Entdeckung des Andrographolid-Hit-Analogs als wirksame Cyclooxygenase

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 8147 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Cyclooxygenase-2 (COX-2) ist das Schlüsselenzym, das für die Umwandlung von Arachidonsäure in Prostaglandine verantwortlich ist, die entzündungsfördernde Eigenschaften aufweisen, und daher ein potenzielles Zielprotein für die Entwicklung entzündungshemmender Medikamente. In dieser Studie wurden chemische und bioinformatische Ansätze eingesetzt, um ein neuartiges potentes Andrographolid (AGP)-Analogon als COX-2-Hemmer zu finden, das bessere pharmakologische Eigenschaften als Aspirin und Rofecoxib (Kontrollen) aufweist. Das vollständig mit Aminosäuren sequenzierte menschliche Alpha-Fold (AF) COX-2-Protein (604AA) wurde ausgewählt und auf seine Genauigkeit anhand der gemeldeten COX-2-Proteinstrukturen (PDB-ID: 5F19, 5KIR, 5F1A, 5IKQ und 1V0X), gefolgt von mehreren, validiert Sequenz-Alignment-Analyse zur Feststellung der Sequenzkonservierung. Das systematische virtuelle Screening von 237 AGP-Analoga gegen AF-COX-2-Protein ergab 22 Leitverbindungen basierend auf dem Bindungsenergie-Score (< − 8,0 kcal/mol). Diese wurden durch molekulare Docking-Analyse weiter auf 7 Analoga gescreent und weiter auf ADMET-Vorhersage, Berechnungen von Ligandeneffizienzmetriken, quantenmechanische Analyse, MD-Simulation, Docking-Simulation elektrostatischer potentieller Energie (EPE) und MM/GBSA untersucht. Eine eingehende Analyse ergab, dass das AGP-Analogon A3 (3-[2-[(1R,4aR,5R,6R,8aR)-6-hydroxy-5,6,8a-trimethyl-2-methyliden-3,4,4a, 5,7,8-Hexahydro-1H-naphthalen-1-yl]ethyliden]-4-hydroxyoxolan-2-on) bildet den stabilsten Komplex, wobei AF-COX-2 den niedrigsten RMSD-Wert (0,37 ± 0,03 nm) aufweist. , eine gute Anzahl von Wasserstoffbrückenbindungen (Protein-Ligand-H-Brücke = 11 und Protein-H-Brücke = 525), minimaler EPE-Score (− 53,81 kcal/mol) und niedrigster MM-GBSA vor und nach der Simulation (− 55,37 und). − 56,25 kcal/mol) im Vergleich zu anderen Analoga und Kontrollen. Daher schlagen wir vor, dass das identifizierte A3-AGP-Analogon durch die Hemmung von COX-2 als vielversprechendes pflanzliches entzündungshemmendes Medikament entwickelt werden könnte.

Cyclooxygenase (COX oder Prostaglandin-G/H-Synthase) spielt eine entscheidende Rolle bei der Erzeugung biologischer Mediatoren wie Prostaglandine (PGs), Thromboxan und Prostacyline aus Arachidonsäure. Das COX-Enzym liegt in zwei Isoformen vor: (i) das COX-1-Isoenzym ist konstitutiv aktiv und hauptsächlich an homöostatischen Funktionen wie der Regulierung der Blutplättchenaggregation und der Magensäure beteiligt; (ii) Im Gegensatz dazu induziert die isomere Form von COX-2 pathologische Zustände wie Entzündungen, Schmerzen und Fieber1,2,3. Für die Entwicklung entzündungshemmender und schmerzstillender Medikamente ist COX-2 ein brauchbares und spezifisches Ziel, und in den letzten Jahrzehnten wurden verschiedene COX-2-hemmende Medikamente entwickelt4. COX-2 umfasst eine Sequenzlänge von 604 Aminosäuren mit drei Hauptdomänen: (i) die Domäne des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) (34–72 Aminosäuren), (ii) die Membranbindungsdomäne (73–116 Aminosäuren) und (iii) die katalytische Domäne, die die aktiven Zentren von COX und Peroxidase enthält [UniProt-P35354]. Die aktiven Zentren von COX und Peroxidase sind räumlich unterschiedlich, aber funktionell miteinander verbunden5. Die Nähe zu Tyr371 und Ser516 sind die entscheidenden katalytischen Aminosäuren für das aktive Zentrum von COX-26. Der Valinrest an Position 509 im COX-2 bildet an seinem aktiven Zentrum eine hydrophobe (HYD) Tasche und spielt eine Schlüsselrolle bei der selektiven Induktion des Enzyms und damit der Entzündungsreaktion7,8.

COX-2 katalysiert die Reaktion in zwei Schritten: (i) der erste Schritt ist die COX-Reaktion, bei der Arachidonat in PG-G2 umgewandelt wird, das im HYD-Kanal des Kerns des Proteins auftritt, und (ii) der zweite Schritt ist die Peroxidase-Reaktion, bei der PG-G2 zu PG-H2 (einem wichtigen Vorläufer von Prostacyclin, der bei Entzündungen exprimiert wird) reduziert wird, die am hämhaltigen aktiven Zentrum in der Nähe der Proteinoberfläche stattfindet9. Nichtsteroidale entzündungshemmende Medikamente (NSAIDs), insbesondere Coxibe und Aspirin, reduzieren Entzündungen, indem sie die PG-Synthese über eine kovalente Wechselwirkung mit dem Ser-516-Rest am aktiven Zentrum von COX-2 hemmen10,11. Obwohl diese Medikamente sicher und wirksam sind, können sie gastrointestinale Toxizität verursachen, was ihren Einsatz bei hochempfindlichen Patienten eingeschränkt hat. Die Entwicklung selektiver COX-2-Hemmer, einschließlich Celecoxib und Rofecoxib (Coxibe), hemmt COX-2 anstelle von COX-1, um schmerzlindernde und entzündungshemmende Eigenschaften zu bieten und Magenbeschwerden vorzubeugen, die bei nicht selektiven NSAIDs auftreten12,13,14 . Rofecoxib ist ein hochselektives NSAID, da es keine Carbonsäure enthält (und daher den Magen-Darm-Trakt weniger reizt) und zwei große aromatische Zyklen vorhanden sind, die an einen zentralen Heterocyclusring gebunden sind15. Neben der Selektivität und Wirksamkeit, den hohen Kosten des Medikaments, potenziellen kardiovaskulären Nebenwirkungen und dem erhöhten Risiko eines ischämischen Schlaganfalls ist der Einsatz von COX-2-Hemmern umstritten16,17,18. Daher besteht ein dringender Bedarf an einem therapeutischen Medikament gegen COX-2 mit minimalen oder keinen Nebenwirkungen, vorzugsweise natürlichen Ursprungs19.

Sekundärmetaboliten wie Alkaloide, Terpenoide, Stilbene, Flavonoide, Saponine und Fettsäuren haben nachweislich eine COX-2-hemmende Wirkung20. Unter diesen hat sich Andrographolid (AGP), das aus der Pflanze Andrographis paniculata gewonnen wird, neben verschiedenen anderen pharmakologischen Vorteilen als wichtiges natürliches entzündungshemmendes Mittel erwiesen21,22,23. Andrographolid ist ein natürlicher elektrophiler kovalenter Inhibitor, der aus dem Terpenoidweg stammt und über die Strukturmerkmale verfügt, die für die Bindung an mehrere Ziele erforderlich sind24,25,26. Strukturell enthält AGP eine komplexe 3D-Architektur mit einer hohen Anzahl sp3-hybridisierter Kohlenstoffe, hohem Sauerstoffgehalt, niedrigem Stickstoffgehalt, einer polyzyklischen Struktur mit aliphatischen Seitenketten und keinen aromatischen Ringen. Darüber hinaus werden die chemischen Eigenschaften von Andrographolid durch die α-Alkyliden-β-hydroxy-γ-butyrolacton-Einheit verstärkt, bei der es sich um ein spezifisches elektrophiles Fragment handelt, das es ihm ermöglicht, das Zielprotein irreversibel und kovalent mit thiolhaltigen Aminosäureresten zu modifizieren25. Dies trägt wesentlich zur Bindungsaffinität mit dem Zielprotein bei und stellt Andrographolid als effizienten kovalenten Inhibitor dar26,27.

Einige Forschungsgruppen haben kürzlich versucht, die Ziele des Andrographolid-Signalwegs zu verstehen, die direkt oder indirekt an der Entzündungsreaktion beteiligt sind28. Tran et al. (2020) berichteten über die entzündungshemmende Wirkung des Andrographolids und seiner wenigen Derivate in einem Lipopolysaccharid-induzierten Modell einer akuten Lungenschädigung und betonten, dass α-Alkyliden-β-hydroxy-γ-butyrolacton- und Ent-Labdan-Einheiten für die entzündungshemmende Wirkung von entscheidender Bedeutung sind Aktivität25. Dai et al. (2011) berichteten, dass AGP seine verstärkte entzündungshemmende Wirkung entfaltet, indem es die Aktivität der induzierbaren Stickoxidsynthase (iNOS) im Serum, die NO-Produktion und die PGE2-Produktion verringert29. Kürzlich haben Wang et al. (2019) berichteten, dass AGP und sein Derivat die Lipopolysaccharid-induzierte Expression von COX-2 in murinen Makrophagen wirksam hemmen30. In ähnlicher Weise haben andere Forschungsgruppen berichtet, dass Andrographolid eine krebshemmende Wirkung zeigt, indem es die Expression des COX-2-Proteins hemmt31,32. Obwohl Anstrengungen unternommen wurden, um die entzündungshemmende Wirkung von Andrographolid nachzuweisen, sind die pharmakokinetischen Parameter, d. h. schlechte Löslichkeit und geringe Bioverfügbarkeit, die limitierenden Faktoren für die erfolgreiche Arzneimittelentwicklung33.

In dieser Studie wird eine systematische Computeranalyse durchgeführt, um ein neuartiges natürliches Andrographolid-Analogon auf pflanzlicher Basis als entzündungshemmendes Mittel gegen das COX-2-Enzym zu finden, das eine bessere Wirksamkeit, Wirksamkeit und Selektivität als Aspirin und Rofecoxib (Kontrollen) aufweist. Zur detaillierten Untersuchung werden molekularmechanische Techniken der Cheminformatik und quantenmechanische Ansätze eingesetzt. Nach der Validierung anhand der verfügbaren 3D-Kristallstruktur wird die gesamte Sequenzlänge der menschlichen AF-COX-2-Proteinstruktur verwendet. Darüber hinaus wurde ein Mehrfachsequenz-Alignment für die Aminosäuresequenzlänge des Proteins durchgeführt, um konservierte Regionen für biologische Aktivität herauszufinden. Insgesamt 237 AGP-Analoga werden für das Screening verwendet, gefolgt von Docking-Studien für die Hit-Analoga, ADMET-Parametervorhersage, Berechnungen der Ligandeneffizienzmetriken, eingehender quantenmechanischer Analyse und MM/GBSA-Rescoring-Studien. Darüber hinaus wurde die Stabilität des getroffenen AGP-Analoga-Komplexes durch die molekulare Docking-Simulation und die Docking-Simulationsanalyse der elektrostatischen Potentialenergie (EPE) bewertet. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie helfen bei der Entwicklung pflanzlicher COX-2-Hemmer als zukünftige entzündungshemmende Kandidaten.

Die 3D-Struktur des kristallisierten COX-2-Proteins (5F19, 5KIR, 5F1A, 5IKQ und 1V0X) wurde aus der PDB-Datenbank abgerufen, während die vorhergesagte Struktur des menschlichen COX-2-Proteins, das 604 Aminosäuren enthält, aus der AlphaFold-Datenbank (AF) abgerufen wurde ) (ID: AF-P35354-F1)34,35,36,37. Die Proteinstruktur wurde durch SAVES v6.0 (https://saves.mbi.ucla.edu/), ProSA und ProQ38,39,40,41,42 validiert. Um die Genauigkeit der menschlichen AF-COX-2-Proteinstruktur zu gewährleisten, wurden die Validierungsergebnisse mit anderen verfügbaren kristallisierten COX-2-PDB-Strukturen, d. h. 5F19, 5KIR, 5F1A und 5IKQ, und dem vorhergesagten COX-2-Modell (1V0X) verglichen. Vor jeder Interaktionsanalyse wurde die AF-COX-2-Proteinstruktur von 3Drefine (https://3drefine.mu.hekademeia.org/)43 verfeinert. Anschließend wurden mögliche Bindungstaschen für das AF-COX-2-Protein durch CASTp 3.0 vorhergesagt und durch Chimera44,45 visualisiert.

Um das Vorhandensein der konservierten Aminosäuren im AF-COX-2-Protein zu überprüfen, wurde ein Multiple Sequence Alignment (MSA) mit dem PRALINE-Programm46 durchgeführt. Dafür wurden 10 verschiedene Säugetierarten ausgewählt, nämlich Homo sapiens, Rattus norvegicus, Mus musculus, Ovis aries, Bos Taurus, Oryctolagus cuniculus, Cavia porcellus, Equus caballus, Neovison vision und Gallus gallus, und Aminosäuresequenzen ihrer jeweiligen COX- 2 Proteine ​​wurden von Uniprot (http://www.uniprot.org/) bezogen. Die resultierenden ausgerichteten Aminosäuresequenzen wurden basierend auf dem Konservierungsindex (0 bis 10) gefärbt, wobei die hochkonservierten Aminosäuresequenzen zwischen den Arten für die besondere biologische Funktion des Proteins verantwortlich sind47.

Insgesamt wurden 237 AGP-Analoga aus der PubChem-Datenbank entnommen, die aus der gemeinsamen α,β-ungesättigten γ-Lacton-Einheit besteht, die für die biologische Aktivität verantwortlich ist, indem sie während der biologischen Interaktion Addukte mit den Resten bildet25,26. Anschließend wurden die Analoga für das virtuelle Screening durch Open Babel48,49 in ein Autodock-PDBQT-Format konvertiert. Für das ortsspezifische virtuelle Screening der AGP-Analoga gegen das AF-COX-2-Protein50 wurde die Software PyRx (AutoDock Vina) verwendet. Basierend auf den interagierenden Aminosäureresten, die für das Co-Kristall-Aspirin und Rofecoxib in der 5F19- bzw. 5KIR-PDB-Struktur vorhanden sind, Aminosäuren, nämlich His75, Arg106, Val330, Tyr334, Val335, Tyr341, Tyr371, Trp373, Arg499, Phe504, Glu510, Ser516 und Leu517 wurden als Reste des aktiven Zentrums im AF-COX-2-Protein ausgewählt, um das Raster für das virtuelle Screening einzurichten35,36. Die Gitterbox wurde mit Suchraummitten von 4,76, 5,07 und − 0,12 bei x, y bzw. z und einer Vollständigkeit von 8 festgelegt, während die Abmessungen (Å) für das Gitter bei x, y und z mit a festgelegt wurden Wert von jeweils 29,54, 29,74 und 27,37. Um die erfolgreichen AGP-Analoga in die engere Wahl zu ziehen, wurde der Grenzwert für die Bindungsenergie (BE) auf weniger als – 8,00 kcal/mol festgelegt.

Die aus dem virtuellen Screening erhaltenen Hit-AGP-Analoga wurden zusammen mit AGP, Aspirin und Rofecoxib als Kontrollen einer molekularen Docking-Analyse unterzogen. AutoDock4.2 wurde für das ortsspezifische Andocken dieser Verbindungen an AF-COX-251 verwendet. Da es sich bei der AF-Proteinstruktur von COX-2 um eine vorhergesagte Proteinstruktur handelt, wurden Co-Kristallliganden, d. h. Aspirin und Rofecoxib der bestehenden kristallisierten Struktur des COX-2-Proteins 5F19 bzw. 5KIR, als Referenzverbindungen für die Docking-Analyse verwendet. Darüber hinaus wurden Aminosäuren, d. h. His75, Arg106, Val330, Tyr334, Val335, Tyr341, Tyr371, Trp373, Arg499, Phe504, Glu510, Ser516 und Leu517, als Bindungsstellenreste ausgewählt, basierend auf den mit Aspirin und Rofecoxib interagierenden Resten in 5F19 und 5KIR PDB-Strukturen. Der Gitterkasten zum Andocken wurde mit einem Abstand von 0,375 Å und einer Abmessung entlang der x-, y- und z-Koordinaten mit den Werten 84, 88 bzw. 94 erstellt. Die Gittermitte wurde auf den Schwerpunkt der Bindungsstellenreste mit der Dimension 4,305, 4,394 bzw. 1,611 neben der x-, y- und z-Achse festgelegt. Darüber hinaus wurde GA (genetischer Algorithmus) verwendet, um die Docking-Parameter mit 25000000 Energiebewertungen, 27000 Generationen und einer RMSC-Toleranz (Root Mean Square Cluster) von 2,0 Å zu berechnen. Zur Durchführung der Docking-Simulation wurde der genetische Lamarcksche Algorithmus verwendet. AutoGrid und AutoDock wurden verwendet, um molekulares Andocken durchzuführen und die beste Bindungsposition der Liganden in Protein-Ligand-Komplexen zu untersuchen. Schließlich wurden die Konformere des Liganden mit der niedrigsten freien Bindungsenergie für die weitere Analyse ausgewählt. Die aus der Docking-Studie erhaltenen Ausgabedateien wurden mit ICM-Browser und Accelrys Discovery Studio Visualizer52 visualisiert und analysiert.

ADMETlab 2.0 wurde verwendet, um physikalisch-chemische, medizinische, Absorptions-, Verteilungs-, Metabolismus-, Ausscheidungs- und toxikologische Parameter für AGP und in die engere Wahl gezogene AGP-Analoga zusammen mit Aspirin und Rofecoxib vorherzusagen53. Es wurde auch verwendet, um die Arzneimittelähnlichkeit des AGP und der in die engere Wahl gezogenen Analoga festzustellen.

Die Kennzahlen der Ligandenbindungseffizienz wurden anhand der Inhibitionskonstante (Ki), der Ligandeneffizienz (LE), der lipophilen Ligandeneffizienz (LLE), der Skalierungsfunktion der Ligandeneffizienz (LE_Scale), der Anpassungsqualität (FQ) und der lipophiliekorrigierten Ligandeneffizienz (LELP) berechnet. durch Befolgen der Gl. (1–6)54,55,56,57,58.

Das Paket Spartan 20 (wavefun.com) wurde verwendet, um quantenmechanische (QM) Deskriptoren anhand des höchsten besetzten Molekülorbitals (HOMO), des niedrigsten unbesetzten Molekülorbitals (LUMO), der HOMO-LUMO-Lücke (HLG) und der EPE-Parameter zu berechnen zur Beurteilung der Molekülorbitaleigenschaften, des elektrostatischen Potentials und zur Aufklärung verschiedener Arten von Wechselwirkungen. Alle chemischen Verbindungen wurden optimiert, um geometrische Gleichgewichtsvariablen im gasförmigen Zustand am Boden unter Verwendung der Dichtefunktionaltheorie (DFT) mit Beckes Drei-Parameter-Austauschpotential zu berechnen59. Darüber hinaus wurde die Korrelationsfunktion von Lee Yang Parr (LYP), eine Austauschfunktion, die Becke mit einem 6-31G*-Basissatz kombiniert, zur Berechnung der Grundzustandsgeometrien verwendet60,61,62.

Das native AF-COX-2-Protein und seine Komplexe mit den erfolgreichen AGP-Analoga (gescreent aus den Docking-Studien), AGP, Aspirin und Rofecoxib, wurden zum Beginn der MD-Simulationsstudien verwendet. Zur Durchführung der MD-Simulation63 wurde GROMACS 2019.2 verwendet. Alle topologischen Parameter für chemische Verbindungen wurden vom PRODRG-Server64 bezogen. Das Kraftfeld GROMOS96 54a7 wurde zur Durchführung aller Simulationsstudien65 verwendet. Darüber hinaus wurde ein explizites Wassermodell mit einfacher Punktladung (SPC) verwendet, um das System in einem Dodekaeder-Kastentyp zu solvatisieren. Das System wurde durch Zugabe von Gegenionen neutralisiert, um den protonierten Restzustand bei physiologischem pH-Wert 7,4 aufrechtzuerhalten. Anschließend wurde die anfängliche sterische Hinderung durch die Methode der steilsten Abstiegsenergie für 50.000 Schritte beseitigt, um das System zu minimieren. Anschließend wurden NVT/NPT-Ensembles mit einem Leap-Frog-Integrator bei einer Temperatur von 300 K und einem Druck von 1,0 bar verwendet, um das System auszugleichen. Die MD-Simulation wurde für 100 ns für jedes äquilibrierte System mit 5000 Bildern durchgeführt. Die statistische MD-Simulationsanalyse wurde über WebGRO (https://simlab.uams.edu/) durchgeführt, indem RMSD (Root-Means-Square-Deviation), RMSF (Root-Mean-Square-Fluctuation) und die durchschnittliche Fläche berechnet wurden pro Rest, SAS-Fläche (Solvent-Accessible-Surface), Volumen und Dichte, H-Brücken (Anzahl der Wasserstoffbrücken im Protein sowie zwischen Protein und Ligand) und Rg-Wert (Gyrationsradius).

Um die Stabilität von Addukten von AGP, Hit-Analoga, Aspirin und Rofecoxib mit der ausgewählten Peptidlänge von AF-COX-2 zu beurteilen, wurde die EPE-Docking-Simulationsstudie mit Spartan 20 durchgeführt. Für dasselbe wurde eine Aminosäuresequenzlänge von 511 verwendet bis 520 von AF-COX-2 (d. h. Val511, Gly512, Ala513, Pro514, Phe515, Ser516, Leu517, Lys518, Gly519 und Leu520) wurde als Peptid zur Bildung der Addukte mit den Verbindungen ausgewählt. Zu diesem Zweck wurde zunächst ein Modell bestehend aus einem Peptid mit 10 Aminosäureresten und einem Liganden erstellt. Anschließend erfolgte die Energieminimierung mit der Option „Molekularmechanik“, gefolgt von den B3LYP/6-31G*-Einzelpunktberechnungen. Die Energie des Addukts wurde direkt aus dem Ergebnis der Berechnungen ermittelt. Darüber hinaus wurden zur Berechnung der elektronischen Parameter die Daten im Zusammenhang mit dem B3LYP/6-31G*-Basissatz verwendet, da die Anzahl der ungepaarten Elektronen (Multiplizität) = 0, die Gesamtladung = neutrale Kopplung und die Kopplungskonstante = empirische und Stabilisierungsenergie bestimmt wurde indem aus der Adduktenergie die Summe der Energien der einzelnen Konstituenten abgeleitet wird. Anschließend wurde für jedes Addukt und Peptid der EPE berechnet, der die Elektronenverteilung auf der Oberfläche der Verbindungen charakterisierte66. Schließlich wurde die Bindungsenergie komplexer Verbindungen mit Peptid unter Verwendung der folgenden Gleichung berechnet: (7).

Die freien Bindungsenergien in Bezug auf die molekularmechanische generalisierte Oberfläche (MM/GBSA) der Hit-Analoga von AGP, AGP, Aspirin und Rofecoxib-Komplexe wurden mit Fast Amber Rescoring (FAR)67 berechnet. Für die kleinen Moleküle wurde das Kraftfeld ff14SB verwendet, während für die Proteinanalyse das Generalized Amber Force Field2 (GAFF2) eingesetzt wurde68. Darüber hinaus wurde die AM1-BCC-Methode verwendet, um die Teilladung in den Analoga über ein Vorkammermodul von Amber69,70 zuzuordnen.

In dieser Studie wurde die vollständig sequenzierte COX-2-Proteinstruktur AF-P35354-F1 mit 1–604 Aminosäuren verwendet, die von AlphaFold modelliert wurde und eine hochmoderne Methode des maschinellen Lernens zur Proteinmodellierung verwendet. Vor der Durchführung einer rechnerischen Analyse wurde diese Proteinstruktur validiert, indem die Gesamtqualität des Proteins mit den vorhandenen vier kristallisierten COX-2-Proteinstrukturen (PDB-ID: 5F19, 5KIR, 5F1A und 5IKQ) und einer modellierten Struktur (PDB-ID: 1V0X). Die Ergänzungstabelle S1 fasst die Ergebnisse von SAVES, ProSA und ProQ für alle Proteinstrukturen zusammen, die ERRAT, VERIFY, PROVE, Whatcheck, Procheck, Z-Score und LGscore verwenden, um die Qualität des Proteins durch Berechnung des Gesamtqualitätsfaktors zu bewerten , Kompatibilität eines atomaren 3D-Modells mit seiner Aminosäuresequenz, Atomvolumina, stereochemischen Parametern und stereochemischer Qualität. Die AF-COX-2-Proteinstruktur hat den VERIFY- und PROVE-Test mit einem Gesamtqualitätsfaktor von 97,74 % und 90,9 % Resten im am meisten bevorzugten Grund erfolgreich bestanden. Darüber hinaus wurden Z-Score- und LGscore-Werte für das AF-COX-2-Protein mit -8,97 bzw. 7,639 ermittelt, was darauf hindeutet, dass die Struktur des AF-COX-2-Modellproteins von guter Qualität ist40,42. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Gesamtqualität der AF-COX-2-Proteinstruktur im Hinblick auf Qualität, Kompatibilität und stereochemische Parameter die beste unter allen anderen Strukturen ist, weshalb diese 3D-Proteinstruktur für weitere Studien verwendet wurde.

CASTp 3.0 sagte 96 mögliche Bindungstaschen für das AF-COX-2-Protein voraus (Ergänzungstabelle S2). Anschließend werden entsprechend der Form, den inneren Hohlräumen, der Fläche und dem Volumen der Bindungstaschen die Aminosäuren aus der zweiten Bindungstasche (His75, Arg106, Phe191, Val214, Val330, Ile331, Tyr334, Val335, Leu338, Tyr341, Leu345) ausgewählt , Lys346, Gln358, Asn361, Tyr371, Trp373, Lys454, Arg455, Met457, Arg499, Phe504, Glu510, Phe515, Ser516, Leu517, Leu520, Met521) wurden zur weiteren Betrachtung ausgewählt. Als nächstes wurden die Bindungsstellenreste für die Studie basierend auf der Wechselwirkung von Rofecoxib und Aspirin in der 5KIR- bzw. 5F19-PDB-Struktur ausgewählt. Darüber hinaus wurde in der 5KIR-PDB-Struktur festgestellt, dass die Bindungsstellenreste für Rofecoxib Val344, Trp387, Phe518, Tyr385, 355, Ser530, ​​Leu531, Arg120, 513, Glu524 und His90 sind. In der 5F19-PDB-Struktur hingegen werden die Reste der Aspirin-Bindungsstelle als Tyr385, Ser530, ​​Leu531, Glu524, Arg120, 513 und His 90 erkannt. Um herauszufinden, welche Verbindung wirksamer als Rofecoxib und Aspirin ist, haben wir daher die Bindungsstelle berücksichtigt Reste beider Verbindungen. Daher haben wir die gemeinsamen Bindungsreste (Tyr385, Ser530, ​​Leu531, Arg120 und Glu524) zusammen mit den einzigartigen Bindungsresten ausgewählt, die auf Rofecoxib und Aspirn vorhanden sind. Dementsprechend haben wir in dieser Studie die Reste His75, Arg106, Val330, Tyr334, Val335, Tyr341, Tyr371, Trp373, Arg499, Phe504, Glu510, Ser516 und Leu517 als Bindungsstelle für das AF-COX-2-Protein berücksichtigt. Interessanterweise ergab die CASTp 3.0-Analyse, dass alle ausgewählten Bindungsstellenreste auch in der vorhergesagten Bindungstasche für AF-COX-2 vorhanden sind und möglicherweise auch für die Ligandenbindung und Proteinhemmung wichtig sind71.

Das AF-COX-2-Protein hat eine modellierte 3D-Struktur ohne kokristallisierten Liganden. Daher wurde die Vorhersage der Bindungsstellenreste in der verfeinerten Proteinstruktur durch Vergleich mit dem aktiven Zentrum der vorhandenen kristallisierten PDB-Struktur von COX-2 durchgeführt in der PDB-Datenbank vorhanden. Aus diesem Grund wurden 5F19- und 5KIR-PDB-Strukturen von COX-2 ausgewählt, die Aspirin bzw. Rofecoxib als Co-Kristallliganden aufweisen. Basierend auf den Bindungsstellen beider Co-Kristallliganden in der Proteinstruktur wurden die Aminosäuren His75, Arg106, Val330, Tyr334, Tyr341, Tyr371, Trp373, Arg499, Phe504, Glu510, Ser516 und Leu517 als aktive Stellen ausgewählt Bindungsinteraktionsstudien. Um diese Reste als prominentes aktives Zentrum zu verifizieren, wurde ein Mehrfachsequenz-Alignment unter Verwendung des COX-2-Proteins von 10 verschiedenen Säugetierarten durchgeführt, das bewies, dass mit Ausnahme von Arg499 alle ausgewählten Aminosäuren vollständig konserviert sind (Ergänzende Abbildung S1 und Tabelle S3). ). Dies verdeutlicht auch die Bedeutung dieser Aminosäuren für verschiedene biologische Funktionen und als potenzielles Ziel für die Arzneimittelentwicklung47.

Ein Satz von 237 Andrographolid-Analoga, die aus der gemeinsamen α,β-ungesättigten γ-Lacton-Einheit bestehen, die für die biologische Aktivität wichtig ist, wurde gegen das vollständig sequenzvalidierte AF-COX-2-Protein gescreent, um eine wirksame entzündungshemmende Verbindung auf pflanzlicher Basis zu finden25 ,26. Das ortsgesteuerte virtuelle Screening wurde genutzt, um die erfolgreichen AGP-Analoga durch einen rechnerischen Ansatz zu entdecken. Es berechnet die Bindungsenergie für alle untersuchten Analoga anhand der Ergebnisse der Protein-Ligand-Wechselwirkung. Anschließend wurden die energetisch günstigeren Analoga-Komplexe für die weitere Analyse ausgewählt. Die Ergebnisse der virtuellen Screening-Analyse zeigten, dass die niedrigste Bindungsenergie für PubChem ID: 132210370 bei − 8,80 kcal/mol lag, während die höchste Bindungsenergie für PubChem ID: 59876522 bei − 5,90 kcal/mol lag (Ergänzungstabelle). S4). Anschließend wurden basierend auf dem Bindungsenergie-Grenzwert (– 8,00 kcal/mol) 22 von 237 AGP-Analoga zur weiteren Analyse gescreent. Daher wurden diese 22 AGP-Analoga molekularen Docking-Studien unterzogen, um den wirksamen COX-2-Inhibitor zusammen mit AGP und Kontrollmedikamenten (Aspirin und Rofecoxib) herauszufinden.

Die aus der molekularen Docking-Analyse erhaltenen Bindungsenergiewerte lagen im Bereich von – 9,35 kcal/mol (PubChem-ID: 132210508) bis – 3,2 kcal/mol (PubChem-ID: 132217538) (Ergänzungstabelle S5). Im Gegensatz dazu zeigten Aspirin, Rofecoxib und AGP Bindungsenergiewerte von −5,61 kcal/mol, −8,17 kcal/mol bzw. −7,95 kcal/mol. Von 22 AGP-Analoga wurden 7 Hit-Analoga mit den Namen A1–A7 für die weitere Analyse ausgewählt, basierend auf einem Bindungsenergie-Grenzwert von weniger als – 8,00 kcal/mol. In Bezug auf die Bindungsenergie zeigten alle sieben Hit-Analoga einen geringeren Wert im Vergleich zu Aspirin und AGP, während fünf Analoga (A1–A5) einen geringeren Wert als Rofecoxib aufwiesen (Tabelle 1), was auf ihr Potenzial zur Hemmung des COX-2-Proteins hinweist.

Das Bindungsmuster von AGP und seinen ausgewählten sieben Hit-Analoga in Bezug auf die vorhandenen COX-2-Proteininhibitoren, d. h. Aspirin und Rofecoxib (Kontrollen), wurde untersucht, um die molekulare Bindungsinteraktion und die Bindungspositionsanalyse zu vergleichen (Tabelle 2). Diese Analyse zeigt, dass die Aminosäuren Val335, Leu338, Ser339, Phe504, Val509 und Ala513 bei den Wechselwirkungen aller untersuchten Verbindungen mit dem AF-COX-2-Protein gemeinsam sind. Darüber hinaus werden die Aminosäuren Trp373, Gly512 und Ser516 von Aspirin, AGP und A1–A7-Analoga gemeinsam genutzt, während die Reste Leu78, Val102, Arg106, Tyr341, Leu345 und Leu517 von Rofecoxib, AGP und A1–A7 besetzt werden. Darüber hinaus waren unter allen interagierenden Aminosäuren die Reste Arg106, Tyr371, Arg499, Met508, Val509, Glu510, Ala513 und Ser516 an der H-Brücken-Wechselwirkung beteiligt, während Leu78, Val102, Arg106, Val335, Leu338, Tyr341, Leu345, Phe504 , Met508-, Val509-, Ala513- und Leu517-Reste waren an der HYD-Wechselwirkung beteiligt. AGP und die Hit-Analoga A1–A5 zeigten 3, 3, 4, 1, 3 bzw. 4 H-Brücken, während bei den A6- und A7-Analogen keine H-Brücken gebildet wurden. Interessanterweise geht aus dem Bindungsmuster hervor, dass AGP und A1–A7-Analoga die interagierenden Aminosäurereste sowohl der Aspirin- als auch der Rofecoxib-Bindungsstelle des AF-COX-2-Proteins teilen (Abb. 1 und 2), was auf ihr Potenzial als COX-COX-2-Protein hinweist. 2-Protein-Inhibitor mit verbesserter Bindungsinteraktion. Darüber hinaus zeigt die Bindungsorientierung von AGP und Hit-Analoga, dass die Oxalon-Einheit in Richtung der Aspirin-Bindungsstelle zeigt, während die Naphthalin/Naphthol-Einheit in Richtung der Rofecoxib-Bindungsstelle positioniert ist (ergänzende Abbildung S2).

Überlagerung von Aspirin, Rofecoxib, AGP und Hit-AGP-Analoga an der Bindungsstelle von AF-COX-2. Alle chemischen Verbindungen werden als Kugel-Stab-Modell, Proteine ​​als Banddarstellung und interagierende Aminosäuren als Einzelbuchstabencode dargestellt. Farbcode: hellgrau = AF-COX-2-Protein, blau gepunktete Oberfläche = Aspirin-Bindungstasche, rot gepunktete Oberfläche = Rofecoxib-Bindungstasche, blau = Aspirin, rot = Rofecoxib, gelb = AGP, grün = A1, orange = A2, magenta = A3, Pink = A4, dunkles Schiefergrau = A5, Cyan = A6 und Pflaume = A7. Diese Zahl wird mit ICM-Browser52 aufgezeichnet.

2D-Bindungswechselwirkungen von Aspirin (a), Rofecoxib (b), AGP (c) und AGP-Analoga (A1–A7) (d–j) mit der Bindungsstelle des AF-COX-2-Proteins. Alle chemischen Verbindungen werden als Kugel-Stab-Modell dargestellt; Aminosäuren mit ihrer Nummer werden als Kreis mit einem Drei-Buchstaben-Code dargestellt und eine gestrichelte Linie zeigt die Wechselwirkungsstelle chemischer Verbindungen mit Aminosäuren. Farbcode: grün = H-Bindungen, rosa = HYD-Wechselwirkungen.

Die physikochemischen, Absorptions-, Verteilungs-, Stoffwechsel-, Ausscheidungs- und toxikologischen Eigenschaften von AGP- und A1–A7-Analoga wurden vorhergesagt und mit Aspirin und Rofecoxib verglichen, um ihre Arzneimittelähnlichkeit zu bewerten (Tabelle 3). Physikalisch-chemische Eigenschaften wie Molekulargewicht (MW), Anzahl der H-Brücken-Akzeptoren (nHA), Anzahl der H-Brücken-Donatoren (nHD), topologische polare Oberfläche (TPSA) und der Logarithmus des n-Octanol/Wasser-Verteilungskoeffizienten (logP) wurden für alle ausgewählten Verbindungen berechnet. Darüber hinaus wurden für alle Verbindungen medizinisch-chemische Eigenschaften analysiert, z. B. der Naturprodukt-Ähnlichkeits-Score (NPscore), die Lipinski-Regel und die Pfizer-Regel. Mit Ausnahme von Rofecoxib und dem A5-Analogon erfüllten alle Verbindungen die Kriterien für physikalisch-chemische und medizinisch-chemische Eigenschaften für arzneimittelähnliche Kandidaten. Darüber hinaus sind die Absorptionseigenschaften wie Caco-2-Permeabilität (die humanen Kolonadenokarzinom-Zelllinien), Pgp-inhibitorische Aktivität (Inhibitor des P-Glykoproteins), humane Darmabsorption (HIA-Bereich 0–0,3) und F30 % (die humane orale Absorption) berücksichtigt Für alle Verbindungen wurde auch eine Bioverfügbarkeit von 30 % berechnet. Mit Ausnahme von Rofecoxib und dem A6-Analogon erfüllten alle Verbindungen die Kriterien für die Verwendung als oral wirksame Arzneimittel. Darüber hinaus wurden für alle untersuchten Moleküle Verteilungseigenschaften vorhergesagt, beispielsweise die Plasmaproteinbindung (PPB), das Verteilungsvolumen (VD), die Durchdringung der Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​und der im Plasma ungebundene Anteil (Fu). Es wurde festgestellt, dass die Verteilungseigenschaften von AGP und A1–A7-Analoga im akzeptablen Bereich für einen arzneimittelähnlichen Kandidaten liegen. Darüber hinaus sprach die kumulative Analyse der Stoffwechsel- und Ausscheidungseigenschaften auch für das AGP- und A1-A7-Analogon als potenzielle Arzneimittelkandidaten. Darüber hinaus ergab die Bewertung der toxikologischen Eigenschaften auch, dass die AGP-Analoga A1–A7 nicht toxisch sind.

Die Ligandenbindungsqualität der ausgewählten Proteine ​​wurde auf der Grundlage der Molekülmasse und der Lipophilie im Kontext des jeweiligen Proteinziels berechnet. Typischerweise weist ein niedriger Ki-Wert auf eine hohe Wirksamkeit hin und sollte im mikromolaren Bereich liegen, damit ein Molekül als Hit- oder Leitverbindung eingestuft wird55. Die Ligandeneffizienz (Schwellenwert = 0,3 kcal/mol/HA) gibt Aufschluss darüber, wie gut eine Verbindung im Verhältnis zu ihrer Größe an das Protein bindet56. Die lipophile Effizienz des Liganden (Schwellenwert = 3) wird verwendet, um die Affinität eines Moleküls zur Lipophilie zu messen, die der Hauptfaktor für die Promiskuität des selektiven LLE und optimierter Verbindungen ist54,56,57. LE_Scale ist eine größenunabhängige Skalierungsfunktion der Ligandeneffizienz und wird durch Anpassen einer Exponentialfunktion an die maximalen Ligandeneffizienzwerte abgeleitet, die für ein bestimmtes Schweratom (HA) beobachtet werden. Die Anpassungsqualität (Schwellenwert = 0,8), auch skalierte Ligandeneffizienz genannt, umfasst Ligandeneffizienz und -größe in einer einzigen Metrik und ergibt sich aus der Division des beobachteten LE durch LE_scale55,56,58. Schließlich wurde der LELP (akzeptabler Bereich = -10 bis + 10) berechnet, der eine Metrik darstellt, die den Preis der Ligandeneffizienz angibt, der für die Lipophilie gezahlt wird54,55. Darüber hinaus wurden die aus den Docking-Studien erhaltene Bindungsenergie (BE) (Tabelle 1), HA und LogP aus der Vorhersage physikalisch-chemischer Eigenschaften (Tabelle 3) für die Berechnung aller LE-Metriken herangezogen. Aus Tabelle 4 ist ersichtlich, dass mit Ausnahme von A5 und den Kontrollen (Aspirin und Rofecoxib) alle gescreenten Analoga die jeweiligen Messwerte für die Ligandeneffizienz aufweisen, die die Mindestschwellenwerte überschreiten und als HIT-Analoga bezeichnet werden müssen. Auch in Bezug auf die Hemmkonstante zeigten die Analoga A1–A5 einen Ki-Wert, der kleiner war als der der Kontrollen (Aspirin Ki = 75,604 µM und Rofecoxib Ki = 0,995 µM) und AGP (Ki = 1,440 µM), was auf ihre größere Bindungsaffinität gegenüber der Hemmung hinweist COX-2-Protein als Kontrollen und AGP.

Die Grenzmolekularorbitale (FMOs) wie HOMO, LUMO und HLG wurden berechnet, um die elektronischen Eigenschaften von AGP, Hit-Analoga, Aspirin und Rofecoxib gegen AF-COX-2 vorherzusagen. Im Fall von AGP und A1–A7-Analoga befinden sich HOMO- und LUMO-Orbitale auf der Naphthalin/Naphthol- bzw. Oxalon-Einheit, während im Fall von Aspirin HOMO- und LUMO-Orbitale auf dem Benzoesäureteil der Struktur lokalisiert sind. Im Gegensatz dazu sind die HOMO-Orbitale auf die Phenylfuran-Einheit beschränkt, während die LUMO-Orbitale auf der Methylsulfonylpheny-Furan-Einheit von Rofecoxib positioniert sind (Abb. 3). Der HLG zwischen zwei energetischen Zuständen, also HOMO und LUMO, erklärt die chemische Reaktivität von Molekülen, wobei der niedrigste HLG-Wert eine größere chemische Reaktivität und biologische Aktivität und eine geringere Stabilität der Verbindung bedeutet, indem er den Elektronenfluss erleichtert72. Es spielt auch eine wichtige Rolle bei der Stabilisierung von Protein-Ligand-Komplexen73. Die HLG-Werte lagen für alle untersuchten Verbindungen im Bereich von 4,24 bis 5,63 eV mit der Reihenfolge A6 (5,63 eV) > A7 (5,51 eV) = A5 (5,51 eV) > Aspirin (5,43 eV) > AGP ( 5,26 eV) > A4 (5,21 eV) > A2 (5,15 eV) > A3 (5,05 eV) > A1 (5,03 eV) > Rofecoxib (4,24 eV). Basierend auf dem HLG-Wert zeigen sowohl A1 als auch A3 die höchste chemische Reaktivität, wohingegen A6 am wenigsten reaktiv und am stabilsten ist.

Darstellung der HOMO- und LUMO-Molekülorbitale von Aspirin (a), Rofecoxib (b), AGP (c) und den AGP-Hit-Analoga {A1–A7} (d–j) mit ihrem HLG (HOMO-LUMO-GAP). Die obere Struktur zeigt LUMO, während die untere Struktur HOMO-Orbitale darstellt. Farbcode: Rot = negativstes Potenzial; Blau = positivstes Potenzial.

Die EPE-Karte wird verwendet, um die aktiven Zentren für intermolekulare Wechselwirkungen als räumliche Elektronendichteverteilung über die chemischen Verbindungen vorherzusagen74,75. Abbildung 4 zeigt die EPE-Karte von Aspirin, Rofecoxib, AGP und A1–A7, wobei der blaue Farbbereich das positivste Potenzial darstellt, das für die nukleophile Wechselwirkung verantwortlich ist, während die rote Farbe das negativste Potenzial anzeigt, das den Ort der elektrophilen Wechselwirkung darstellt . Aus der EPE-Kartenanalyse geht hervor, dass sich Acetyloxy- und Carboxylgruppen in Aspirin, Methylsulfonyl- und Furangruppen in Rofecoxib sowie Oxalon- und Hydroxylgruppen der Naphthalineinheit in AGP und Hit-Analoga im negativen Potential (roter Bereich) befinden und diese somit sind prominenter Ort für die elektrophilen Wechselwirkungen. Im Gegensatz dazu liegt das positive Potential (blauer Bereich), ein potenzieller Ort für nukleophile Wechselwirkungen, um den Wasserstoff der Carboxylgruppe in Aspirin, der Phenylgruppe von Rofecoxib und der Naphthalin- oder Naphtholeinheit in AGP- und A1–A7-Analoga. Die positiven EPE (kcal/mol) lagen in der Reihenfolge Rofecoxib (36,24) < Aspirin (59,54) < A7 (61,75) < A3 (62,15) < A4 (64,90) < AGP (65,08) < A1 (65,50). < A2 (65,79) < A6 (67,07) < A5 (68,07). Der negative EPE-Trend (kcal/mol) war unterschiedlich und folgte der Reihenfolge A7 (− 48,98) > AGP (48,97) > A3 (48,31) > A6 (-47,84) > A4 (− 46,65) > A2 (− 46,53) > A1 (− 45,97) > A5 (− 43,98) > Rofecoxib (−43,51) > Aspirin (− 41,70) (Abb. 4). Da der negative Wert von EPE die stärkere H-Brückenbildung begünstigt76,77, zeigten AGP und seine A1–A7-Hit-Analoga im Vergleich zu Aspirin und Rofecoxib ein besseres Potenzial für eine stärkere H-Brücken-Wechselwirkung.

Elektrostatische Potentialenergiekarten von Aspirin (a), Rofecoxib (b), AGP (c) und Hit-AGP-Analoga {A1–A7} (d–j). Der Farbcode für EPE-Konturkarten zeigt den negativsten Wert in Rot bis zum positivsten Wert in Blau; Die Reihenfolge des Potenzials ist: blau (am meisten + ve) > grün > gelb > orange > rot (am meisten -ve).

Strukturell haben alle untersuchten AGP-Analoga das chemische Hauptgerüst gemeinsam, das aus zwei zyklischen Gruppen (dh Naphthalin/Naphthol und Oxalon) besteht, die mit einer Ethyledin-Einheit verbunden sind. Bicyclische Gruppen enthaltende Verbindungen zeigen eine Vielzahl biologischer Aktivitäten78. Diese bizyklischen Gruppen, die Arzneimittel enthalten, interagieren überwiegend über hydrophobe und aromatische Reste mit Proteinen. Darüber hinaus wurde auch gezeigt, dass die bicyclischen Verbindungen mit den polaren Gruppen wie Hydroxyl und Amiden der Aminosäure interagieren79. In dieser Studie gibt es unter den gescreenten AGP-Analoga zwei Stereoisomere A1 (6S)/A3 (6R) und A2 (6S)/A4 (6R), während sich die Analoga A5, A6 und A7 voneinander unterscheiden. Im Vergleich zu AGP unterscheiden sich die Analoga A1 bis A5 strukturell an den Positionen 5 und 6 der Naphthalineinheit, während der Rest des chemischen Gerüsts gleich ist. Anstelle von Naphthalin besaßen die Analoga A6 und A7 eine Naphthol-Einheit und eine andere Gruppe an der 3. Position des Naphthol-Rings. Darüber hinaus ergab die Analyse der molekularen Wechselwirkungen, dass unter den gescreenten Analoga Naphthalineinheiten enthaltende Verbindungen im Vergleich zu Naphthol eine größere Affinität zum COX-2-Protein im Hinblick auf Bindungsenergie, H-Brücken und HYD-Wechselwirkungen zeigten (Tabelle 1 und 2). Aus Abb. 2 und Tabelle 2 der molekularen Wechselwirkungsanalyse geht hervor, dass die Oxolan-Einheit hauptsächlich an der H-Brücken-Wechselwirkung beteiligt ist, während die Naphthalin/Naphthol-Einheit hauptsächlich an den HYD-Wechselwirkungen beteiligt ist. Dies wurde durch quantenmechanische Deskriptoranalyse weiter bestätigt. Strukturell gesehen haben die Analoga A1–A4 im Vergleich zu AGP eine OH-Gruppe weniger an der 5. Position in der Naphthalineinheit, was die Wirkungsdauer dieser Analoga verlängert, was durch ADMET-Vorhersage bestätigt wurde (Tabelle 3). Dies erhöht die HYD-Wechselwirkung dieser Art von Analoga mit dem COX-2-Protein weiter und erhöht auch die Affinität zum Rezeptor80. Basierend auf der oben genannten Beziehung zwischen den chemischen Strukturmerkmalen und den Ergebnissen der molekularen Docking- und DFT-Analyse kamen wir daher zu dem Schluss, dass die gescreenten AGP-Analoga im Vergleich zu AGP und den Referenzarzneimitteln (Aspirin und Rofecoxib) eine verbesserte entzündungshemmende Aktivität aufwiesen.

Eine MD-Simulationsanalyse wurde für AGP- und Hit-Analoga-Komplexe mit AF-COX-2-Protein zusammen mit geeigneten Kontrollen {AF-COX-2-Protein allein (Neutralkontrolle) und sein Komplex mit Aspirin und Rofecoxib (Positivkontrolle)} durchgeführt. Die MD-Simulationstrajektorienanalyse des AGP- und Hit-Analoga-Komplexes wurde mit nativem AF-COX-2-Protein, Aspirin und Rofecoxib-Komplex hinsichtlich RMSD, RMSF, Restfläche, Rg, SAS-Fläche, SAS-Volumen, SAS-Dichte und Protein verglichen H-Brücken und Protein-Ligand-Komplex-H-Brücken.

Der RMSD misst die Proteinkonformation, indem er während der Simulation den durchschnittlichen Abstand zwischen den Rückgratatomen eines Proteins berechnet und die strukturelle Stabilität bewertet. Es wurde festgestellt, dass die durchschnittlichen RMSD-Werte für AGP und Hit-Analoga niedriger waren als für die neutrale Kontrolle (natives Protein). Im Vergleich zu Positivkontrollen wurde beobachtet, dass der durchschnittliche RMSD-Wert in den Analoga A2, A3 und A4 geringer war. Der niedrigste RMSD-Wert wurde für das Analogon A3 beobachtet, was auf seine Fähigkeit hinweist, ein stabiles Addukt mit AF-COX-2-Protein zu bilden (Abb. 5a und Ergänzungstabelle S6). Der RMSF wird für die Restmobilität jedes Protein-Ligand-Komplexes sowie des nativen Proteins berechnet. Es wurde kein merklicher Unterschied zwischen den Restfluktuationsprofilen aller Komplexe festgestellt (Abb. 5b). Dies kann auf die Bildung von H-Brücken und Van-der-Waal-Wechselwirkungen zwischen Aminosäureresten und Liganden zurückgeführt werden. Wie in Abb. 5b gezeigt, weisen die aktiven Bindungsstellenregionen geringere Schwankungen auf, was auf ihre Stabilität im AF-COX-2-Protein hinweist. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass der durchschnittliche RMSF in den A1-, A3-, A6- und A7-Komplexen niedriger war als in der Neutralkontrolle und der Positivkontrolle (Ergänzungstabelle S6). Der individuelle RMSF für die interagierenden Aminosäurereste in jedem komplexen Simulationssystem wurde berechnet und mit dem jeweiligen durchschnittlichen RMSF-Wert für das Simulationssystem verglichen. Darüber hinaus wurde aus der Ergänzungstabelle S6 ermittelt, dass der durchschnittliche RMSF-Bereich für alle untersuchten Simulationssysteme 0,16 ± 0,10 bis 0,21 ± 0,18 nm beträgt. Es ist auch offensichtlich, dass mit Ausnahme von Arg106, Ser339 und Phe 504 der Rest der interagierenden Aminosäure einen RMSF-Wert von weniger als 0,21 nm aufwies (was der höchste durchschnittliche RMSF-Wert im gesamten Simulationssystem ist) (Ergänzungstabelle S7). Dies bedeutet, dass die interagierenden Bindungsreste während der MD-Simulation recht stabil sind. Darüber hinaus zeigt der niedrigere durchschnittliche RMSF-Wert für die Analoga A1, A2, A3, A6 und A7 im Vergleich zum Protein, dass die Analoga während der MD-Simulation stabile Wechselwirkungen mit dem Protein eingehen können. Diese RMSF-Studie legte die Fähigkeit dieser vier AGP-Analoga zur Bildung einer stabilen Wechselwirkung mit dem AF-COX-2-Protein während des Simulationszeitraums nahe.

Bildliche Darstellung der Ergebnisse der MD-Simulationsanalyse in Bezug auf RMSD (a), RMSF (b), SAS-Fläche für jeden Rest (c) und Rg (d) des nativen AF-COX-2-Proteins und seines Komplexes mit den untersuchten Liganden.

Die SAS-Fläche für jeden Rückstand während der Simulation wurde ebenfalls berechnet, um die Fläche jedes Rückstands zu berechnen, die für Lösungsmittel zugänglich ist (Abb. 5c)81. Der SAS-Wert pro Rückstand lag im Bereich von 0–2,49 nm2. Es ist offensichtlich, dass einige Reste des AF-COX-2-Proteins für Lösungsmittel wie Asn181 im Rofecoxib- und A2-Komplex und Lys237 im A7-Komplex nicht zugänglich sind. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass der durchschnittliche Wert der SAS-Fläche pro Rest unter allen untersuchten Analoga und Kontrollverbindungen für A3 am höchsten ist. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass der maximale Wert der SAS-Fläche pro Rückstand (nm2) in der Größenordnung von A4 (2,49) > A5 (2,44) > A3 (2,27) > A6 (2,22) > Rofecoxib (2,21) > A7 (2,19) liegt. > A2 (2.18) > A1 (2.11) > AGP (2.06) > Aspirin (2.06) > Protein (2.05), was bedeutet, dass die Analoga A3–A6 eine bessere Zugänglichkeit für das Lösungsmittel haben als die anderen Komplexe sowie natives Protein (Ergänzung). Tabelle S8).

Die Rg-Analyse wurde durchgeführt, um den Grad der Kompaktheit im Hinblick auf die Proteinfaltung und -entfaltung der AF-COX-2-Proteinstruktur in Gegenwart und Abwesenheit der Liganden zu berechnen. Es wurde festgestellt, dass der durchschnittliche Rg-Wert für die Analoga A3 und A6 dem Rg-Wert des nativen Proteins (Neutralkontrolle) entspricht, jedoch niedriger als der der Positivkontrolle ist. Dies deutet auf eine stabilere und kompaktere Protein-Ligand-Komplexbildung im Vergleich zu anderen Analoga und Positivkontrollen hin (Abb. 5d und Ergänzungstabelle S8)82.

Die Anzahl der H-Brücken im Protein sowie zwischen Protein und Ligand spielt eine wichtige Rolle für die Stabilität von Komplexen. Daher wurde eine H-Brückenanalyse für natives AF-COX-2 und seine Komplexe mit AGP, Hit-Analoga und Aspirin durchgeführt und Rofecoxib. Aus Abb. 6a geht hervor, dass der analoge A3-Komplex eine maximale Anzahl an H-Bindungen im Protein aufwies, wohingegen AGP- und A3-Komplexe im Vergleich zu anderen Analoga die maximale Anzahl an Protein-Ligand-H-Bindungen aufwiesen und positiv waren (Abb. 6b). ). Dies deutet auf eine stärkere und effizientere Bindung des Analogons A3 mit dem AF-COX-2-Protein hin, was gut mit den Ergebnissen der RMSD- und RMSF-Analyse übereinstimmt (Ergänzungstabelle S6).

Grafische Darstellung von MD-Simulationsstudien des nativen COX-2-Proteins und seiner Komplexe mit Aspirin, Rofecoxib, AGP und Hit-AGP-Analoga. (a) Anzahl der H-Bindungen im Protein, (b) Anzahl der H-Bindungen zwischen Protein und Ligand, (c) SAS-Fläche, (d) SAS-Volumen und (e) SAS-Dichte.

SASA, der Bereich einer komplexen Oberfläche, der für ein Wasserlösungsmittel zugänglich ist, wird verwendet, um das Ausmaß der Konformationsvariationen vorherzusagen, die durch die Wechselwirkung zwischen Proteinen und Liganden auftreten. Abbildung 6c zeigt das SASA-Diagramm für alle Trefferanaloga, AGP, neutrale und positive Kontrolle. Es wurde festgestellt, dass der durchschnittliche SASA-Wert für alle erfolgreichen AGP-Analoga zusammen mit AGP höher war als der der neutralen Kontrolle (natives Protein SASA = 273,57 nm2). Im Vergleich zur Positivkontrolle (Rofecoxib- und Aspirinkomplex-SASA = 273,13 bzw. 279,12 nm2) zeigten AGP, A2, A3, A4 und A5 höhere SASA-Werte (dh > 279,12 nm2) (Ergänzungstabelle S9). Unter allen erfolgreichen Analoga und AGP wies A3 den höchsten SASA-Wert = 284,59 nm2 auf. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das A3-Analogon nach der Wechselwirkung einen relativ stabilen Komplex mit dem AF-COX-2-Protein bildet. Darüber hinaus wurde für alle untersuchten Liganden auch das vom Lösungsmittel zugängliche Oberflächenvolumen (Vsas) berechnet, das vom Zentrum einer um das Protein rollenden Lösungsmittelsonde eingeschlossene Volumen, was die Stabilität des komplexen Systems anzeigt83. Typischerweise misst es die Wirkung von Kräften, die von Lösungsmitteln auf die Proteinoberflächen ausgeübt werden, gefolgt von den Protein-Lösungsmittel-Wechselwirkungen. Außerdem ist Vsas eine Alternative zur Verfeinerung des SASA-Begriffs, um den Einfluss der Lösungsmittelwirkung auf das Proteininnere einzubeziehen und auch die Wechselwirkung zwischen Protein und Lösungsmittel zu definieren84. Es handelt sich um eine genaue und schnelle Anwendung zur Untersuchung geometrischer Volumina von Proteinen. Darüber hinaus kann damit das Volumen berechnet werden, das sich aufgrund der Wechselwirkung des Protein-Ligand-Komplexes mit dem Lösungsmittel ändert85. Vsas sorgt zusammen mit SASA für einen besseren Ausgleich impliziter und expliziter unpolarer Lösungsmittelkräfte auf das Protein und dessen Auswirkung auf die Proteinfaltung86. Wie in Abb. 6d und der Ergänzungstabelle S9 gezeigt, zeigten die Analogkomplexe AGP, A3, A4 und A5 einen größeren Vsas-Wert im Vergleich zu allen Kontrollen, während der höchste Wert für den Analogkomplex A3 beobachtet wurde (119,24 nm\s3\n). ). Diese Ergebnisse zeigen, dass das A3-Analogon im Vergleich zu allen anderen Analoga und Kontrollen den stabilsten Komplex mit dem AF-COX-2-Protein bildet. Darüber hinaus wurde die SAS-Dichte, die umgekehrt proportional zur SASA ist, bestimmt, um die Nachbarschaftsdichte vergrabener HYD-Aminosäuren im Proteinkern zu berechnen, die zur Proteinfaltung führt87. Die Nachbarschaftsdichte berechnet die genauen molekularen und atomaren Größen mit Koordinaten für die für Lösungsmittel zugängliche Proteinoberfläche. Es misst nicht nur den hydrophoben Effekt der Aminosäuredichte, sondern erfasst auch den elektrostatischen Effekt des Lösungsmittels auf die Proteinfaltung und -stabilität88. Wie in Abb. 6e und der Ergänzungstabelle S9 gezeigt, besaß das A3-Analogon den niedrigsten Wert der SAS-Dichte, was auf eine bessere Proteinfaltung im Vergleich zu anderen Hit-Analoga und allen Kontrollen nach Interaktion mit AF-COX-2-Protein hinweist. Alle drei lösungsmittelzugänglichen Oberflächenanalysen (Fläche, Volumen und Dichte) legen zusammen einen stärkeren Schwerpunkt auf die MD-Simulationsanalyse im Zusammenhang mit der komplexen Stabilität der Analoga in Bezug auf die Proteinfaltung und zeigten eine höhere Stabilität des Analogons A3 als die anderen untersuchten Verbindungen einschließlich der Referenz Moleküle. Insgesamt kann aus der MD-Simulationsanalyse geschlossen werden, dass das A3-Analogon eine bessere Proteinstabilität aufweist als die anderen Hit-Analoga, AGP, natives Protein, Aspirin und Rofecoxib.

Darüber hinaus wurden die molekularen Wechselwirkungen der Hit-Analoga auch nach der MD-Simulation analysiert (Ergänzende Abbildung S3 und Tabelle S10). Interessanterweise wurde mit Ausnahme von A7 beobachtet, dass die Bindungsstelle für alle Hit-Analoga vor und nach der Simulation konsistent war. Darüber hinaus erwiesen sich die Aminosäurereste Val102, Arg106, Val335, Leu338, Ser339, Tyr341, Leu345, Phe504, Val509, Ala513 und Ser516 vor und nach der Simulation als wichtige Reste, da diese vor und nach der Simulation konsistent sind. Darüber hinaus ergab eine vergleichende Analyse der MD-Simulation vor und nach der MD-Simulation in Aspirin-Protein, dass nach der Simulation zwei hydrophobe Wechselwirkungen (Val509, Ala513) und zwei H-Bindungen (Arg106 und Arg499) gebildet werden, die vor der Simulation drei bzw. eine waren. Im Fall von Rofecoxib wurden nach der Simulation nur drei hydrophobe Wechselwirkungen (Leu338, Tyr371 und Trp373) beobachtet, wohingegen vor der Simulation eine H-Bindung (Rest) und sechs hydrophobe Wechselwirkungen (Rest) festgestellt wurden. Als nächstes zeigte der AGP-Proteinkomplex nach der Simulation sechs hydrophobe Wechselwirkungen ohne H-Bindung, während vor der Simulation drei H-Bindungen mit sechs hydrophoben Wechselwirkungen beobachtet wurden. Dann zeigte der analoge A1-Proteinkomplex nach der Simulation zwei H-Bindungen mit sieben hydrophoben Wechselwirkungen, während vor der Simulation drei H-Bindungen mit fünf hydrophoben Wechselwirkungen gefunden wurden. Der analoge A2-Proteinkomplex zeigte nach der Simulation neun hydrophobe Wechselwirkungen ohne H-Bindungen, während vor der Simulation vier H-Bindungen mit sechs hydrophoben Wechselwirkungen beobachtet wurden. Der analoge A3-Proteinkomplex zeigte nach der Simulation eine H-Bindung mit acht hydrophoben Wechselwirkungen, während vor der Simulation sieben hydrophobe Wechselwirkungen zusammen mit einer H-Bindung beobachtet wurden. Der A4-Proteinkomplex zeigte nach der Simulation eine H-Bindung und sieben hydrophobe Wechselwirkungen, während vor der Simulation drei H-Bindungen mit sechs hydrophoben Wechselwirkungen beobachtet wurden. Der A5-Proteinkomplex zeigte nach der Simulation zwei H-Bindungen und sieben hydrophobe Wechselwirkungen, während vor der Simulation vier H-Bindungen mit fünf hydrophoben Wechselwirkungen auftraten. Der A6-Proteinkomplex zeigte nach der Simulation eine H-Bindung mit vier hydrophoben Wechselwirkungen, während vor der Simulation nur hydrophobe Wechselwirkungen beobachtet wurden. Schließlich zeigte der A7-Proteinkomplex eine H-Bindung mit drei hydrophoben Wechselwirkungen, und vor der Simulation waren hauptsächlich hydrophobe Wechselwirkungen beteiligt (Ergänzungstabelle S10). Insgesamt wurde bei der Vergleichsanalyse beobachtet, dass die Hit-Analoga mit Ausnahme von A7 in der Nähe der durch die molekulare Docking-Analyse identifizierten Bindungsstelle bleiben, was auf die effiziente Bindungsstabilität des Komplexes der Hit-Analoga mit AF-COX-2 hinweist. Außerdem behielten die analogen A1-, A3- und A5-Komplexe ihre Konsistenz vor und nach der Simulation bei.

Die EPE-Karten beschreiben die Verteilung der Elektronen auf der Moleküloberfläche, die HOMO- und LUMO-Energie der Moleküle. In dieser Studie haben wir EPE, HOMO und LUMO der ausgewählten Sequenz des AF-COX-2-Proteins und seines Addukts mit AGP, Hit-AGP-Analoga, nativem Protein, Aspirin und Rofecoxib berechnet. Anschließend wurde die Bindungsenergie des Addukts berechnet, wobei ein negativerer Wert der Bindungsenergie auf die höhere Stabilität des Protein-Ligand-Komplexes hinweist89. Für diese Studie wurden Aspirin, Rofecoxib, AGP und A1–A7 AGP-Analoga als Liganden ausgewählt, während die Proteinsequenzen von 511 bis 520 Aminosäuren von AF-COX-2, d. h. Val511, Gly512, Ala513, Pro514, Phe515, Ser516 , Leu517, Lys518, Gly519, Leu520 wurden als Peptid für die Docking-Simulationsstudie durch Berechnung von EPE35 ausgewählt. Später wurde festgestellt, dass die berechneten Bindungsenergiewerte der Addukte im Bereich von − 53,81 kcal/mol (A3) bis − 34,53 kcal/mol (Aspirin) lagen (Tabelle 5). Darüber hinaus zeigten alle AGP- und alle sieben Analoga eine geringere Bindungsenergie als Rofecoxib und Aspirin, während der niedrigste Bindungsenergiewert für A3 beobachtet wurde, was auf den stabilsten Protein-Ligand-Komplex schließen lässt.

Die freie Bindungsenergie der interagierenden Hit-AGP-Analoga AGP, Aspirin und Rofecoxib an das AF-COX-2-Protein wurde mit der MM/GBSA-Methode für die Vorher-Nachher-Simulationsanalyse berechnet. Die Ergebnisse zeigten, dass es einen geringfügigen Unterschied zwischen dem MM/GBSA-Score vor und nach der Simulationsanalyse gibt (Abb. 7). Aus Abb. 7 ist außerdem ersichtlich, dass das A3-Analogon unter allen untersuchten Verbindungen die negativste freie Bindungsenergie (vor der Simulation = – 55,37 kcal/mol und nach der Simulation = – 56,25 kcal/mol) in Bezug auf MM aufwies /GBSA weist auf eine starke Wechselwirkung mit dem AF-COX-2-Protein hin. Es wurde festgestellt, dass der MM/GBSA-Score in der absteigenden Reihenfolge der Bindungsaffinität A3 > A1 > A5 > Rofecoxib > A2 > A4 > A6 > A7 > AGP > Aspirin liegt. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass alle erfolgreichen AGP-Analoga zusammen mit AGP einen negativeren Wert der freien Energie im Vergleich zu Aspirin aufwiesen, wohingegen die Analoga A3, A1 und A5 eine bessere Bindungsaffinität zeigten als Rofecoxib, Aspirin, AGP und andere Analoga . Darüber hinaus wurde beobachtet, dass die Analoga A3, A1 und A5, die mit Protein komplexieren, nach der Simulationsanalyse stabiler waren, was auch darauf hindeutet, dass das Analogon A3 im Vergleich zu den Referenzverbindungen und anderen untersuchten Analoga eine bessere Bindung an das COX-2-Protein zeigte. Die MM/GBSA-Ergebnisse bestätigten auch die Ergebnisse des Dockings, der MD-Simulation und der DFT-Analyse und belegen, dass das A3-Analogon eine vielversprechende Verbindung zur Hemmung der AF-COX-2-Aktivität wäre und als vielversprechendes natürliches entzündungshemmendes Mittel eingesetzt werden kann Arzneimittel.

Der MM/GBSA-Energiescore von Rofecoxib (1), Aspirin (2), AGP (3) und ausgewählten Analoga A1–A7 (4–10) vor und nach der MD-Simulation.

Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse, dass das Andrographolid-Analogon A3 das wirksamste und wirksamste pflanzliche natürliche Arzneimittelmolekül gegen das COX-2-Protein ist. Die Wirksamkeit dieses Analogons wurde mit anderen natürlichen Verbindungen sowie synthetischen Verbindungen zur COX-2-Hemmung verglichen. Die Bindungsenergie für A3 betrug laut Docking-Analyse −8,56 kcal/mol, was besser ist als bei nativen Kokosnussölderivaten (BE-Bereich für die Derivate: −5,65 kcal/mol bis −7,58 kcal/mol), Alliin (−4,90 kcal). /mol), Pinoresinolm (− 8,38 kcal/mol) und Syringaresinol (− 8,23 kcal/mol)90,91,92,93. Darüber hinaus wurden eine MD-Simulation sowie eine EPE-Docking-Simulationsanalyse für die komplexe Stabilität von A3 durchgeführt. Darüber hinaus belegen die detaillierten Ergebnisse der vergleichenden Analyse mit den Referenzverbindungen, dass das identifizierte Analogon A3 ein wirksamer wirkstoffähnlicher Kandidat gegen das COX-2-Protein wäre. Nach unserem besten Wissen wurde das Andrographolid-Analogon A3 bisher nicht auf seine entzündungshemmende Wirkung durch Hemmung von COX-2 untersucht. Daher liefert die vorliegende Arbeit eine Grundlage für die Entwicklung des Andrographolidanalogs A3 als potenziellen entzündungshemmenden, arzneimittelähnlichen Kandidaten, der über COX-2-Hemmung wirkt. Obwohl wir eine Vielzahl chemischer Informatikinstrumente zur Identifizierung und Validierung des A3-Analogs als potenziellen COX-2-Inhibitor eingesetzt haben, ist eine weitere experimentelle Authentifizierung seitens der wissenschaftlichen Gemeinschaft erforderlich, um den Arzneimittelentwicklungsprozess zu beschleunigen.

In der vorliegenden Studie wurde ein vielversprechender pflanzlicher entzündungshemmender Wirkstoff gegen COX-2 mithilfe eines kombinierten rechnerischen Ansatzes einschließlich molekularer und Quanten-Docking-Simulationsstudien identifiziert. Eine validierte, vollständig sequenzierte Struktur des menschlichen AF-COX-2-Proteins wurde für das Mehrfachsequenz-Alignment verwendet, um die Reste des aktiven Zentrums für die entzündungshemmende Aktivität herauszufinden. Das virtuelle Screening von 237 AGP-Analoga gegen das AF-COX-2-Protein, gefolgt von interaktiven Docking-Studien, führte zu einem Screening von 7 erfolgreichen AGP-Analoga, die ihre arzneimittelähnliche Eignung auch in der ADMET-Vorhersageanalyse zeigten. Darüber hinaus belegten Ligandeneffizienzmetriken und DFT-Deskriptoren, also HOMO, LUMO, HLG und EPE, ihre gute chemische Reaktivität. Darüber hinaus ergaben MD-Simulationen, EPE-Docking-Simulationen und MM/GBSA-Studien, dass das A3-Analogon (3-[2-[(1R,4aR,5R,6R,8aR)-6-hydroxy-5,6,8a-trimethyl- 2-Methyliden-3,4,4a,5,7,8-Hexahydro-1H-naphthalin-1-yl]ethyliden]-4-hydroxyoxolan-2-on) bildet den stabilsten Komplex mit dem AF-COX-2 und wäre ein vielversprechendes natürliches entzündungshemmendes Mittel. In naher Zukunft sind weitere experimentelle Validierungen erforderlich, um diese Ergebnisse zu untermauern.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten. Zusätzliche Rohdaten oder Datensätze, die während der aktuellen Studie generiert und/oder analysiert wurden, sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken der Leitung des Vellore Institute of Technology, Vellore, für die Bereitstellung der Einrichtungen zur Durchführung dieser Arbeit.

School of Biosciences and Technology, Vellore Institute of Technology, Vellore, Tamil Nadu, 632014, Indien

Priyanka Jain & C. Sudandiradoss

Zentrum für Nanobiotechnologie, Vellore Institute of Technology, Vellore, Tamil Nadu, 632014, Indien

Jitendra Satija

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PJ: Konzeptualisierung und Design der Studie. Computeranalyse und Schreiben des ersten Entwurfs. Dr. CSD: Konzeptualisierung, Überwachung, Datenkuratierung, Überprüfung und Bearbeitung. JS: Konzeptualisierung, Überprüfung und Bearbeitung. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit C. Sudandiradoss.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Jain, P., Satija, J. & Sudandiradoss, C. Entdeckung des Andrographolid-Hit-Analogs als wirksamer Cyclooxygenase-2-Inhibitor durch Konsens-MD-Simulation, elektrostatische Potentialenergiesimulation und Ligandeneffizienzmetriken. Sci Rep 13, 8147 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35192-7

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Eingegangen: 10. November 2022

Angenommen: 14. Mai 2023

Veröffentlicht: 19. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35192-7

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