontroll- und der Einkapselungsgruppe blieb über den Versuchszeitraum hinweg relativ stabil, mit einem bemerkenswerten kontinuierlichen Anstieg der Actinobakterien im Laufe der Zeit sowie geringfügigen Veränderungen bei den Firmicutes (Zunahme der Bacillus-Arten bei gleichzeitiger Abnahme der Clostridium-Arten) bei T72 in der Verkapselungsgruppe. Insgesamt beobachteten wir die gleichen Ergebnisse mit der 16S-rRNA (ergänzende Abbildung S2).

Die Zusammensetzung der Mikrobiomgemeinschaft und die Beta-Diversität unterscheiden sich bei der Nisin-Behandlung bei T72 deutlich, während dies bei der Alpha-Diversität nicht der Fall ist. (a) Sankey-Diagramm, das die relative Häufigkeit des Mikrobioms in den verschiedenen Kontroll- und Nisin-Behandlungsgruppen auf Klassenebene zeigt. Die roten Pfeile und die gepunktete Linie entsprechen der höchsten Nisin-Dosis in den Proben. (b) Sankey-Diagramm, das die relative Häufigkeit des Mikrobioms in den verschiedenen Kontrollgruppen im Vergleich zu Nisin-Behandlungsgruppen auf Stammebene zeigt. Die roten Pfeile und die gepunktete Linie entsprechen der höchsten Nisin-Dosis in den Proben. (c) Alpha-Diversität, gemessen anhand des Shannon-Index, die sich bei T72 signifikant zwischen den Gruppen ändert (Wilcoxon-Rangsummentest, *p < 0,05, **p < 0,01). Der graue und der rosa Bereich bezeichnen die Kontrollgruppen (Encap und Ctl) bzw. Nisin-Behandlungsgruppen (Nis-en und Nis-pdr). (d) Alpha-Diversität, gemessen anhand des Shannon-Index, dargestellt in jeder Gruppe. Es wurden keine signifikanten Unterschiede beobachtet. (e) PCoA-Ordination (Bray-Curtis-Abstand), die zeigt, dass Proben von Nis-en und Nis-pdr bei T72 größtenteils gruppiert sind (blaue bzw. rosa Ellipsen). Ellipsen stellen ein 95 %-KI um den Clusterschwerpunkt für jede Untersuchungsgebietsgruppe bei T72 dar. (f) PCoA-Ordination (Unifrac-Abstand), die zeigt, dass Proben von Nis-en und Nis-pdr bei T72 größtenteils gruppiert sind (blaue bzw. rosa Ellipsen). Ellipsen stellen ein 95 %-KI um den Clusterschwerpunkt für jede Untersuchungsgebietsgruppe bei T72 dar.

Die anhand des Shannon-Index gemessene Alpha-Diversität zeigt, dass es zu Studienbeginn keine signifikanten Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen gibt (Abb. 2c). Am Ende des Behandlungszeitraums (T72) gibt es signifikante Unterschiede zwischen den mit Nisin behandelten Gruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe ohne Behandlung (Wilcoxon-Rangsummentest, p < 0,05 und p < 0,01 für die Nis-en- bzw. Nis-pdr-Gruppe). ). Dieser Unterschied wurde jedoch nicht innerhalb jeder Gruppe beobachtet, wenn T72 mit dem Ausgangswert und der 10-Tage-PT verglichen wurde, was darauf hindeutet, dass die Nisin-Behandlung keinen signifikanten Einfluss auf die Alpha-Diversität hatte (Abb. 2d). Nach drei aufeinanderfolgenden Behandlungstagen wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen der Kontroll- und der Kapselungsgruppe beobachtet.

Um die Diversitätsunterschiede der Behandlungsgruppen und Zeitpunkte weiter zu untersuchen, wurde die Beta-Diversität basierend auf den Distanzen Bray-Curtis (Abb. 2e) und Unifrac (Abb. 2f) bewertet. Die Basisstichproben aller Behandlungsgruppen zusammengefasst. Nach drei aufeinanderfolgenden Tagen (T72) der Fütterung der Behandlungen kam es zu einer Verschiebung der Diversität in den mit Nisin behandelten Gruppen im Vergleich zu den nicht mit Nisin behandelten Gruppen (BH-Adj. p < 0,01, PERMANOVA der Bray-Curtis- und Unifrac-Abstände). Zehn Tage nach Beendigung der Fütterung der Behandlungen war die Beta-Diversität in den mit Nisin behandelten Gruppen wieder mit der der nicht mit Nisin behandelten Gruppen vergleichbar.

Um herauszufinden, welche Arten sich in der mit Nisinpulver behandelten Gruppe nach drei aufeinanderfolgenden Tagen relativ zueinander am stärksten veränderten, wurde eine Differenzialhäufigkeitsanalyse unter Verwendung der Differential-Ranking-Methode (DR) basierend auf relativen Häufigkeiten durchgeführt. Differential Ranking formuliert die unterschiedliche Häufigkeit auf Artenebene als multinomiale Regression basierend auf der logarithmischen Faltungsänderung um. Arten mit hohen Koeffizienten (Abb. 3a) (positiv (blau) oder negativ (rot); Referenz zum Vergleich sind Nisin-Behandlungsgruppen bei T72) waren während des Behandlungszeitraums bei T72 am besten in der Lage, Arten in der Nisin-Behandlungsgruppe zu unterscheiden.

Grampositive Bakterien werden während der Nisin-Behandlung deutlich reduziert, während gramnegative Bakterien deutlich zunehmen. (a) Modellkoeffizienten der mit Songbird durchgeführten multinomialen Regressionsanalyse (Modell: Art ~ Nisin-Behandlung x Tage), geordnet nach nis-pdr bei T72. Arten mit hohen Koeffizienten (positiv und häufiger in nis-pdr T72, blau, oder negativ und weniger häufig in nis-pdr T72, rot; rosa, grampositiv, violett, gramnegativ) waren am besten in der Lage, nis-pdr zu unterscheiden Gruppe während der Behandlung bei T72. (b) Gemeinschaftszusammensetzung auf individueller Ebene der Top-10-Arten mit positiven Koeffizienten (Grau, Kontrollgruppen, Rosa, Nisin-Behandlung). (c) Gemeinschaftszusammensetzung auf individueller Ebene der Top-10-Arten mit negativen Koeffizienten (Grau, Kontrollgruppen, Rosa, Nisin-Behandlung). (d) Boxplot, das die relative Häufigkeit der Arten zeigt, die nur während nis-pdr T72 im Vergleich sowohl zur nis-pdr-Basislinie als auch zum nis-pdr 10d PT signifikant zurückgegangen sind (Wilcoxon-Rangsummentest, *p < 0,05, **p < 0,01). , ***p < 0,001). Alle sind grampositiv (lila), mit Ausnahme von Prevotella sp CAG 520 (rosa).

Von den 20 Bakterienarten, die in den Nisin-Behandlungsgruppen bei T72 unterschiedlich verringert waren, waren 16 grampositiv (Abb. 3a, c). Insbesondere Anaerostipes hadrus, Bifidobacterium pseudocatenulatum und Dorea longicatena waren während der Nisin-Behandlung bei allen Schweinen nicht nachweisbar und reagierten daher am stärksten auf Nisin. Die gramnegativen Bakterien, die in der Behandlungsgruppe bei T72 signifikant zurückgingen, stammten alle aus der Gattung Prevotella. Andere grampositive Arten wie Catenibacterium mitsuokai, Collinsella aerofaciens, Lactobacillus johnsonii und Lactobacillus reuteri waren in Nis-pdr bei T72 signifikanter oder nur vermindert (Abb. 3c, d). Trotz erheblicher Unterschiede auf individueller Ebene erklärte die Nis-pdr-Behandlung die Variabilität zwischen den Proben. Ein Fokus auf Nis-pdr ergab, dass die Arten, die bei T72 signifikant zurückgegangen waren, nach zehn Tagen alle auf das Niveau vor der Behandlung zurückkehrten (Abb. 3d).

Von den zwanzig Bakterienarten, die in den Nisin-Behandlungsgruppen bei T72 unterschiedlich vermehrt waren, waren 17 Gram-negativ (Abb. 3a, b). Arten wie Acidaminococcus fermentans¸ Esherichia coli, Phascolarctobacterium succinatutens und Prevotella copri waren bei fast allen mit Nisin behandelten Personen bei T72 unterschiedlich erhöht. Die einzigen grampositiven Arten, die bei mit Nisin behandelten Personen bei T72 unterschiedlich häufig vorkamen, waren Dorea formicigenerans, Eubacterium callanderian und Ruminococcus sp. CAG 624.

Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass grampositive Bakterien in den mit Nisin behandelten Gruppen unterrepräsentiert waren, während gramnegative Bakterien überrepräsentiert waren, insbesondere in der Nis-pdr-Gruppe an den Tagen, an denen Nisin verabreicht wurde. Nach Beendigung der Behandlung kehrten diese mikrobiellen Gemeinschaften in der mit Nisin behandelten Gruppe jedoch auf Werte zurück, die den Werten vor der Behandlung ähnelten, die 10 Tage nach der Behandlungsdauer beobachtet wurden.

Das Funktionsprofil der mikrobiellen Gemeinschaft wurde mithilfe der Shotgun-Metagenomik bewertet. Die Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) der Genzahlen (Anzahl pro Million) ergab, dass sich das mikrobielle Funktionsprofil in mit Nisin behandelten Gruppen bei T72 signifikant von den anderen Gruppen unterschied (PERMANOVA, BH adj. p < 0,01) (Abb. 4a). Darüber hinaus zeigten die mit Nisin behandelten Gruppen während des Behandlungszeitraums bei T72 ein unterschiedliches Stoffwechselwegprofil für die meisten in den Metagenomikdaten gefundenen Stoffwechselwege (MetaCYC-Pfade, Wilcoxon-Rank-Sum-Test, p <0,01) (Abb. 4b). Wege wie die Aminosäure-Biosynthese und die Nukleotid-Biosynthese veränderten sich zwischen den Behandlungsgruppen und Zeitpunkten nicht. Diese Wege werden von allen Bakterien genutzt, und wir gehen davon aus, dass Änderungen in der Bakterienzusammensetzung sie nicht beeinflussen. Im Gegenteil, die relative Häufigkeit von Stoffwechselwegen wie Vitaminbiosynthese, Lipidbiosynthese, Schwefelstoffwechsel, Fettsäure- und Lipidabbau und Abbau aromatischer Verbindungen nahm in den mit Nisin behandelten Gruppen bei T72 zu, während der Atmungsweg abnahm ( p < 0,01 basierend auf dem Wilcoxon-Rangsummentest der log2-fachen Änderung mit BL als Referenz). Einige Wege, wie zum Beispiel der Zellstruktur-Biosyntheseweg, werden aufgrund seiner Wirkung auf Zellmembranen wahrscheinlich direkt von Nisin beeinflusst. Dieser Unterschied in der Signalweghäufigkeit spiegelt auch die Veränderung der Bakterienzusammensetzung nach der Nisin-Behandlung wider. Um dies weiter zu untersuchen, haben wir mit dem zuvor beschriebenen Tool Songbird (Abb. 4c) die unterschiedlichsten Stoffwechselwege auf einer niedrigeren Hierarchie, geschichtet nach Arten, untersucht. Mit Nisin behandelte Gruppen zeigten ähnliche unterschiedliche Häufigkeitsprofile sowohl zu Studienbeginn als auch zum 10-Tage-PT. Pfade, die bei T72 stärker mit Nisin-behandelten Gruppen assoziiert sind (in Blau in Abb. 4c), gehören zu gramnegativen Bakterien, von denen zuvor festgestellt wurde, dass sie in diesen Gruppen zu diesen Zeitpunkten häufiger vorkommen (d. h. Escherichia coli und Mitsuokella jalaludinii). In ähnlicher Weise gehören Signalwege, die bei Studienbeginn und 10 Tagen PT stärker mit Nisin-behandelten Gruppen assoziiert waren (und daher bei T72 größtenteils nicht vorhanden waren), zu grampositiven Bakterien, die zuvor in diesen Gruppen und zu diesen Zeitpunkten als häufiger vorkommend identifiziert wurden (d. h. Lactobacillus johnsonii und Roseburia). sp CAG 471), mit Ausnahme von Butyricoccus porcorum, der bisher nicht identifiziert wurde. Bemerkenswert ist, dass zwei Wege (L-Arginin-Biosynthese und Galactose-Abbau) beide mit Nisin-behandelten Gruppen bei T72 und mit Nisin-behandelten Gruppen zu Studienbeginn und 10 Tagen PT assoziiert waren, aber von unterschiedlichen Bakterien übertragen werden, was wahrscheinlich auf den Ersatz grampositiver Arten durch zurückzuführen ist Gramnegative Arten, die zumindest teilweise ähnliche Funktionen erfüllen. Einige Funktionen scheinen jedoch bei T72 nur für die mit Nisin behandelten Gruppen zu gelten. Beispielsweise war der Weg, der bei T72 am stärksten mit Nisin-behandelten Gruppen assoziiert war, die Enterobactin-Biosynthese, ein Siderophor, das hauptsächlich in gramnegativen Bakterien vorkommt.

Funktionsanalyse der Kontroll- und Behandlungsgruppen. (a) PCoA-Ordination (Bray-Curtis-Abstand) der HUMAnN-Genzahlen (Anzahl pro Million) für Nis-en und Nis-pdr bei T72 im Vergleich zu den anderen Gruppen. (b) Heatmap, die die funktionelle Zusammensetzung (log(HUMAnN-Anzahl pro Million)) auf der höchsten Ebene der MetaCyc-Signalweghierarchie der verschiedenen Gruppen zu den verschiedenen Zeitpunkten zeigt (grauer Bereich, Kontrollgruppen, rosa Bereich, Behandlungsgruppen; die roten Pfeile entsprechen bis zur höchsten Nisin-Dosis in den Proben). Die Pfade sind mithilfe der euklidischen Distanz hierarchisch gruppiert. (c) Heatmap, die die 30 am häufigsten vorkommenden HUManN-Pfade gemäß ihren Songbird-Scores (Modell: Pfade ~ Nisin-Behandlung x Tage) für die Gruppen Nisin (Nis-en und Nis-pdr) bei Baseline im Vergleich zu T72 (links) und 10d zeigt PT versus T72 (rechts). Diese Pfade sind nach Arten geschichtet (siehe rechte Leiste). Wir zeigen hier die 15 positivsten (d. h. stärker mit Nisin bei Baseline (links) oder 10-Tage-PT (rechts) assoziiert) und die 15 negativsten Signalwege (d. h. bei T72 stärker mit Nisin assoziiert). (d) Häufigkeit (HUMAnN-Anzahl pro Million) der an der SCFA-Produktion beteiligten Pfade in den verschiedenen Gruppen zu verschiedenen Zeitpunkten und ihre Unterschiede (Wilcoxon-Rank-Sum-Test, *****p < 0,0001, ***p < 0,001, **p < 0,01, *p < 0,05, ns: nicht signifikant). (e) Log2-fache Veränderungen der Top-20-Arten mit der höchsten und niedrigsten Genhäufigkeit, log2-fache Veränderungen in mit Nisin behandelten Gruppen im Vergleich zu ihrer jeweiligen Grundlinie.

Anschließend untersuchten wir die Repräsentation der an der SCFA-Produktion beteiligten Gene in den verschiedenen Gruppen zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Es gab eine signifikante Abnahme der Häufigkeit von Genen, die an der Produktion von Butyrat beteiligt sind, in der Gruppe mit eingekapseltem Nisin und der mit Nisinpulver behandelten Gruppe zwischen der Grundlinie und T72 (Wilcoxon-Rangsummentest, p < 0,0001 bzw. p < 0,01) (Abb. 4d). ). Bei 10 Tagen PT gab es einen signifikanten Anstieg in der Repräsentation dieser Gene (Wilcoxon-Rank-Sum-Test, p < 0,05). In ähnlicher Weise wurde dieses Muster in den Genen beobachtet, die mit der Acetatproduktion verbunden sind. Es wurde ein signifikanter Anstieg der an der Propionatproduktion beteiligten Gene zwischen der Grundlinie und T72 in Nis-en beobachtet. Nach Beendigung der Behandlung kehrten diese Werte auf die Ausgangswerte zurück. Wir untersuchten auch die Häufigkeit der an der SCFA-Produktion beteiligten Gene, geschichtet nach den sie tragenden Arten (Abb. 4e). Die Top-10-Arten mit der höchsten und niedrigsten log2-fachen Änderung der Genhäufigkeit bei der Nisin-Behandlung im Zusammenhang mit BL zeigten, dass sich die für die SCFA-Produktion verantwortlichen Arten während der Nisin-Behandlung von überwiegend grampositiv zu überwiegend gramnegativ für Acetat und Butyrat veränderten. Insbesondere Firmicutes werden durch gramnegative Bakterien wie E. coli für Acetat oder Prevotella sp. ersetzt. für Butyrat. Überraschenderweise wurde für Propionat das Gegenteil beobachtet, mit einem Anstieg der Genhäufigkeit, die von grampositiven Arten während der Nisin-Behandlung getragen wurde, nämlich Ruminococcus sp. Dies könnte mit der zuvor gezeigten Zunahme einiger Ruminoccocus-Arten während der Nisin-Behandlung zusammenhängen (Abb. 4a). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse eine funktionell veränderte Gemeinschaftsstruktur während der Nisin-Behandlung, hauptsächlich aufgrund des Ersatzes grampositiver Bakterien durch gramnegative Bakterien , die nach Beendigung der Behandlung wiederhergestellt wird.

Wir zeigen, dass Nisin, das in einer Konzentration deutlich unter dem No-Observed-Adverse-Effect-Level (NOAEL)17 verwendet wurde, während der Darmpassage intakt blieb und die Mikrobiota des Schweinedarms erfolgreich veränderte, wodurch die relative Häufigkeit vieler grampositiver Mikroorganismen verringert wurde. Wir gehen davon aus, dass die in Lantibiotika wie Nisin vorhandenen posttranslationalen Modifikationen diese Bakteriozine in der Darmumgebung schützen. Im Gegensatz dazu werden ohne diese Modifikationen synthetisierte Prä-Nisin-Peptide leicht durch Trypsin und Chymotrypsin verdaut (ergänzende Abbildung S4). Die Ergebnisse unserer Studie stellen ein wichtiges Dogma in der Bakteriozin-Forschung in Frage – dass Bakteriozine im Darm durch Proteasen abgebaut werden, wodurch sie inaktiv werden und daher für die orale Verabreichung ungeeignet sind, sofern sie nicht eingekapselt sind. Im Gegenteil: Wir zeigen, dass Nisin die Magenpassage in ausreichenden Mengen überleben kann, um das Darmmikrobiom zu verändern, wenn es von einem großen Tier aufgenommen wird, und unterstreichen das Potenzial, Lantibiotika als Instrument zur Veränderung des Darmmikrobioms einzusetzen.

Die Zusammensetzung der Darmmikrobiota wurde in den mit Nisin behandelten Gruppen während der Behandlung beeinflusst, kehrte jedoch bereits drei Tage nach Beendigung der Behandlung auf ein ähnliches Niveau wie in den unbehandelten Gruppen zurück, während die Diversität nicht wesentlich beeinträchtigt wurde. Wir haben außerdem festgestellt, dass Nisinpulver wirksamer war als eingekapseltes Nisin. Die Behandlung mit Nisin führte während der Behandlung zu einer Verarmung grampositiver Bakterien wie Lactobacillus und einem Anstieg der relativen Häufigkeit gramnegativer Bakterien wie Escherichia coli. Die Nisin-Behandlung hat eine selektive Wirkung auf grampositive Bakterien, und diese Bakterien werden möglicherweise durch gramnegative Arten ersetzt. Interessanterweise reagieren einige gramnegative Bakterien, insbesondere Prevotella, empfindlich auf die Behandlung mit Nisin, wie bereits zuvor mit Nisin Z18 gezeigt wurde, während einige grampositive Bakterien, beispielsweise Ruminococcus, offenbar immun gegen Nisin sind. Darüber hinaus wurden sowohl in der Kontrollgruppe mit Einkapselungsmittel als auch in der Gruppe mit eingekapseltem Nisin im Vergleich zur Kontrollgruppe und der Gruppe mit Nisinpulver hohe Mengen an Catenibacterium gefunden. Dies deutet darauf hin, dass das Catenibacterium möglicherweise das Zellulose-Verkapselungsmaterial abbaut und es als Energiequelle nutzt.

Wir beobachteten auch Veränderungen auf funktioneller Ebene in mit Nisin behandelten Gruppen während der Nisin-Behandlung, wobei die am unterschiedlichsten erhöhten Signalwege alle mit gramnegativen Bakterien und die am unterschiedlichsten verringerten Signalwege mit grampositiven Bakterien in Zusammenhang standen, was die Veränderungen in der taxonomischen Zusammensetzung widerspiegelt. Einige Signalwege grampositiver Arten (z. B. Roseburia) wurden durch dieselben Signalwege wie bei gramnegativen Arten (z. B. E. coli) ersetzt, was auf einen möglichen Ersatz ökologischer Nischen hinweist. Allerdings nahmen auch andere Signalwege zu, die nur bei Gram-negativen Bakterien vorkommen (z. B. Enterobactin in Verbindung mit E. coli), was zeigt, dass der Ersatz von Gram-positiven durch Gram-negative Bakterien nicht völlig funktionell gleichwertig war, was auch in der höheren Reihenfolge zu sehen ist Hierarchiepfade, die sich fast alle von BL unterschieden (Abb. 4b). Darüber hinaus beobachteten wir die Zunahme von Signalwegen, die möglicherweise mit der Anpassung grampositiver und gramnegativer Bakterien an Nisin-induzierten Stress zusammenhängen. Beispielsweise beobachteten wir eine Zunahme der mit Vitaminen verbundenen Signalwege (insbesondere Menachinon, siehe ergänzende Abbildung S3). Bei vielen Bakterien kann die Synthese von Menachinon, lipidlöslichen Molekülen, die sich in die bakterielle Zellmembran einfügen, durch den Zustand der Zellmembran beeinflusst werden19, was Aufschluss über die Auswirkungen gibt, die Nisin abhängig von seinem Wirkungsmechanismus auf die Mikrobiota haben kann Dazu gehört die Bindung an Lipid II.

Wir beobachteten bei T72 eine allgemeine Abnahme der SCFA-Spiegel in den mit Nisin behandelten Gruppen. Diese erholten sich zehn Tage nach Beendigung der Behandlung in den mit Nisin behandelten Gruppen, kehrten jedoch auf Werte zurück, die niedriger waren als in der Gruppe, der das Einkapselungsmaterial verabreicht wurde, oder in der Kontrollgruppe ohne Behandlung. Lactobacillus und Catenibacterium verstoffwechseln nachweislich Kohlenhydrate, darunter Oligosaccharide und Stärke, die im Dickdarm zu SCFAs fermentiert werden und dann von den Schweinen verwertet werden können20,21,22,23. Ihr Rückgang erklärt wahrscheinlich zumindest teilweise den Rückgang des SCFA. Dies ist insbesondere bei der Abnahme von Catenibacterium für Acetat der Fall, die durch gramnegative Spezies wie E. coli nicht vollständig kompensiert wird (Abb. 4e). Bei Butyrat werden grampositive Firmicutes durch Oscillibacter und Prevotella ersetzt. Da jedoch andere grampositive Bakterien weiterhin eine wichtige Rolle bei der Butyratproduktion spielen, während ihre relative Häufigkeit abnimmt, nimmt die Gesamtkonzentration von Butyrat ab. Interessanterweise scheinen bei Propionat gramnegative Bakterien durch die grampositiven Bakterien Ruminococcus ersetzt zu werden, die gegen Nisin resistent zu sein scheinen. Durch die Beeinflussung der luminalen SCFAs kann die Darmmikrobiota die intestinale Inkretinausscheidung modulieren und somit einen weiteren Einfluss auf die Glukoseregulation ausüben24,25,26.

Diese Studie unterstreicht das Potenzial von Nisin, das Mikrobiom bei oraler Einnahme zu modulieren. Der vorübergehende Effekt auf das Mikrobiom bestand darin, die Gram-positiven und -negativen Verhältnisse umzugestalten und dadurch die SCFA-Produktion zu reduzieren. Obwohl das in dieser Studie verwendete Nisin A ein breites Spektrum aufweist, konnten wir die Spezifität des Lantibiotikums mithilfe von Peptid-Engineering-Ansätzen ändern.27,28 Darüber hinaus eröffnet die schnell wachsende Zahl posttranslational modifizierter Bakteriozine vom Typ I mit unterschiedlichen Spezifitäten Möglichkeiten um sie für Mikrobiom-Bearbeitungsanwendungen zu verwenden (ergänzende Abbildung S4). Da Nisin außerdem eine Reihe unerwünschter Bakterien abtötet, darunter pathogene Streptokokken und Clostridien, könnte es in einigen Fällen als Alternative zu Antibiotika eingesetzt werden. Ein zusätzlicher Vorteil von Nisin, wie in dieser Studie hervorgehoben, ist die Fähigkeit der Mikrobiota, zu ihrer Zusammensetzung vor der Behandlung zurückzukehren, verglichen mit der länger anhaltenden Wirkung einiger Antibiotika-Behandlungen, die bis zu zwei Jahre nach der Behandlung anhalten kann29.

Es gab vier diätetische Behandlungsgruppen wie folgt: (i) eine standardmäßige nicht-medikamentöse Link-Diät (Kontrollgruppe; Ctl); (ii) die Link-Diät, ergänzt mit 150 mg/kg Körpergewicht Nisin-Pulver (Nis-pdr) (Handary, Brüssel, Belgien; hoher Gehalt an Nisin-ZP-Pulver (95 % Gehalt/ultrarein; % Gewicht/Gewicht; Wasserstärke ≥ 38.000). IE/mg)); (iii) die Link-Diät, ergänzt mit 850 mg/kg Körpergewicht eingekapseltem Nisin ZP (Nis-en) (Sublimity Therapeutics, Dublin, Irland); und (iv) die Link-Diät, ergänzt mit 110 mg/kg Körpergewicht des Einkapselungsmaterials (Encap). Das Einkapselungsmaterial war Ethylcellulose (98 %) (DOW Chemical Company Limited, Staines, England; geschenkt von Sublimity Therapeutics). Die im eingekapselten Nisin verabreichte Nisin-Dosis (Behandlung 3) entsprach der der mit Nisin-Pulver behandelten Gruppe (Behandlung 2). Die in Behandlung 4 verabreichte Menge an Verkapselungsmittel entsprach der Menge in der verkapselten Nisin-Formulierung in Behandlung 3. Behandlungen in Pulverform wurden morgens mit einer kleinen Futtermenge mit 5–10 ml Wasser überzogen, um sicherzustellen, dass alle Behandlungen wurden jeden Tag eingenommen.

Diese Studie wurde in der Schweineentwicklungsabteilung, Teagasc, Moorepark, Fermoy, Cork, Irland, durchgeführt. Eine schematische Darstellung der Versuchsstruktur ist in Abb. 1 dargestellt. Ferkel (Large White X Landrace) wurden nach 28 (± 3) Tagen entwöhnt, in Gruppen intakter Würfe untergebracht und 6 Tage lang mit einem Starterfutter gefüttert, wobei jedes Schweineohr markiert war mit einer eindeutigen Nummer zur Identifizierung. Aus dieser Gruppe von 150 Schweinen wurden 40 Männchen ausgewählt und hinsichtlich Körpergewicht und Wurfherkunft blockiert und dann nach dem Zufallsprinzip einer der vier oben aufgeführten Futterbehandlungen zugeordnet (N = 10 Schweine/Behandlung). Die Schweine wurden einzeln in Vollspaltenställen (1,2 m × 0,9 m) gehalten und jeweils für eine siebentägige Eingewöhnungsphase mit einer nicht medikamentösen Link-Diät versorgt. Die Raumtemperatur wurde in der ersten Woche nach dem Absetzen bei 28–30 °C gehalten und dann jede Woche um 2 °C gesenkt, bis eine Raumtemperatur von 22 °C erreicht wurde. Futter und Wasser wurden nach Belieben bereitgestellt, die Beleuchtung wurde für ≥ 8 Stunden pro Tag sichergestellt und es wurde für eine Bereicherung der Umwelt gesorgt. Nach der siebentägigen Eingewöhnungsphase wurde mit der diätetischen Behandlung begonnen. Die diätetische Behandlung erfolgte vier Tage lang, anschließend erhielten die Schweine zehn Tage lang bis zum Ende des Versuchs erneut die übliche, medikamentenfreie Link-Diät. Die Näherungsanalyse und die Aminosäurezusammensetzung der verwendeten Futtermittel sind in der Ergänzungstabelle 1 dargestellt. Alle Schweine wurden am Tag 0 (D0) (Abb. 1) vor Beginn des Versuchs (Grundlinie (BL)) einzeln gewogen. Die Wachstumsleistung wurde beurteilt, indem alle Schweine noch zweimal gewogen wurden (i) in der Mitte des Versuchs (Tag 6; zwei Tage nach Beendigung der Behandlung) und (ii) am Ende des Versuchs (Tag 14; zehn Tage nach der Behandlung). hatte aufgehört). Die freiwillige Futteraufnahme wurde zwischen Beginn und Ende des Versuchs täglich aufgezeichnet und daraus dividiert durch die durchschnittliche tägliche Zunahme zur Berechnung des Futterverwertungsverhältnisses (FCR) verwendet.

Vor Beginn der Behandlung wurden Stuhlproben entnommen, um die Grundmikrobiota (D0; BL) zu bestimmen. Weitere Stuhlproben wurden 24 Stunden nach der Erstbehandlung (T24), 48 Stunden nach der Erstbehandlung (T48) und 72 Stunden nach der Erstbehandlung (T72) entnommen. Diese Proben wurden entnommen, um die unmittelbaren Auswirkungen der Behandlung auf die Darmmikrobiota von Schweinen zu beurteilen. Gegen Ende des Versuchs wurden auch Stuhlproben entnommen, drei Tage nach Beendigung der Behandlung (3. PT) und zehn Tage nach Beendigung der Behandlung (10. PT). Diese Proben wurden entnommen, um die Erholung der Darmmikrobiota nach Beendigung der Behandlung zu beobachten. Aus diesen Proben wurde auch das Schicksal des aufgenommenen Nisins ermittelt. Sofern verfügbar, wurden Stuhlproben frisch entleert entnommen; andernfalls wurden sie nach rektaler Stimulation gesammelt. Die Proben wurden in sterilen Gefäßen gesammelt, kurz (< 2 Stunden) auf Eis gelagert und anschließend in sterile 2-ml-Eppendorf-Röhrchen unterteilt. Die Proben wurden dann sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80 °C für die DNA-Extraktion und SCFA-Analyse oder bei –20 °C für das Screening auf das Vorhandensein und die Aktivität von Nisin (für Well Diffusion Assays (WDAs) und die MALDI-TOF-Masse) gelagert Spektrometrie (MALDI TOF MS)).

DNA wurde aus 200 mg Kot jedes Schweins bei BL, T24, T48, T72, 3d PT und 10d PT unter Verwendung des Zymo Research ZR Kot-DNA-Kits (Cambridge Biosciences, Cambridge, Vereinigtes Königreich) gemäß den Angaben des Herstellers extrahiert.

DNA wurde aus den Stuhlproben extrahiert, die bei BL, T24, T48, T72, 3d PT und 10d PT entnommen wurden. 16S-rRNA-Genamplikons (V3–V4-Region) wurden mithilfe der Illumina MiSeq™-Plattform generiert und sequenziert. Die variable V3-V4-Region des 16S-rRNA-Gens wurde aus 240 fäkalen DNA-Proben unter Verwendung des Protokolls der 16S-Metagenom-Sequenzierungsbibliothek (Illumina San Diego, CA) amplifiziert. Die Proben wurden quantifiziert und Bibliotheken für die Sequenzierung vorbereitet, wie zuvor beschrieben35. Kurz gesagt, die 16S-rRNA-Amplikon-Sequenzierungsbibliotheken wurden wie folgt vorbereitet: Zwei PCR-Reaktionen wurden an der Matrizen-DNA durchgeführt. Die DNA wurde zunächst mit Primern amplifiziert, die spezifisch für die V3–V4-Region des 16S-rRNA-Gens sind und auch den Illumina-Überhangadapter enthalten (Vorwärtsprimer 5'TCGT CGGC AGCG TCAG ATGT GTATAAGA GACA GCCT ACGG GNGG CWGCAG; Rückwärtsprimer 5'GTCT CGTG GGTCCGGA). GATG TGTA TAAG AGAC AGGA CTAC HVGG GTAT CTAATCC). Anschließend wurde eine zweite PCR-Reaktion mit zwei Indexierungsprimern (Illumina Nextera XT-Indexierungsprimern) durchgeführt, um das Demultiplexen zu ermöglichen. Die Proben wurden auf dem Illumina MiSeq im Teagasc Sequencing Centre, Moorepark, Fermoy, Co. Cork, Irland, unter Verwendung des Miseq 600 Cycle v2 Kits und nach Standard-Illumina-Sequenzierungsprotokollen analysiert. Nach der Sequenzierung wurden die Daten analysiert, um die Wirkung der Nisin-Behandlung auf die Zusammensetzung der Darmmikrobiota festzustellen. Die durchschnittliche Anzahl der OTUs pro Stichprobe betrug 123.814 +/− 34.649 mit einer Spanne zwischen 24.578 und 231.778.

Paired-End-Sequenzierungsbibliotheken wurden aus der extrahierten DNA von 120 Proben (BL, T72 und 10d PT) mit dem Illumina Nextera XT-Bibliotheksvorbereitungskit (Illumina) hergestellt, gefolgt von einer Sequenzierung auf der Illumina NextSeq 500-Plattform unter Verwendung von Hochleistungschemie (2 ×). 150 bp) gemäß den Anweisungen des Herstellers im Teagasc Sequencing Centre.

Nisin wurde wie folgt aus den Stuhlproben extrahiert: Die Proben wurden in 1 ml 70 % Isopropylalkohol mit 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) und (IPA) suspendiert, gründlich gevortext und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und 5 Minuten zentrifugiert min bei 16.000 g gewaschen und der Überstand zurückbehalten. Der Zentrifugationsschritt wurde noch dreimal wiederholt, wobei der Überstand jedes Mal zurückbehalten wurde. Die dem Nisin-Peak entsprechende Molekülmasse wurde mithilfe von MALDI TOF MS mit einem Axima TOF2 (Shimadzu Biotech, Kyoto, Japan) beobachtet, wie zuvor beschrieben25.

400 Milligramm gefrorenes Fäkalienmaterial wurden in ein steriles 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. 800 Mikroliter steriles Wasser wurden in das 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben. Die Probe wurde 30 Sekunden lang kräftig geschüttelt, um eine Fäkalienaufschlämmung zu erzeugen. Anschließend wurden die Proben 30 Minuten lang bei 4 °C und 12.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und in ein neues 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Dieser Schritt wurde wiederholt. Der Überstand wurde dann erneut 30 Minuten lang bei 4 °C und 12.000 g zentrifugiert. Dieser Überstand wurde in ein 0,2-µM-Costar-Spin-Zentrifugenröhrchen (Sigma-Aldrich, UK) überführt und durch 10-minütige Zentrifugation bei 12.000 g und 4 °C filtriert. Der Filter wurde aus dem Röhrchen entfernt und das Fäkalienwasser vor der metabolomischen Analyse bei –20 °C gelagert. Die Proben wurden von MS-Omics ApS, Frederiksberg, Dänemark, analysiert, um die Metabolitenspiegel, einschließlich SCFAs, zu bestimmen.

Die antibakterielle Aktivität in den Kotproben von Schweinen wurde mithilfe von Well Diffusion Assays (WDAs)30 in Agarplatten, die mit Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus LMG6901 beimpft waren, abgeschätzt, wie zuvor beschrieben31. Für die Tests wurde Fäkalienwasser verwendet, das wie oben zubereitet wurde. Die Proben wurden in 50-μL-Aliquots in die Vertiefungen des angeimpften Agars gegeben und die Agarplatten wurden über Nacht bei 37 °C anaerob inkubiert. Die antibakterielle Aktivität führte zu Hemmzonen um die Vertiefungen herum. Proben von Tieren, die kein Nisin konsumiert hatten, wurden als Negativkontrollen verwendet, um sicherzustellen, dass Hemmzonen auf Nisin-Hemmung zurückzuführen waren.

Paired-End-Lesevorgänge wurden mit PRINSEQ Version 0.20.432 gekürzt und qualitätsgefiltert. Die resultierenden Sequenzen hatten einen durchschnittlichen Qualitätsfaktor von mehr als 20. Vorwärts- und Rückwärts-Paired-End-Sequenzen wurden dann mit einer Mindestüberlappung von 10 bp unter Verwendung von fastq-join33 verbunden. Die Sequenzen wurden mithilfe des Closed-Reference-Algorithmus in USEARCH Version 7.034 in Operational Taxonomic Units (OTU) gruppiert und Chimären wurden mit der RDP Gold-Referenzdatenbank entfernt.

Die metagenomischen Shotgun-Sequenzierungsablesungen wurden qualifiziert und gekürzt, und die menschlichen Reads (menschliches hg19-Referenzgenom) wurden mit KneadData v0.10.0 mit den Standardoptionen gefiltert. Qualifizierte Sequenzierungsablesungen wurden dann von MetaPhlAn v3.0.135 und den anderen Optionen mit Standardeinstellungen taxonomisch auf Artenebene profiliert. MetaPhlAn ist auf einen Satz einzigartiger kladenspezifischer Markergene (~ 1,1 Millionen) angewiesen, die aus ~ 100.000 Referenzgenomen (~ 99.500 bakterielle und archaeale und ~ 500 eukaryotische Genomen) identifiziert wurden, um eine panmikrobielle Quantifizierung auf Artenebene zu ermöglichen, einschließlich Bakterien, Archaeen, mikrobielle Eukaryoten und Viren35,36. Funktionelle Anmerkungen einschließlich MetaCyc-Pfaden und Genfamilienhäufigkeiten wurden durch HUMAnN v3.0.035,37 erreicht. Genfamiliendateien wurden mit der Funktion „humann_regroup_table“ von HUMAnN zu „go_uniref90“ (Genontologie), „level4ec_uniref90“ (Enzymkommission), „ko_uniref90“ (KEGG-Orthologie) und HUMAnN-Pfaden (Anzahl pro Million) und HUMAnN-Genen (Anzahl pro) umgruppiert Millionen) Begriffe.

Die mit MetaPhlAn v3.0.1 erhaltene taxonomische Matrix wurde für die Analyse der Alpha-Diversität (Shannon-Index) und der Bray-Curtis-Beta-Diversität unter Verwendung des R-Pakets „PhyloSeq“ v1.34.038 verwendet. Für die Alpha-Diversität wurden paarweise Vergleiche zwischen den Gruppen mithilfe eines gepaarten Wilcoxon-Rangsummentests mit dem R-Paket „Stats“39 durchgeführt. Die Analyse der differenziellen Häufigkeit wurde mit Songbird v1.0.440 durchgeführt. Kurz gesagt handelt es sich bei Songbird um eine kompositionsbewusste Differentialhäufigkeitsmethode, die Rangfolgen von Merkmalen basierend auf ihrer logarithmischen Faltungsänderung in Bezug auf interessierende Kovariaten liefert. Es verwendet eine Differential-Ranking-Methode (DR), die die Differential-Häufigkeitsanalyse als multinomiales Regressionsproblem umformuliert. In diesem Fall haben wir die Formel und die Parameter „Songbird Multinomial –Formel „C (Gruppe, Behandlung (‘nis_T72‘))“ –Epochen 10.000 – Differentialpriorität 0,5 – Zusammenfassungsintervall 1 – Min. Probenanzahl 1“ verwendet „nis_T72“ entspricht den Gruppen Nis-en T72 und Nis-pdr T72.

Wir haben die 20 Metaphlan3-Arten mit dem höchsten und 20 niedrigsten Rang ausgewählt, die mit Nis-en und Nis-pdr bei T72 assoziiert sind, und das logarithmische Verhältnis dieser Taxa-Sätze berechnet. Durch den Vergleich der Taxa-Verhältnisse auf diese Weise werden Verzerrungen aufgrund der unbekannten gesamten mikrobiellen Belastung in jeder Probe gemildert. Durch die Logarithmierung dieses Verhältnisses werden die relativen Zunahmen und Abnahmen der Taxa gleich gewichtet. Die Auswertung des Songbird-Modells für Nis-en und Nis-pdr bei T72 im Vergleich zu einem Basismodell ergab einen Q2-Wert von 0,323.

Mit SCFAs assoziierte Gene wurden aus der go_uniref90gene-Tabelle extrahiert, sowohl stratifiziert nach Arten als auch unstratifiziert, normalisiert auf die Zahl pro Million (cpm). Die folgenden Gene wurden für die verschiedenen SCFAs verwendet: Acetatkinase (ackA) für Acetat, Butyratkinase (buk) und Butyryl-CoA: Acetat-CoA-Transferase (but) für Butyrat und Methylmalonyl-CoA-Decarboxylase (mmdA), Lactoyl-CoA-Dehydratase ( lcdA) und CoA-abhängige Propionaldehyddehydrogenase (pduP) für Propionat. Für jeden SCFA wurden Messwerte verschiedener Gene addiert, um den repräsentativen Wert zu erhalten, der in der Analyse verwendet wurde. Log2-fache Änderungen wurden für jede Gruppe im Zusammenhang mit BL berechnet. Mit Songbird wurde auch eine differenzielle Häufigkeitsanalyse der HUMAnN-Pfade (sowohl geschichtet als auch nicht geschichtet) durchgeführt. Wir haben die gleiche Formel und die gleichen Parameter wie für die zuvor beschriebene taxonomische Differentialhäufigkeitsanalyse verwendet. Die Auswertung des Songbird-Modells für Nis-en und Nis-pdr bei T72 im Vergleich zu einem Basismodell ergab einen Q2-Wert von 0,154.

Die statistische Signifikanz wurde mithilfe des Wilcoxon-Rangsummentests (unter Verwendung der in R 4.0.2 implementierten Funktion „wilcox.test“) mit der Option „Paired“ berechnet. Die p-Werte wurden mithilfe des Benjamini-Hochberg-Verfahrens für falsche Entdeckungen angepasst.

Die Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) wurde auf der Grundlage der relativen Häufigkeit von Bakterienarten und der Anzahl der HUMAnN-Gene (Anzahl pro Million) in jedem Stuhlmetagenom durchgeführt, die anhand der Bray-Curtis-Abstände ermittelt wurden. Die Signifikanz der Clusterbildung nach Variablen (d. h. Nisin-Behandlung vs. Kontrollgruppen) wurde durch permutationelle multivariate Varianzanalyse (PERMANOVA) mit 1000 Permutationen (R-Pakete „PhyloSeq“, „vegan“ und „pairwiseAdonis“) bestimmt.

Für die statistische Analyse und Visualisierung der Ergebnisse wurde R Version 4.0.2 verwendet.

Diese Studie wurde vom Teagasc Animal Ethics Committee (TAEC185-2018) genehmigt und eine experimentelle Lizenznummer (AE19132/P083) wurde von der Irish Health Products Regulatory Authority (HPRA) erhalten. Alle Verfahren wurden gemäß der Richtlinie 2010/63/EU der Europäischen Union zum Schutz von Tieren für wissenschaftliche Zwecke durchgeführt. Die Studie wird gemäß den ARRIVE-Richtlinien (https://arriveguidelines.org) berichtet.

Für Bioinformatik und statistische Analysen verwendete Codes werden auf Github hinterlegt, wenn das Manuskript zur Veröffentlichung angenommen wird. In der Zwischenzeit können Codes auf Anfrage weitergegeben werden. Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Shotgun-Metagenomics-Daten sind im NCBI unter dem Projektnamen PRJNA906489 verfügbar (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA906489).

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken Tomás Ryan und David Clarke (Abteilung Schweineentwicklung, Teagasc) für Ratschläge, technische Hilfe und Probenahmen vor und während des Versuchs. Die Autoren danken Beatriz Gomez Sala (Abteilung für Lebensmittelbiowissenschaften, Teagasc) und Gillian Gardiner (South East Technological University, Waterford, Irland) für die Beratung im Vorfeld des Versuchs. Die Autoren danken außerdem Matthew Aijuka und Cecilia Soria (Abteilung für Lebensmittelbiowissenschaften, Teagasc) für die Unterstützung während der Probenahmezeit sowie Fiona Crispie (Teagasc Sequencing Centre) für die Sequenzierung. Wir danken den anonymen Gutachtern für ihre hilfreichen Vorschläge.

Diese Forschung wurde von der Science Foundation Ireland in Form eines Zentrumszuschusses finanziert (APC Microbiome Ireland-Zuschussnummer SFI/12/RC/2273).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Ghjuvan M. Grimaud und Mairéad Coakley.

APC Microbiome Ireland, University College Cork, Co. Cork, Irland

Catherine O'Reilly, Ghjuvan M. Grimaud, Mairéad Coakley, Paula M. O'Connor, Harsh Mathur, Veronica L. Peterson, Ciara M. O'Donovan, Paul D. Cotter, Catherine Stanton, Mary C. Rea, Colin Hill & R. Paul Ross

Abteilung für Lebensmittelbiowissenschaften, Teagasc Food Research Centre, Moorepark, Fermoy, Co. Cork, Irland

Catherine O'Reilly, Ghjuvan M. Grimaud, Mairéad Coakley, Paula M. O'Connor, Harsh Mathur, Veronica L. Peterson, Ciara M. O'Donovan, Paul D. Cotter, Catherine Stanton und Mary C. Rea

Abteilung für Mikrobiologie, University College Cork, Co. Cork, Irland

Catherine O'Reilly, Paula M. O'Connor, Colin Hill und R. Paul Ross

Schweineentwicklungsabteilung, Teagasc Animal & Grassland Research & Innovation Centre, Moorepark, Fermoy, Co. Cork, Irland

Peter G. Lawlor

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PR, CH, CS, MR, COR haben die Studie entworfen. COR, MC, POC, HM, VP, PL führten die Experimente und die Sequenzierung durch. GG und COD führten die bioinformatische und statistische Analyse durch. COR, GG, PR haben das Manuskript unter Mitwirkung aller anderen Autoren geschrieben. Alle Autoren geben das aktuelle Manuskript zur Veröffentlichung frei.

Korrespondenz mit R. Paul Ross.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

O'Reilly, C., Grimaud, GM, Coakley, M. et al. Modulation des Darmmikrobioms mit Nisin. Sci Rep 13, 7899 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34586-x

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Eingegangen: 21. November 2022

Angenommen: 03. Mai 2023

Veröffentlicht: 16. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34586-x

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