Einfluss einer transienten Funkenplasmaentladung auf die Herstellung hoher Molekularmassen chemischer Produkte aus l

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 2059 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Kalte Atmosphärendruckplasmen gelten in vielen Forschungsbereichen als zukunftsweisende Methode. Neben plasmabehandelten Biomaterialien hat auch die Plasmamodifikation von Biomolekülen große Aufmerksamkeit erhalten. Daher haben wir in dieser Arbeit eine TSP-Entladung (Transient Spark Plasma) betrieben, um deren Wirkung auf die chemische Struktur von L-Cystein zu untersuchen. Der TSP war in einer Pin-zu-Ring-Elektrodenanordnung konfiguriert und wurde von Ar-Gas durchströmt. Wir haben auch die Wirkung von zwei Chemikalien untersucht; Dimethylsulfoxid (DMSO) und Wasserstoffperoxid (H2O2) mithilfe der Sprudelmethode, um zu zeigen, wie sie die Entstehung neuer chemischer Bioprodukte verändern können. Ultraviolett-sichtbare Absorptionsspektroskopie, Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie und Flüssigkeitschromatographie-Massenspektroskopie wurden verwendet, um Änderungen in den chemischen Bindungen der Cysteinstruktur zu untersuchen und die Entstehung neuer Biomoleküle darzustellen. Basierend auf den gezeigten Ergebnissen spielten im Plasma erzeugte reaktive Spezies eine große Rolle in der chemischen Struktur des Cysteins. Durch die Zugabe von DMSO und H2O2 in das Plasma entstanden neue Produkte und durch die gleichzeitige Zugabe von DMSO und H2O2 entstand das schwerste Biomolekül. Die Ergebnisse sagten auch voraus, dass einige chemische Produkte und Aminosäuren mit einer höheren Molekularmasse aus dem Polymerisationsprozess der Cysteinlösung entstehen. Der starke Oxidationsprozess ist für die schweren chemischen Verbindungen verantwortlich.

Die einzigartige Fähigkeit von kaltem Atmosphärendruckplasma, in vielen Bereichen, insbesondere in der Plasmamedizin, eine große Vielfalt reaktiver Spezies zu produzieren, wurde von vielen Forschern berücksichtigt. Die Inaktivierung von Bakterien und Viren1,2, die Wundheilung3,4, Hautkrankheiten5,6 und verschiedene Arten von Krebserkrankungen7,8,9,10 gehören zu den interessanten Themen, die mit kaltem Atmosphärendruckplasma behandelt werden. Bisher wurden verschiedene experimentelle Plasmakonfigurationen11,12 des Atmosphärendruck-Plasmastrahls (APPJ)13,14,15,16 und der dielektrischen Barrierenentladung (DBD)17,18,19 entwickelt und verbessert, um ein bestimmtes Ziel zu erreichen. Die Änderung verschiedener Parameter wie Spannung, Strom, Frequenz, Entladungsstrecke und Art des zugeführten Gases kann eine wichtige Rolle bei der Bildung der Menge und Art der reaktiven Spezies spielen. Bei der Untersuchung plasmamedizinischer Anwendungen konzentrieren sich Forscher auf biologische Systeme. Ihr Ziel war es, die Wechselwirkungen zwischen biologischen Proben und Plasma mithilfe von Simulations- und experimentellen Methoden zu verstehen20,21,22. Organische Systeme wie Proteine ​​– sogenannte komplexe biologische Systeme – werden von verschiedenen Plasmaentladungen betrachtet. Da Menge und Art der im Plasma erzeugten reaktiven Spezies bei der Behandlung sehr wirksam sind, haben Wissenschaftler die Wirkung unterschiedlicher Plasmakonfigurationen auf Aminosäuren untersucht, die die Hauptbestandteile von Proteinen sind. Bereits 2014 untersuchten Takai et al.23 die Wirkung eines Plasmastrahls auf 20 Aminosäuren und berichteten über die Veränderungen an 14 Aminosäureseitenketten. Im Jahr 2016 rüsteten Zhou et al.24 das Plasmastrahlsystem auf eine höhere Anzahl von Mikroplasmastrahlen um, um zu zeigen, wie Plasma die Strukturen des Proteins beeinflusst. Einige Jahre später stellten Wende et al. und Sremacki et al. verwendeten jeweils einen kINPen-Plasmastrahl25 und einen RF-Plasmastrahl gekoppelt mit einem Aerosolsystem26, um Plasma-Flüssigkeits-Wechselwirkungsprozesse und ihre Wirkung auf die Cystein-Aminosäure zu untersuchen. Darüber hinaus haben Lackmann et al. verwendeten zwei Plasmaquellen, um zu zeigen, dass die Ergebnisse der chemischen Eigenschaften für jede Plasmaquelle unterschiedlich sind27. Im Jahr 2014 wurde von Li et al.28 ein Plasmagerät mit dielektrischer Barrierenentladung (DBD) entwickelt, um verschiedene Mechanismen der Zersetzungsprodukte der Valinaminosäure zu untersuchen. Auch andere Forscher zeigten, dass Faktoren wie Behandlungszeit und Lösungskonzentration die Qualität der Modifikation beeinflussen können29. Interessanterweise gelten schwefelhaltige Aminosäuren als gutes Ziel. Es scheint, dass sie durch Plasmabehandlung stärker als andere chemische Veränderungen erfahren. Wie bereits erwähnt, besteht die wichtigste Eigenschaft kalter Atmosphärendruckplasmen darin, dass sie hochreaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies (RONS) erzeugen können, die nahe der Raumtemperatur bleiben. Daher eignen sie sich für biologische Systemmodifikationen. Es fällt auf, dass die Wechselwirkung zwischen Plasma und wässrigem Medium für viele Anwendungen, insbesondere biologische Systeme, essentiell ist. Lebende Organismen enthalten Wasser und deshalb ist die Untersuchung der Plasma-Flüssigkeits-Wechselwirkung von entscheidender Bedeutung30,31,32. Auf diese Weise haben sich Wissenschaftler auf plasmaaktiviertes Wasser (PAW) konzentriert33,34. Die Behandlung über oder unter der Wasseroberfläche durch Einwirkung von Plasma35,36 wandelt Wasser in ein aktives Medium mit vielen reaktiven Spezies um. Die Wechselwirkung von aus dem Plasma stammenden Radikalen und Partikeln mit Wassermolekülen führt zu verschiedenen chemischen Reaktionen. Tatsächlich kommt es durch das Einfangen energiereicher Spezies und Partikel aus der Plasmaphase in der wässrigen Flüssigkeit zu vielen neuen chemischen Reaktionen an der Gas-Flüssigkeits-Grenzfläche, die dann zur Entstehung vieler anderer reaktiver Partikel führen, die sich in Wasser auflösen37,38. Zu diesen reaktiven Spezies können reaktive Sauerstoff- oder Stickstoffspezies wie Flüssigphasenspezies (H2O2, NO2–, NO3–, ·OH, ONOOH, ONOO–) und (NO, NO2, O3, atomares O, NO, NO2, N2O, HNO2) gehören , HNO3, O2–, 1O2)39,40,41,42,43. Unter den verschiedenen Arten kalter Atmosphärendruckplasmen ist die transiente Funkenplasmaentladung (TSP) aufgrund ihrer hohen Elektronendichte sehr nützlich. TSP-Entladungen werden als gleichstromgetriebene Selbstimpulse mit einer Wiederholungsfrequenz zwischen 1 und 10 kHz und typischerweise kurzen Stromimpulsen (10–100 ns) bezeichnet44. Diese Art der Plasmaentladung besteht aus einer Vielzahl von Streamern, in deren Köpfen sich ein elektrisches Feld von nahezu 200 kV/cm befindet, das in kurze Funkenstromimpulse umgewandelt werden kann. Diese Eigenschaft von TSP-Entladungen ermöglicht die einfache Durchführung von Ionisierung und effektiven chemischen Prozessen45,46.

Kalte Atmosphärendruckplasmen, insbesondere in medizinischen Bereichen, werden zu Instrumenten zur Bekämpfung verschiedener Krebsarten47,48 und Wunden49, neben den großen Auswirkungen auf zelluläre Signalprozesse und chemische Modifikationen von Biomolekülen50. Zusätzlich zur Verwendung von kaltem Plasma zur Inaktivierung von Bakterien, zum Zelltod in geschädigtem Gewebe und zum Abbau von Biomolekülen; Seine Wirkung auf die Zellaktivität und die Verbesserung der chemischen Strukturen von Proteinen und Aminosäuren werden hoch geschätzt. Wie oben erwähnt, untersuchten viele Wissenschaftler die Wirkung kalter Plasmen auf verschiedene Aminosäuren als Hauptbestandteile von Proteinen und beobachteten Ergebnisse, die auf chemische Veränderungen in den Aminosäurestrukturen durch die Anknüpfung neuer Bindungen51,52 unter Plasmabehandlungen hindeuten. Um die Polymerisationsprozesse von Aminosäuren im Rahmen von Plasmabehandlungen zu verbessern und zu erweitern, sollte daher die Optimierung verschiedener Plasmaparameter stärker untersucht werden.

Ziel dieser Studie ist es, den Einfluss von TSP auf die Aminosäurestruktur von Cystein zu untersuchen. Untersucht wird die Herstellung hoher Molekülmassen aus Monomeren unter Berücksichtigung verschiedener Parameter. Ein Mangel an Cystein in unserem Körper kann zu einigen Störungen führen, wie z. B. einer Beeinträchtigung der antioxidativen Abwehr, einer verminderten Fähigkeit, Medikamente oder toxische Verbindungen zu verstoffwechseln, einer verminderten Immunfunktion, Psychosen und Homocystinurie. Darüber hinaus wird es derzeit in einigen Medikamenten verwendet, oder die N-Acetyl-L-Cystein-Aminosäure – eine modifizierte Cystein-Aminosäure – ist jetzt als Medikament auf dem Markt erhältlich. Daher haben wir vorhergesagt, dass plasmaaktiviertes Cystein in den Bereichen Biomedizin und Arzneimittelverabreichung von großem Interesse sein könnte.

Die Erzeugung neuer Biomoleküle mit unterschiedlichen m/z-Werten hängt direkt von der Menge der aus dem Plasma stammenden Spezies ab. Zu diesem Zweck haben wir einen TSP-Aufbau entwickelt, der eine Pin-zu-Ring-Elektrode umfasst, um ein dichtes Plasma zu erzeugen. Allerdings kommt es bei der Plasmabehandlung häufig zu einem Abbauprozess. Wir haben uns auf die Hinzufügung neuer chemischer Bindungen konzentriert, um die Polymerisationsprozesse zu verbessern. Die Anwendung chemischer Materialien wie Wasserstoffperoxid (H2O2) – wegen seiner Fähigkeit, reaktive Radikale zu erzeugen – und Dimethylsulfoxid (DMSO) – wegen seiner Fähigkeit, Schwefelatome zu enthalten – zum Plasma wurde ebenfalls untersucht, um zu zeigen, wie Zusätze zum Plasma die Produktion chemischer Biomoleküle verändern können . Durch die Zugabe dieser Materialien wollten wir ein dichtes Plasma erzeugen, das reaktivere Spezies enthält, die bei Polymerisationsprozessen sehr effektiv sein können. Ein großes Volumen an RONS, das in der Gas-, Flüssigkeits- und Gas-Flüssigkeits-Grenzfläche erzeugt wurde, führte zur Bildung verschiedener Arten neuer Moleküle mit größeren Molekülmassen. Der Dampf dieser Materialien wurde durch das Blasenverfahren in das System injiziert und führte zur Bildung neuer chemischer Makromoleküle. Darüber hinaus erhöht sich durch den Überoxidationsprozess und die lange Behandlungszeit die Produktionsrate reaktiver Spezies, was den Polymerisationsprozess und die Entstehung neuer chemischer Bioprodukte unterstützen kann. Unser Ziel war es, die Art der im Plasma produzierten Biomoleküle zu kontrollieren, damit wir durch den Oxidationsprozess von Cystein Kombinationen mehrerer Aminosäuren zu einer langen Kette erzeugen können, um eine vollständige Peptidkette zu bilden. Außerdem wollen wir in den nächsten Studien plasmaaktivierte Medikamente mit Aminosäuren im biologischen Bereich einsetzen. Diese Studie hat im Allgemeinen grundlegende Daten auf diesem Gebiet geliefert und es müssen noch viele weitere Studien und Experimente durchgeführt werden, um Peptide mit TSP-Behandlung zu erzielen.

Ein Schema des Versuchsaufbaus ist in Abb. 1 dargestellt. Diese Plasmaquelle besteht aus zwei Elektroden: einer Ringelektrode aus Kupfer mit einem Durchmesser von ca. 4 cm und einer Nadelelektrode aus Wolfram mit einem Durchmesser von 0,8 mm und einer flachen Spitze. Die Nadelelektrode wurde mit einer Gleichstromversorgung versorgt und ihr Abstand war mit einer Schraube einstellbar. Die Ringelektrode war geerdet. Unser hausgemachtes Gleichstromnetzteil reicht von 0 bis 20 kV mit einer festen Spannung von ~ 14 kV für Ar und ~ 9 kV für Ar + DMSO, Ar + H2O2 + DMSO und einer Frequenz von 300 Hz. Darüber hinaus haben wir im Verbindungspfad der Elektrode zur Stromversorgung einen 10-MΩ-Widerstand verwendet.

Ein schematisches Diagramm der TSP-Entladung.

Zur Steuerung des Zufuhrgasflusses wurden ein Massendurchflussregler (Sevenstar D07-19B) und eine Durchflussanzeigebox (Sevenstar D08-1F) verwendet, um 2 SLM Ar-Gas einzuspeisen. Der Abstand der Nadelspitze zur Wasseroberfläche wurde auf ~ 2 cm eingestellt. Im nächsten Schritt unserer Experimente, wie in Abb. 1 dargestellt, strömt das zugeführte Gas durch einen H2O2-Ballon und dann durch einen DMSO-Ballon mit einem Durchfluss von 5 SLM. Abschließend wurde das erzeugte Plasma direkt auf die Aminosäure-haltige Lösung aufgetragen.

Wir stellten Cystein (L-Cystein Merc 30.089 (≥ 98,5 %)) in kristalliner Form zur Verfügung und stellten unter Verwendung von destilliertem Wasser eine Lösung von Cystein durch Konzentration in 10 mM her. Bei jeder Behandlung wurden 4 ml der Lösung Plasma ausgesetzt. Dimethylsulfoxid (DMSO; 99,9 % C2H6SO; M = 78,13 g/mol; Dichte = 1,1 g/cm3) als Organoschwefelverbindung und Wasserstoffperoxid (H2O2; 35 %; M = 34,01 g/m; Dichte = 1,45 g/cm3) wurden in unseren Experimenten verwendet. Die Plasmaexpositionszeit wurde mit 10 Minuten in Betracht gezogen. Nach den Behandlungen wurden unbehandelte und behandelte Proben für die Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR)-Analyse und die Flüssigkeitschromatographie-Massenspektroskopie (LCMS/MS) verwendet. Darüber hinaus wurden pH-Messungen und Ultraviolett-Vis-Analysen (UV-Vis) durchgeführt.

Für physikalische Messungen wurde ein digitales pH-Meter (PET-103, Atron, Deutschland) zur Messung des pH-Wertes verwendet. Es wurde ein UV-Vis-Spektrometer (UV-6100; M&A INSTRUMENTS INC, USA) im Wellenlängenbereich von 190–400 nm verwendet. Zum Vergleich der unbehandelten Probenspektren und aller anderen plasmabehandelten Proben nach 10-minütiger TSP-Behandlung wurde eine FTIR-Analyse (Thermo, AVATAR, USA) im Bereich von 400–4000 cm−1 zur Charakterisierung der funktionellen Gruppen der Aminosäure und durchgeführt Neue Produkte. Schließlich wurde zur Erkennung neuer chemischer Produkte LCMS/MS unter Verwendung eines Massenspektrometers (ein Agilent 6410 Triple-Quad, Santa Clara, CA, USA) verwendet, das mit einem positiven Ionenmodus der Elektrospray-Ionisationsschnittstelle ausgestattet ist.

Die im Transmissionsmodus betriebene FTIR-Analyse (Thermo, Nicolet Nexus 870 ESP FT-IR) wurde im Bereich von 400–4000 cm−1 mit einer Auflösung von 4 cm−1 durchgeführt, um die funktionellen Gruppen der Aminosäure und neuer Produkte zu charakterisieren . Um eine gleichbleibende Reinstwasserqualität zu erzeugen, wurde ein Milli-Q-Wasseraufbereitungssystem (Widerstand 18,2 MΩ) verwendet. Die Analyse wurde auf Basis des CSL-Strahlteilers durchgeführt. Darüber hinaus wurde zum Nachweis neuer biochemischer Moleküle LCMS/MS unter Verwendung eines Massenspektrometers (ein Agilent 6410 Triple-Quad, Santa Clara, CA, USA) verwendet, das mit einem positiven Ionenmodus der Elektrospray-Ionisationsschnittstelle ausgestattet war. Für die LC-Trennung wurde ein UHPLC-System mit einer binären Pumpe (Agilent Series 1200, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA), einem automatischen Probengeber und einem Vakuumentgaser verwendet. Die Trennung erfolgte auf einer Umkehrphasen-Analysesäule C18 mit schneller Auflösung (RR Zorbax Eclipse XDB-C18) anhand der Partikelgröße, des Innendurchmessers und der Länge von 1,8 μm, 4,6 mm bzw. 50 mm. Für die mobilen Phasen A und B wurde Wasser mit 0,1 % Ameisensäure und Acetonitril verwendet. Bei der chromatographischen Methode blieb die anfängliche Organisation der mobilen Phase (10 % B) 1 Minute lang konstant, dann folgte nach 11 Minuten ein linearer Gradient auf 100 % B. Schließlich bewegte sich 100 % B 4 Minuten lang mit einer Flussrate von 0,6 ml/min durch die Säule. Die Massenspektroskopieanalyse wurde mit einem Agilent 6410 Triple-Quad-Massenspektrometer (Agilent Technologies Series 1200, Santa Clara, CA, USA) durchgeführt. Das Gerät war mit Elektrospray-Ionisation (ESI) im positiven Ionenmodus ausgestattet (Stickstoff als Zerstäuber und Kollisionsgas, eine Kapillarspannung von 5000 V, Gasfluss und Temperatur: 12 L min−1; 325 °C und Zerstäubergas: 50). psig). Darüber hinaus wurde die Agilent Mass Hunter-Software zur Datenverarbeitung und zur Ermittlung maximaler Intensitäten, Kollisionsenergien und Kegelspannungen von zwei MRM-Übergängen verwendet, die mit einem kontinuierlichen Fluss einer Standardinjektion optimiert wurden.

Die pH-Werte der unbehandelten Cysteinlösung sowie anderer behandelter Proben mit unterschiedlichen Plasmen sind in Abb. 2a dargestellt. Der pH-Wert sank nach TSP-Behandlungen dramatisch. Erstens zeigte mit Ar-Plasma behandeltes Wasser ohne Cystein einen niedrigeren pH-Wert als unbehandelte Cysteinlösung (von 4,62 auf 4,10 gesunken). Zweitens erreichte der pH-Wert der Cysteinlösung nach der Plasmaexposition mit Ar + DMSO die Hälfte des Wertes der unbehandelten Probe und erreichte pH = 2,31. Ohne DMSO betrug dieser Wert etwas mehr als die Hälfte (pH = 2,45). Schließlich führte die Zugabe von H2O2 und DMSO zu einem Minimalwert von pH = 2,14. Dies bedeutet, dass sich die Lösung unter dem Einfluss von Ar + H2O2 + DMSO-Plasma in ein saureres Medium verändert hat als bei anderen plasmabehandelten Proben.

(a) Vergleich des pH-Werts einer unbehandelten Cysteinlösung mit verschiedenen plasmabehandelten Proben und (b) UV-Vis-Absorptionsspektren von Cysteinlösung und verschiedenen Arten von TSP-behandeltem Cystein.

Abbildung 2b zeigt das vergleichende UV-Vis-Spektrum von unbehandelten und plasmabehandelten Cysteinlösungen. Laut Szili et. Die UV-Absorption von al53 trägt zu den wichtigsten langlebigen reaktiven Spezies wie NO2–, NO3– und H2O2 bei. Eine erhöhte Schulter bei 230–330 nm trägt zur H2O2-Konzentration bei, wohingegen eine erhöhte Intensität im Peak bei 190–250 nm zur NO2–- und NO3–-Konzentration beiträgt. Wie man sieht, führte die Zugabe von H2O2 zum Plasma zu einer hohen H2O2-Konzentration. Darüber hinaus tolerieren verwandte Peaks von NO2– und NO3– nach verschiedenen Plasmabehandlungen höhere Intensitäten, die wiederum für Ar + H2O2 + DMSO-Plasma am höchsten waren54,55. Schließlich ist aus Abb. 2b ersichtlich, dass die Absorption von NO2– und NO3– sowie H2O2 in mit Ar-Plasma behandeltem Wasser ohne Cystein geringer ist als die der mit Ar-Plasma behandelten Cysteinprobe. Dies weist darauf hin, dass die Rolle von NO2– und NO3– sowie H2O2 bei der Absorption bei den neuen Produkten der mit Ar-Plasma behandelten Cysteinproben gering ist.

Interessanterweise wurde auch eine Rotverschiebungstendenz in allen Fällen der Plasmabehandlung beobachtet (Ar + H2O2 + DMSO > Ar + DMSO > Ar). Laut Ankireddy et. Al.56, die Ursache für den rotverschobenen modifizierten Peak könnte in der Bildung von n-π*-Übergängen liegen. Die Lösung verringert den Energiezustand der aus dem Plasma stammenden angeregten Elektronen und der rotverschobene Effekt nimmt durch eine Erhöhung der Lösungspolarität zu. Durch die Zugabe von DMSO und H2O2 durch das Ar-Plasma hat die genannte Wellenlänge eine größere Wellenlänge durchlaufen, was zeigt, dass es eine größere Anzahl der genannten Spezies enthält als andere.

Für die molekularen Strukturen und funktionellen Gruppen von Aminosäuren gilt die FTIR-Analyse als nützliches Werkzeug. Wir untersuchten FTIR-Spektrenänderungen im Bereich von 400–4000 cm−1, um zu zeigen, wie sich verschiedene Plasmen auf die Cysteinlösung auswirken. Alle Spektren wurden mithilfe der folgenden Formel von Transmissionsspektren in Absorptionsspektren umgewandelt:

Abbildung 3 vergleicht die FTIR-Spektren von unbehandelten und mit Ar-Plasma behandelten Proben mit und ohne Anwesenheit von DMSO und H2O2. Bei allen behandelten Proben kam es in Gegenwart von Plasma zu Veränderungen in der Position und Intensität der Peaks.

FTIR-Spektren von (a) mit Ar-Plasma behandeltem Wasser ohne Cystein, (b) unbehandelter Cysteinlösung und plasmabehandelter Cysteinlösung mit (c) Ar-Plasma, (d) Ar + DMSO-Plasma und (e) Ar + H2O2 + DMSO Plasma. (Hervorgehobene Bereiche zeigen erscheinende oder verschwindende Bindungen von (grün) C–H, (gelb) S–H, (blau) COO–, (rosa) S–S und S–O).

Im Bereich von 2000–4000 cm−1 treten mehrere Bindungen auf, wie z. B. O-H (3369 cm−1) Hydroxylgruppen-Streckschwingungen in Carboxylgruppen, N-H (3243 cm−1) Streckschwingungen der Amin-NH2-Funktionsgruppe in unbehandelten Cysteinlösung57, C–H (3149 cm–1), vibrationsaliphatisches C–H (2923 cm–1) für geladenes Amin – NH3+58, S–H-Thiolgruppe (2553 cm–1) Thiolgruppe wurden für unbehandeltes Cystein nachgewiesen . Die S-H-Bindung als charakteristischer Cystein-Peak verschwand in plasmabehandelten Lösungen. Einige der erwähnten Bindungen waren in den mit Plasma behandelten Fällen leicht verschoben. Auch chemische Bindungen im Bereich von 400–1800 cm−1 zeigten mehrere Veränderungen. Asymmetrische und symmetrische Streckschwingung von COO– (1608 cm–1 und 1390 cm–1). Diese Bindungen änderten sich ebenfalls auf 1604 cm–1 und einen hochintensiven Peak von 1386 cm–1 in der mit Ar-Plasma behandelten Probe und nahmen nach der Zugabe dramatisch ab DMSO und H2O259,60,61. Die CS-Bindung (595–830 cm−1)62,63 wurde ebenfalls nachgewiesen. Nach Zugabe von DMSO und H2O2 wurden neue Peaks bei (1191 cm−1), (1002 cm−1) und (943 cm−1) entdeckt, die sich jeweils auf S=O, S–O und S–S beziehen. Neue Peaks von (516 cm−1) in Ar + DMSO und (520 cm−1) in Ar + H2O2 + DMSO wurden ebenfalls hinzugefügt. Diese Peaks trugen durch eine stärkere Intensität im Ar + DMSO-Plasma zur S-S-Bindung bei und ihre Absorption nahm nach Zugabe von H2O2 in Ar + H2O2 + DMSO ab.

Die Intensität einer Absorptionsbindung hängt von der Polarität der Bindung ab. Damit zeigt eine Bindung mit höherer Polarität eine intensivere Absorptionsbindung. Die Intensität hängt auch von der Anzahl der für die Absorption verantwortlichen Bindungen ab. Darüber hinaus könnte das Dipolmoment aufgrund der chemischen Wirkung der Plasmabehandlung von Cystein mit hoher Elektronendichte der Grund für die leichte Verschiebung der Gesamtfrequenzen sein64,65. Mit anderen Worten: Änderungen in der Elektronenverteilung und im Hybridisierungszustand führen zu der Position der Peaks. Im FTIR deuten die Änderungen der Peakintensität und -position normalerweise auf Änderungen der Molekülbindungen und funktionellen Gruppen hin, die einige Komplexe erzeugen. Dadurch wird bestätigt, dass der Polymerisationsprozess stattgefunden hat.

Die massenspektroskopische Analyse wurde mit einem Agilent 6410 Triple-Quad-Massenspektrometer (Agilent Technologies Series 1200, Santa Clara, CA, USA) durchgeführt und ein UHPLC-System wurde verwendet, um etwaige Veränderungen in der chemischen Struktur von Cystein zu untersuchen.

Abbildung 4 zeigt die Massenspektren unbehandelter und behandelter Proben. Wie bei allen behandelten Cysteinen zu sehen ist (Abb. 4c – e), werden im Vergleich zu unbehandelten Biomolekülen viele neue Biomoleküle nachgewiesen (Abb. 4a). Die Cysteinhäufigkeit basierend auf dem Balkendiagramm in Abb. 5 folgte Roh > Ar > Ar + H2O2 + DMSO > Ar + DMSO. Dies bedeutet, dass Ar + DMSO-Plasma den größten Einfluss auf die Umwandlung von Cystein in andere Moleküle hatte. Allerdings hatten auch andere Arten von Plasmen einen großen Einfluss auf die Produktion neuer Biomoleküle.

Massenspektren von (a) unbehandeltem Cystein, (b) mit Ar-Plasma behandeltem Wasser ohne Cystein und TSP-abgeleiteten Biomolekülen aus behandeltem Cystein mit (c) Ar-Plasma, (d) Ar + DMSO-Plasma, (e) Ar + H2O2 + DMSO .

Vergleich der Cysteinhäufigkeit in der unbehandelten Probe mit den anderen drei Plasmen mit Ar als Speisegas.

Diese Peaks sind in Tabelle 1 basierend auf ihren m/z-Werten aufgezeichnet und ihre vorhergesagten chemischen Strukturen sind in den Zusatzinformationen verfügbar. Obwohl in allen drei Fällen von behandeltem Cystein einige Peaks mit der gleichen Molekularmasse beobachtet wurden, ist die Häufigkeit dieser Produkte in jedem Fall unterschiedlich (Abb. 6). Darüber hinaus werden bei jeder Plasmabehandlung, die bei der Ar + H2O2 + DMSO-Plasmabehandlung am häufigsten vorkam, einige einzigartige chemische Produkte erzeugt. Neben dem Verkettungsprozess zur Bildung von Makromolekülen führte jede Behandlung zu einem Abbau und der minimale m/z-Wert wurde für die Ar-Plasmabehandlung beobachtet (m/z = 50 Da). Die in allen drei Behandlungen beobachteten Peaks zeigten mit Ausnahme von (m/z = 347 Da und 102 Da) die höchste Häufigkeit als Ergebnis der Ar + DMSO-Behandlung. Interessanterweise führte die Plasmabehandlung mit Ar + H2O2 + DMSO zur Erzeugung des größten Produkts von fast 1 kDa (m/z = 947 Da; C25H38N8O15S8), was möglicherweise auf die größere Menge an RONS-Spezies zurückzuführen ist.

Häufigkeitsvergleich von m/z = (a)794 Da, (b)405 Da, (c)347 Da, (d)336 Da, (e)102 Da, (f)77 Da.

Die 3D-Strukturen der schwersten chemischen Produkte (m/z = 925 Da; C23H36N6O19S7, m/z = 936 Da; C23H33N7O19S7 und m/z = 947 Da; C25H38N8O15S8), jeweils abgeleitet von Ar, Ar + DMSO und Ar + H2O2 + DMSO-Plasmen sind in Abb. 7 dargestellt.

3D-Strukturen der schwersten TSP-abgeleiteten chemischen Produkte.

Vollständige Informationen und vorhergesagte chemische Strukturen der hergestellten Verbindungen sind in der Zusatzinformationsdatei zusammengestellt. Als Beispiel können Sie in Tabelle 2 einige der größeren Verbindungen sehen, die durch verschiedene Plasmabehandlungen hergestellt wurden.

Allerdings sind die Mechanismen von Plasma, chemischen Reaktionen in Wasser und deren Grenzflächenreaktionen komplexer als es den Anschein hat. Früheren Studien zufolge trug oxidativer Stress hauptsächlich zum Anstieg des RONS-Spiegels und hochreaktiver Radikale wie ·H und ·OH bei . Unter Verwendung solcher Radikale finden mehrere chemische Reaktionswege (Abbau und Polymerisation) statt66. Die Mechanismen, die bei PAW ablaufen, werden nicht nur durch das Wasserstoffatom und das OH-Radikal, sondern auch durch hydratisierte Elektronen (e–aq) abgewickelt. Bereits in den 1980er Jahren zeigten Studien, dass e-aq in Wasser durch Photonenbestrahlung (UV-Photoanregung) mit Energien von mehr als 6 eV erzeugt wird67,68. Bei dieser Energie ist die Bildung von e-aq auf den H-Atomtransfer zurückzuführen, bei höheren Energieniveaus ist jedoch eine zusätzliche Bildung möglich. e–aq leitet sich von erzeugten Sekundärelektronen in Wasser als Ergebnis der Ionisierung ab. Diese Elektronen haben einen großen Einfluss auf die Chemie und biologische Reaktionen. Nachfolgend finden Sie einige entsprechende Reaktionen:

wobei H3O als „Rydberg-Radikal“ bekannt ist, in dem ein Elektron schwach an H3O+ gebunden ist.

Bei aktiviertem Wasser findet die primäre Ionisierung statt (Reaktion 1) und durch Anregung entstehen ein Wasserstoffatom und ein OH-Radikal (Reaktion 2). Die Reaktionen (3) und (4) sind zwei wichtige Rekombinationsprozesse, bei denen e-aq in das Wasserstoffatom umgewandelt wird. Reduzierende Spezies, die in Reaktion (1) bei ihren Reaktionen mit Wasserstoffperoxid (8) gebildet wurden. Schließlich entsteht ein spannendes Wassermolekül.

Plasmaerzeugte Elektronen und verschiedene kurz- und langlebige Radikale treten beim Erreichen der Lösung in vielen Mischreaktionen auf. Als Ergebnis dieser Reaktionen entstehen viele andere Radikale und reaktive Spezies. Darüber hinaus werden viele RONS in PAW durch so lange (Nitrate (NO3–), Nitrite (NO2–), Wasserstoffperoxid (H2O2) und Ozon (O3)) und kurzlebige Spezies (Hydroxylradikale (OH·), Stickstoff) erzeugt Oxid (NO·), Superoxid (O2–), Peroxynitrit (OONO2–) und Peroxynitrite (ONOO–))69. Mehrere Faktoren wie die Stromversorgung des Plasmas, die angelegte Spannung, die Entladungsregime, die Behandlungszeit, die Art des zugeführten Gases und dessen Fluss sowie die Art und Konfiguration der Elektroden sowie das Lösungsvolumen und die Zusammensetzung sowie der Abstand zwischen der Elektrode und der Oberfläche die Lösung, sind wichtig für die Effizienz von Experimenten70. Ar-Plasma ohne molekulares Gas verfügt über hochenergetische Elektronen und (V)UV-Photonen71,72. Die Carbonylgruppe ist im Ar-Plasma hoch, was zu einer Carbonylierung (Oxidationsprozess) führt. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Hydroxylradikale sowie atomarer und Singulett-Sauerstoff bei der In-situ- oder Ex-situ-Plasmabehandlung wirksam auf Thiolgruppen in Proteinen wirken. Die Verwendung von Ar-Gas, H2O2 und DMSO als Vorläufer führt zur Produktion verschiedener Primärspezies, die anschließend für die Erzeugung vieler Sekundärspezies sorgen. Mit trockenem Ar-Gasplasma können ·OH als starke Radikale, die Cystein oxidieren können, sowohl in der Gasphase als auch in der Plasma-Proben-Grenzfläche erzeugt werden73,74,75. Die Energie der S-H-Bindung beträgt nur 3,6 eV und ist ein gutes Ziel für den Angriff durch reaktives ·OH. H2O2 ist ein weiterer wichtiger ROS, der vom kalten Plasma erzeugt wird (hauptsächlich als Ergebnis der Rekombination von OH-Radikalen) und eine große Rolle in den Redox-Signalwegen der Zelle spielt. Singulett-Sauerstoff ist ebenfalls eine reaktive Sauerstoffspezies, die eine wichtige Rolle bei der Oxidation von Cystein spielt. In Ar-Plasma kann die Reaktion zwischen ROS wie z. B. ·OH-Radikalen und Aminosäuren zur Bildung von Wasserstoffradikalen führen. In einer saureren Lösung (Ar + H2O2 + DMSO in unserer Studie) kann NO2– leicht protoniert und zu NO2, NO und H2O abgebaut werden. RNS ist aus zwei Gesichtspunkten sehr wichtig: 1- Erzeugung von Aminosäuren und Stickstoffverbindungen; und 2- als Signalmolekül zur Steuerung des Stoffwechsels. Eine Kombination von NO2– mit H2O2 und O3 erzeugt Nitrat (NO3–)76.

Während des Deprotonierungsprozesses des Hydroperoxylradikals (OOH) entsteht in PAW ein weiteres wichtiges Radikal namens Superoxid (O2–). KEIN Radikal kann zur Bildung anderer RONS beitragen, indem es die Aminosäure während des Oxidationsprozesses angreift. ONOOH und ONOO können durch folgende Reaktionen entstehen:

Als Ergebnis dieser Reaktionen brechen einige Bindungen auf, während sich viele neue Bindungen bilden, wodurch zahlreiche Bioprodukte entstehen, die in Massenspektren nachgewiesen wurden. Das Aufbrechen der C-S-Bindung und die Bildung einer C-C- und C=C-Bindung (gemäß FTIR) wurde vorhergesagt und die Aminogruppe (NH2) wurde mit NO-Radikalen aus dem Plasma angegriffen, um eine neue NH2-Gruppe hinzuzufügen. Die vorhergesagten Pfade einiger chemischer Verbindungen wurden in unserer vorherigen Studie gezeigt. Wenn beispielsweise ein einzelnes Cysteinmolekül durch ein OH-Radikal und dann durch O3 angegriffen wird, kann Sulfinsäure erzeugt werden. Eine weitere Expositionsbehandlungszeit kann dieses Produkt durch weiteren OH-Angriff mit einem Molekulargewicht von (C3H11NO5S; m/z = 174 Da) zu der anderen Struktur oxidieren (Tabellen S2, S3). Ein häufiges Produkt während der Plasmabehandlung ist die Anlagerung von zwei Cysteinen und deren H-Abstraktion. Wie bereits erwähnt, kann sich Cystin aufgrund der langen Behandlungsdauer und laut Zhou et al.24 im Rahmen eines Überoxidationsprozesses in andere neue Produkte umwandeln. Das Endprodukt dieses Weges enthält bei weiterer Exposition Serinmoleküle in seiner Struktur (C6H13N3O9S2, m/z = 336 Da) aus allen Plasmabehandlungen (siehe Abb. 8). Durch Anknüpfen von drei Cystein-(–SH)-Molekülen und neuen C-N-, S-S- und S=O-Bindungen wurde bei der Ar-Plasmabehandlung eine Verbindung (C11H21N3O11S4; m/z = 500 Da) beobachtet, die Alaninaminosäure enthält. Einige Produkte von (m/z = 583, 608, 656 Da) enthalten Alaninaminosäuren in ihren Strukturen. Beispielsweise zeigt (C9H21N5O16S4; m/z = 583 Da), dass mehr Cysteinmoleküle miteinander verbunden sind, jedes mit neuen OH-Bindungen und einer Aminogruppe. Darüber hinaus wurden alle Schwefelatome mit aus dem Plasma stammenden Radikalen (z. B. O3, OH, H2O2, O2) beschossen. Dies ist jedoch der erste Schritt in diese Richtung und in dieser Hinsicht muss noch viel geforscht werden. Dieser Prozess bringt uns unserem Ziel näher, eine vollständige Kette des Peptids herzustellen.

Vorhergesagte chemische Struktur eines Biomoleküls, das aus allen Plasmen stammt (C6H13N3O9S2, m/z = 336 Da).

Die Menge an ROS nimmt nach der Reaktion mit der Aminosäureinformation von NO2– im Medium ab. Die Bildung von Ionen wie NO2– und NO3– führt zu einem Absinken des pH-Wertes und damit zur Bildung reaktiver Stickstoffverbindungen. Somit können stickstoffbezogene Radikale Aminosäuren verändern. NO-Gruppen können sich an die Thiolreste von Aminosäuren oder sogar an Aminogruppen binden61,69. Interessanterweise spielten O(3P) und O2(1Δg) als aus der Gasphase stammende Spezies eine entscheidende Rolle bei der Bildung von Produkten und sind an verschiedenen Modifikationen von Biomolekülen beteiligt. Durch die Zugabe von DMSO zum Plasma wird das reaktive Schwefelradikal freigesetzt und nimmt an vielen anderen Reaktionen teil. Darüber hinaus erzeugen einige andere reaktive Schwefelspezies (RSS)77,78,79 in Lösungen (die Cystein enthalten) die Bildung chemischer Reaktionen, die zur Bildung vieler neuer Biomoleküle führen.

Die folgende Reaktion zeigt die große Wirkung des ·OH-Radikals im Abbauprozess von DMSO:

Im Rahmen des Überoxidationsprozesses treten viele weitere Zusammenhänge wie folgt auf:

Durch die Wechselwirkung zwischen DMSO und ·OH-Radikalen entstehen zwei wesentliche Produkte (Schwefeldioxid (SO2) und Dimethylsulfon (C2H6SO2)) in der Gasphase. Weitere wichtige Faktoren im DMSO-Oxidationsprozess sind UV-Strahlung und H2O280,81. Die Zugabe von H2O2 ermöglicht die Erzeugung weiterer reaktiver Radikale wie HOO· und ·OH82,83. Dies führt zu einer Beschleunigung der Abbauprozesse von DMSO. Der vorhergesagte Weg des DMSO-Abbaus ist in Abb. 9 dargestellt, der wichtig ist, um aus Cystein chemische Produkte für den Polymerisationsprozess zu erzeugen.

Vorhergesagte Wege der DMSO-Abbauprozesse81.

Schwefelwasserstoff (H2S) kann in Zellen über einen enzymatischen oder nicht-enzymatischen Weg erzeugt werden. H2S fungiert im Körper als gasförmiges Signalmolekül, das bekanntermaßen den Komplex IV der mitochondrialen Elektronentransportkette hemmt, wodurch die ATP-Erzeugung und die biochemische Aktivität in den Zellen wirksam reduziert werden84. Durch die Freisetzung dieses Moleküls über den Weg Nr. (1) in Abb. 10 im Rahmen des Oxidationsprozesses kann ein Bioprodukt mit (m/z = 50 Da) entstehen. Andererseits kann die NH3-Gruppe zu anderen Reaktionen bei der Herstellung anderer Produkte beitragen, beispielsweise über den Weg (2) (m/z = 336 Da).

Vorhergesagter Weg zweier Bioprodukte: (1) H2OS (m/z = 50 Da) und (2) C6H13N3O9S2 (m/z = 336 Da).

Wie bereits erwähnt, führt die Spaltung einer C-S-Bindung auch zu einigen neuen Produkten. Man geht davon aus, dass das OH-Radikal eine Ursache für die Schwächung der C-N-Bindung ist76,85,86. Der Überoxidationsprozess kann in einigen Produkten zum Abbau der SS-Bindung führen:

Es fällt auf, dass (V)UV-Strahlung aus dem Plasma durch Spaltung der C-S-Bindung für die Bildung von Alanin und die weitere Oxidation des SH-Radikals verantwortlich sein kann. Neben Serin und Alanin werden bei TSP-Behandlungen auch andere Moleküle produziert. Es versteht sich, dass die Art der reaktiven Spezies und der Zeitpunkt der Behandlung6,87 einen großen Einfluss auf die Produktion und Art der biochemischen Produkte haben88,89.

Sulfonsäure, Sulfinsäure, Carbonsäure, Acrylsäure, Glycin, Prolin und einige andere Aminosäurebiomoleküle wurden in einigen Derivaten durch unterschiedliche m/z-Werte aus verschiedenen TSP-Behandlungen beobachtet. Es scheint, dass die Fähigkeit aller drei Plasmaarten bei Zersetzungs- und Abbauprozessen nahezu gleich ist.

Zusammenfassend wurde eine TSP-Konfiguration entwickelt, um während des Polymerisationsprozesses aus Cystein Bioprodukte mit hohen Molekularmassen herzustellen. Die Herstellung hoher Molekülmassen aus Monomeren hängt direkt von der Menge der aus dem Plasma stammenden Spezies ab. Cystein wird als biologisches Modell in Betracht gezogen, um die Aufklärung der Redoxaktivität von Peptiden und Proteinen zu verbessern. Es bestehen jedoch immer noch Bedenken hinsichtlich der Elektronentransferreaktionen dieser Moleküle, die weiterer Untersuchung bedürfen. Cystein ist aufgrund seiner hohen Oxidationsstufen immer noch eine wichtige Aminosäure zur Überwachung der chemischen Struktur und der Fähigkeiten von Proteinen. Reaktive Spezies der Ar-TSP-Entladung führten zur Entstehung vieler oxidierter Cysteinproduktionen. Darüber hinaus führte die Zugabe von DMSO und H2O2 in gewissem Umfang zur Erzeugung anderer neuer Bioprodukte. Laut Massenspektroskopie wurden bei allen Plasmabehandlungen im hohen Molekularmassenwert deutliche Cysteinoxidationsprodukte beobachtet, was die möglichen biologischen Auswirkungen von RONS bestätigt. Ar + H2O2 + DMSO beeinflussten die Thiolgruppe stark, was mit der FTIR-Analyse übereinstimmte. Durch die gleichzeitige Zugabe von H2O2 und DMSO erhöhte sich die Zahl neuer chemischer Produkte. Einige von Ar + DMSO abgeleitete chemische Produkte, die in anderen zu finden waren, waren häufiger anzutreffen. Daher können die Art der Vorläufer und etwaige Zusätze zum Plasma bei der Herstellung chemischer Produkte und deren Intensität variieren. Um die Bildung biochemischer Verbindungen zu steigern, müssen im Allgemeinen einige Überlegungen zu den Entladungsparametern angestellt werden.

Man kommt zu dem Schluss, dass die TPS-Behandlung von Cystein dessen chemische Struktur dramatisch verändern kann. Neben dem Abbauprozess sind Polymerisationsprozesse aufgetreten, um neue Bioprodukte mit höheren Molekularmassen herzustellen. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die chemische Struktur von Cystein dramatisch verändert wird, um viele andere Produkte herzustellen. Durch den Überoxidationsprozess können größere Biomoleküle entstehen, die andere Aminosäuren enthalten. Schließlich wird davon ausgegangen, dass viele aus dem Plasma stammende reaktive Spezies, die in der Gasphase, der Flüssigphase und der Gas-Flüssigkeits-Grenzfläche erzeugt wurden, einen großen Einfluss auf die Beschleunigung der Polymerisationsprozesse hatten.

Alle chemischen Strukturen der erzeugten Biomoleküle unter verschiedenen Plasmabehandlungen werden in den Zusatzinformationstabellen dargestellt.

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Abteilung für Atom- und Molekularphysik, Fakultät für Naturwissenschaften, Universität Mazandaran, Babolsar, Iran

Masume Farhadi & Farshad Sohbatzadeh

Forschungskern für Plasmatechnologie, Fakultät für Naturwissenschaften, Universität Mazandaran, Babolsar, Iran

Farshad Sohbatzadeh

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FS: Betreuung, Konzeptualisierung, Ressourcen, Überprüfung und Bearbeitung, Design des CAP-Geräts; MF: Untersuchung, Validierung. experimentelle Aufgaben, Bewertung physikalisch-chemischer Parameter, formale Analyse, Schreiben und Bearbeiten.

Korrespondenz mit Farshad Sohbatzadeh.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Farhadi, M., Sohbatzadeh, F. Einfluss einer transienten Funkenplasmaentladung auf die Herstellung hoher Molekularmassen chemischer Produkte aus L-Cystein. Sci Rep 13, 2059 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-28736-4

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Eingegangen: 25. August 2022

Angenommen: 24. Januar 2023

Veröffentlicht: 04. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-28736-4

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