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Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 60 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Es besteht weiterhin ein Bedarf an krebsspezifischen Liganden, die eine Vielzahl therapeutischer Ladungen liefern können. Liganden, die sowohl Tumorspezifität als auch die Fähigkeit aufweisen, eine effiziente zelluläre Aufnahme eines Therapeutikums zu vermitteln, sind für die Erweiterung zielgerichteter Therapien von entscheidender Bedeutung. Wir haben zuvor über die Auswahl eines Peptids aus einer Peptidbibliothek unter Verwendung einer nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Zelllinie (NSCLC) als Ziel berichtet. Hier optimieren wir unser Leitpeptid durch eine Reihe chemischer Modifikationen, einschließlich Verkürzungen, N-terminaler Verkappung und Änderungen der Wertigkeit. Das resultierende 10-Aminosäuren-Peptid hat als Monomer eine Affinität von <40 nM zu vier verschiedenen NSCLC-Zelllinien und ist in menschlichem Serum >48 Stunden stabil. Das Peptid wird bei der Zellbindung schnell internalisiert und zum Lysosom transportiert. Das Peptid findet in einem Tiermodell seinen Platz in einem Tumor und bleibt dort bis zu 72 Stunden erhalten. Wichtig ist, dass wir zeigen, dass das Peptid das zytotoxische Protein Saporin in vitro und in vivo gezielt an Krebszellen abgeben kann, was zu einem wirksamen Antikrebsmittel führt.

Trotz eines Rückgangs neuer Fälle in den letzten 30 Jahren ist Lungenkrebs immer noch für etwa 20 % der krebsbedingten Todesfälle in Amerika verantwortlich1. Das Screening von Rauchern mittels niedrig dosierter Spiral-Computertomographie hat die Erkennung verbessert, aber nur 17 % der Lungenkrebserkrankungen werden in einem lokalisierten Stadium erkannt. Neuere Therapien haben den Schwerpunkt auf molekulargesteuerte Behandlungen verlagert, die vom Genotyp und/oder Phänotyp des Tumors abhängen2. Eine solche therapeutische Klasse sind Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs). Antikörper dienen als Transportsysteme, indem sie auf Zelloberflächenrezeptoren abzielen, deren Expression in einem Tumor hochreguliert ist, auf normalen Zellen jedoch nur eine vernachlässigbare Expression aufweist. Monoklonale Antikörper müssen eine hohe Zellspezifität aufweisen, um eine Abgabe an normale Zellen zu vermeiden. Darüber hinaus müssen sie in die Zelle internalisiert werden, um die toxische Nutzlast abzugeben. Aufgrund der Spezifität des Antikörpers für Krebszellen können Medikamente, die für eine systemische Verabreichung zu toxisch sind, als ADCs eingesetzt werden. Die Zulassung von Kadcyla®3, einem an Emtansin konjugierten Anti-HER2-Antikörper, und Adcetris4,5, einem an Monomethylauristatin konjugierten Anti-CD30-Antikörper, belebte die ADC-Entwicklung neu. Seit 2017 haben acht ADCs die FDA-Zulassung erhalten6,7,8. Bisher gibt es jedoch keine zugelassenen ADCs für die Behandlung von Lungenkrebs9.

Peptide stellen eine alternative Klasse krebsbekämpfender Moleküle dar. Peptide konkurrieren in Affinität und Spezifität mit Antikörpern. Sie sind einfacher herzustellen und können regiospezifisch modifiziert werden, um eine Vielzahl von Ladungen zu transportieren, einschließlich makromolekularer Biotherapeutika. Phagen-Display-Biopanning wurde eingesetzt, um peptidische Liganden für neue Biomarker bei Krebs auszuwählen10. Wir haben zuvor ein Peptid aus einer Phagen-präsentierten Peptidbibliothek durch Biopanning auf der NSCLC-Zelllinie HCC1511 isoliert. Dieses Peptid, das jetzt als MGS4 (früher HCC15.2) bezeichnet wird, wird in etwa 54 % (21/39) der getesteten NSCLC-Linien internalisiert und bindet 24 % (14/59) der fixierten menschlichen NSCLC-Biopsieproben in einem Gewebe-Mikroarray. Die fehlende Internalisierung in immortalisierte, aber nicht transformierte menschliche Bronchialepithelzellen sowie die fehlende Bindung an normale benachbarte Lungengewebeproben in den Gewebemikroarrays belegen die Spezifität dieses Peptids für Krebszellen im Vergleich zu normalem Lungengewebe. Somit ist MGS4 ein vielversprechendes Targeting-Molekül für die Abgabe von Zytotoxika an eine Untergruppe von Krebsarten. Hier optimieren wir unser Leitpeptid durch eine Reihe chemischer Modifikationen, um ein hochaffines Peptid zu schaffen, das serumstabil ist und in der Lage ist, Fracht intrazellulär in Krebszellen zu transportieren. Das resultierende Peptid findet in einem Tiermodell einen NSCLC-Tumor. Wichtig ist, dass wir zeigen, dass das optimierte MGS4 das zytotoxische Protein Saporin in vitro und in vivo gezielt an Krebszellen abgeben kann, was zu einem wirksamen Antikrebsmittel führt.

MGS4 wurde zunächst durch Phagen-Display-Biopanning einer Peptidbibliothek auf lebenden Zellen selektiert. Bei der Bibliothekskonstruktion werden Peptide genetisch mit dem PIII-Hüllprotein fusioniert, sodass ein einzelnes Peptid in 3–5 Kopien pro Phagen präsentiert werden kann. Daher ist häufig eine multivalente Bindung erforderlich. Um festzustellen, ob eine multivalente Bindung für die MGS4-Internalisierung erforderlich ist, wurden monomere (MGS4_V2) und tetramere (MGS4_V1) Peptide wie beschrieben synthetisiert und markiert (ergänzende Abbildung 1). Nach der Inkubation unterschiedlicher Peptidkonzentrationen auf lebenden Zellen wurde das oberflächengebundene Peptid durch Waschen mit niedrigem pH-Wert und Trypsinierung entfernt. Die relative Internalisierung wurde mittels Durchflusszytometrie gemessen, um einen EC50-Wert zu bestimmen, der die Konzentration des Peptids darstellt, das eine halbmaximale Internalisierung bewirkt. Diese Messung hängt von der Affinität des Peptids zu seinem zellulären Ziel und der Internalisierungsrate ab. Dies ist eine genauere Darstellung der biologischen Situation und nützlich bei der Bewertung der Peptide als Wirkstoffe zur Arzneimittelabgabe. Wie bei der rezeptorvermittelten Endozytose zu erwarten ist, ist die Aufnahme von MGS4 mit zunehmender Konzentration sättigbar. Die Tetramerisierung veränderte EC50 nicht signifikant, was darauf hindeutet, dass sich die Affinität von MGS4 durch Multimerisierung nicht offensichtlich ändert (Abb. 1a).

a Bindung und Internalisierung von tetramerem MGS4_V1 und monomerem MGS4_V2 an lebenden H1299-Zellen in Kultur. Die Zellen wurden mit dem an Streptavidin-Phycoerythrin konjugierten Peptid 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Nicht internalisiertes Peptid wurde entfernt und die Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert. b H1299-Zellen wurden mit MGS4_V1 oder MGS4_V2, konjugiert an Streptavidin-Alexa Fluor 555 (rot), 1 Stunde lang inkubiert, gewaschen, fixiert und mit WGA-Alexa Fluor 488 (grün, Zellmembran) und DAPI (blau, Kerne) gegengefärbt und analysiert Fluoreszenzmikroskopie. Der Maßstabsbalken entspricht 20 µm. MGS4_V1 und MGS4_V2 internalisieren in ähnlichem Maße und lokalisieren an einem ähnlichen Ziel. c Verkürzte, monomere MGS4-Peptide haben einen ähnlichen EC50-Wert wie das parentale Volllängenpeptid. Einzelmessungen werden angezeigt. Der Mittelwert wird als „X“ angezeigt und schwarze Fehlerbalken stellen den Standardfehler für mindestens drei experimentelle Replikate (SEM) dar. Alle ursprünglichen Bindungsdaten und die nichtlineare Regressionsanalyse der Daten sind in den ergänzenden Materialien enthalten.

Endozytose wird häufig durch Rezeptormultimerisierung auf der Zelloberfläche ausgelöst. Daten deuten jedoch darauf hin, dass MGS4 im Monomerformat internalisiert wird. Um die Internalisierung zu überprüfen, wurde das Peptid an Streptavidin-Alexa Fluor 555 konjugiert und mit lebenden Zellen inkubiert. Die Internalisierung wurde durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie bestimmt. MGS4_V2 zeigte eine deutliche Internalisierung wie die für MGS4_V1 beobachtete. Beide Valenzen lokalisieren in diskreten Puncta im perinukleären Bereich (Abb. 1b). Somit bindet MGS4_V2 Krebszellen mit geringer nanomolarer Affinität und transportiert Ladungen in lebende Zellen. Da die Synthese des Monomerpeptids weniger als die Hälfte der Zeit und ein Viertel der herzustellenden Materialien erfordert, wurde für weitere Optimierungen das Monomer MGS4_V2 verwendet.

Um herauszufinden, welche Aminosäuren für die Zellbindung entscheidend sind, wurde monomeres MGS4 mit aufeinanderfolgenden Verkürzungen der Aminosäuren an den Enden synthetisiert. Die Auswirkung jeder Löschung auf die Internalisierung wurde ermittelt (Tabelle 1). Zwei C-terminale Aminosäuren, Alanin und Prolin, können mit einer nur ca. 3- bis 5-fachen Abnahme der Affinität verkürzt werden (MGS4_V3 und MGS4_V4). Wenn auch die dritte Aminosäure, Threonin, entfernt wird (MGS4_V5), geht jegliche Aufnahme verloren. Wenn die erste N-terminale Aminosäure Phenylalanin verkürzt ist (MGS4_V6), wird die Aufnahme ebenfalls aufgehoben. Obwohl nicht unbedingt alle Aminosäuren dazwischen für die Bindung entscheidend sind, kann MGS4_V4 nicht weiter von den Termini entfernt gekürzt werden. Während die Affinität durch diese Verkürzung um das etwa Dreifache verringert wird, ist es aus praktischen Gründen vorteilhaft, das Prolin am C-Terminus zu entfernen; Prolin neigt während der Peptidkopplung zur Racemisierung, das sekundäre Amin von Prolin verlangsamt die Kopplung der nachfolgenden Aminosäure und Prolin kann die Gesamtausbeute der Synthese verringern12.

Die Serumstabilität wird oft als Einschränkung von Peptiden angeführt, wobei der überwiegende Abbau in der Spaltung durch N-terminale und C-terminale Peptidasen erfolgt. Der C-Terminus ist durch Amidierung, eine biotinylierte Aminosäure und einen PEG-Linker vor Abbau geschützt (ergänzende Abbildung 1). Der N-Terminus enthält jedoch eine unveränderte, natürlich vorkommende Aminosäure Phenylalanin, deren Entfernung zum vollständigen Verlust der Internalisierung führt. Daher ist der Schutz vor Zersetzung von entscheidender Bedeutung. Die Acetylierung des Aminoterminus schützt Peptide vor der N-terminalen Peptidase und fügt gleichzeitig nur minimalen sterischen Anspruch hinzu.13 Allerdings verringert die Acetylierung die Nettoladung und kann die Bindung von MGS4 an seinen zellulären Rezeptor verändern.

Um herauszufinden, ob die Acetylierung den Serumabbau von MGS4 wirksam reduziert, wurden acetylierte (MGS4_V8) und nicht acetylierte (MGS4_V4) Peptide in menschlichem Serum gelöst und 48 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die Peptide wurden durch analytische HPLC überwacht und die Produkte wurden mittels MALDI TOF/TOF™ MS verifiziert. Die Acetylierung schützt MGS4_V8 vor dem Abbau, wobei nur Peptide voller Länge beobachtet werden (ergänzende Abbildung 2). Im Gegensatz dazu wird kein Ausgangsmaterial von ungeschütztem MGS4_V4 beobachtet. Stattdessen wird eine Mischung aus Peptidfragmenten nachgewiesen, von denen keines der Masse des Ausgangspeptids entspricht (Ergänzungstabelle 1 und Ergänzungsabbildung 2). Die Hauptprodukte sind kürzere Fragmente, die dem Verlust der fünf N-terminalen Aminosäuren entsprechen. Fragmente im Zusammenhang mit QSFYT-PEG11, SFYT-PEG11 und FYT-PEG11 werden beobachtet. Da wir diese Spaltungsprodukte bei MGS4_V8 nicht beobachten und keine Massen identifizieren können, die dem Amino-terminalen FHAVP-Fragment entsprechen, sind die bei der nichtacetylierten Variante beobachteten Abbauprodukte wahrscheinlich auf die Spaltung durch Aminopeptidase und nicht auf eine Endoprotease zurückzuführen.

Um sicherzustellen, dass die Acetylierung die Peptidaktivität nicht beeinflusst, wurden EC50 von MGS4_V4 und MGS4_V8 verglichen. Die Acetylierung hat im Vergleich zu nicht acetyliertem MGS4_V4 keinen signifikanten Einfluss auf die Internalisierung von MGS4_V8 (Tabelle 1). Ebenso gibt es einen vernachlässigbaren Unterschied zwischen dem acetylierten Volllängenpeptid MGS4_V7 und dem verkürzten MGS4_V8. Obwohl die Bindung von MGS4_V7 im Vergleich zu MGS4_V2 verringert ist, liegt die Affinität als Monomerpeptid immer noch im nützlichen Bereich für das In-vivo-Targeting14,15. Daher ist die Acetylierung eine wirksame Möglichkeit, den N-Terminus von MGS4 zu schützen, ohne die Bindung an das zelluläre Ziel aufzuheben.

Die Optimierung von MGS4 als Monomer ist effizient, aber die optimale Wertigkeit des verkürzten Peptids kann sich von der des Volllängenpeptids unterscheiden. Das Peptid wurde als Monomer (MGS4_V8), Dimer (MGS4_V9) und Tetramer (MGS4_V10) synthetisiert. Um quantitative Daten zu erhalten, sind wir von der Messung der relativen Fluoreszenz des farbstoffmarkierten Peptids zur Bestimmung der durchschnittlichen Anzahl der pro Zelle internalisierten Farbstoffmoleküle übergegangen. Mit diesem Ansatz ist der EC50-Wert für MGS4_V8 auf H1299-Zellen etwas höher als zuvor berechnet (21 gegenüber 38 nM), liegt jedoch innerhalb des Fehlerbereichs des Tests. Das Dimer MGS4_V9 weist einen siebenfach niedrigeren EC50-Wert auf, was darauf hindeutet, dass es einen synergistischen Effekt beim Übergang von einem Monomer zu einem Dimer gibt (Abb. 2a und Tabelle 2). Der Übergang von einem dimeren zu einem tetrameren Peptid (MGS4_V10) nimmt jedoch nur um das Zweifache ab. Wir haben den EC50 auch für drei andere NSCLC-Zelllinien berechnet (Tabelle 2 und ergänzende Abbildung 3). In allen Fällen sind die EC50-Werte innerhalb der experimentellen Fehler gleich, was darauf hindeutet, dass die Affinität von MGS4 vom Zelltyp unabhängig ist. Die durchschnittliche Anzahl an Peptiden, die pro Zelle unter Sättigungsbedingungen internalisiert werden, variiert, wobei H1993-Zellen die höchste Anzahl an Peptiden in allen drei Valenzen internalisieren (Tabelle 2). Dies ist wahrscheinlich auf unterschiedliche Niveaus der Rezeptorexpression je Zelltyp zurückzuführen. Die durchschnittlichen Moleküle, die bei 50 nM in einer Stunde internalisiert werden, folgen dem gleichen Trend (Abb. 2b). Darüber hinaus behalten MGS4_V8 und MGS4_V9 ihre Spezifität für NSCLC-Zelllinien; In einer normalen menschlichen Bronchialepithelzelllinie wird eine minimale Internalisierung beobachtet (Abb. 2b).

a MGS4_V8, MGS4_V9 oder MGS4_V10 wurden mit Streptavidin-Alexa Fluor 647 konjugiert und H1299-Zellen wurden mit dem markierten Konjugat 1 Stunde lang inkubiert. Nicht internalisierte Peptide wurden entfernt und die mittlere Anzahl der pro Zelle internalisierten Peptide wurde bestimmt, um den EC50 zu berechnen. Einzelmessungen werden angezeigt. Der Mittelwert wird als „X“ angezeigt. Fehlerbalken in Schwarz stellen Standardfehlermessungen dar und liegen in einigen Fällen unter der Höhe der Symbole. b Die durchschnittliche Anzahl von Peptidmolekülen pro Zelle bei 50 nM nach 1 Stunde wurde an vier NSCLC-Zelllinien und einer normalen menschlichen Bronchialepithelzelllinie (HBEC) bestimmt. Fehlerbalken stellen SEM dar und einzelne Datenpunkte werden angezeigt. c H1299-Zellen wurden 1 Stunde lang mit 50 nM Peptid-Streptavidin-Qdot605 inkubiert, entfernt und durch normales Wachstumsmedium ersetzt. Nach 24 Stunden wurden die Zellen fixiert und mit DAPI (blau) gegengefärbt. Repräsentative maximal projizierte Z-Stapel für jede Gruppe zeigen keinen offensichtlichen Unterschied in der Peptidinternalisierung oder -lokalisierung. Der Maßstabsbalken repräsentiert 10 µm.

Während EC50 mit zunehmender Wertigkeit abnimmt, zeigt die Anzahl der pro Zelle bei Sättigung internalisierten Peptide bei allen vier Zelllinien eine geringe Abhängigkeit von der Wertigkeit. Somit erreichen MGS4-Varianten unterschiedlicher Wertigkeit die gleiche maximale Aufnahme, wenn auch in unterschiedlichen Konzentrationen (Abb. 2b, Tabelle 2). In ähnlicher Weise werden alle Valenzen internalisiert und an einen ähnlichen Ort weitergeleitet (Abb. 2c). Der Anstieg der Material- und Zeitkosten für die Synthese des Dimers und Tetramers führt zu einer Verringerung des Ertrags. Darüber hinaus besteht das Potenzial, das Monomer zur Abgabe direkt auf Proteine ​​zu klonen. Zusammenfassend haben wir das Monomer MGS4_V8 vorangetrieben.

Der interne Handel mit Arzneimittelkonjugaten nach der Internalisierung hat erhebliche Auswirkungen auf die Wirksamkeit; Die Ladung muss in der Lage sein, ihr zelluläres Ziel zu erreichen, um die gewünschte biologische Wirkung zu erzielen. Es wurde eine Reihe stabiler organellenspezifischer, GFP-markierter H1299-Zellen erzeugt, in denen die Kerne, ER, Golgi, Lysosome, Mitochondrien, Zytosol oder Plasmamembran markiert waren. Jede Zelllinie wurde mit MGS4_V8-Streptavidin Alexa Fluor 555 behandelt. Nach einer Stunde wurde eine MGS4_V8-Kolokalisation in Lysosomen-markierten Zellen beobachtet, die in Abb. 3a als gelbe Pixel zu sehen ist, die durch rote Pfeile angezeigt werden. MGS4_V8 sammelte sich weder an den anderen subzellulären Stellen noch wurde es auf der Zellmembran beobachtet.

a H1299-Zellen wurden mit GFP-markierten Organellen-spezifischen Proteinen für ER, Golgi, Lysosome, Mitochondrien, Kern, Plasmamembran und Zytosol (grün) markiert. Die Zellen wurden mit 50 nM MGS4_V8-Streptavidin Alexa Fluor 555 (rot) 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert, dann fixiert und mit DAPI (blau) gegengefärbt. MGS4_V8 kolokalisiert mit Lysosomen, die als gelbe Puncta beobachtet werden, die durch die roten Pfeile angezeigt werden. Mit anderen subzellulären Organellen wird keine signifikante Kolokalisierung beobachtet. b Mit Lysosomen markierte H1299-Zellen (grün) wurden mit 50 nM MGS4_V8-Streptavidin Alexa Fluor 555 (rot) für 0,5, 1, 4 oder 24 Stunden inkubiert, dann gewaschen, fixiert und mit DAPI (blau) gegengefärbt. Es werden repräsentative Einzel-Z-Schnittbilder angezeigt. Mit Peptiden gefüllte Vesikel können nach 30 Minuten beobachtet werden, wie sie zu Lysosomen gelangen, wobei viele bereits nach einer Stunde kolokalisieren. Das meiste Peptid wird innerhalb von 4 Stunden in den Lysosomen gefunden und dort nach 24 Stunden zurückgehalten. c Maximal projizierte, komprimierte Z-Stapel aus Bildern in Panel b. Der Maßstabsbalken in allen Bildern entspricht 10 µm.

Mit Lysosomen markierte Zellen (grün) wurden 30 Minuten, 1 Stunde, 4 Stunden oder 24 Stunden lang mit MGS4_V8-Streptavidin Alexa Fluor 555 behandelt. Peptidhaltige Vesikel (rot) sind 30 Minuten getrennt von den markierten Lysosomen zu sehen, die nach einer Stunde begonnen haben, sich mit lysosomalen Vesikeln (gelb) zu kolokalisieren. MGS4_V8 bleibt nach 24 Stunden mit Lysosomen kolokalisiert, wobei > 70 % des Signals mit Lysosomen kolokalisiert sind (Abb. 3b). Der Handel, die Akkumulation und die Retention in den Lysosomen sind im komprimierten, maximal projizierten Z-Stapel der Zellen noch deutlicher (Abb. 3c). Bemerkenswert ist, dass die lysosomale Regeneration nach 24 Stunden beobachtet wird, was durch ein erhöhtes grünes Signal vom GFP belegt wird, das nicht mit zuvor internalisiertem MGS4_V8 kolokalisiert ist.

Saporin ist ein Ribosomen-inaktivierendes Protein (RIP), dessen Funktion darin besteht, die ribosomale 28 S-rRNA zu spalten und so die Proteinsynthese zu stoppen16,17,18. Die Ribosomen-inaktivierende Aktivität von Saporin ist katalytisch und erfordert nur wenige Moleküle, um die Ribosomen in einer Zelle zu inaktivieren. Saporin fehlt eine Internalisierungsdomäne; Es hat keinen Tropismus für menschliche Zellen und das Toxin wird nicht internalisiert, es sei denn, es ist an einen zellinternalisierenden Liganden gebunden. Um festzustellen, ob MGS4_V8 ein aktives Proteintoxin intrazellulär abgibt, wurde biotinyliertes Peptid an Streptavidin-markiertes Saporin konjugiert. Wie in Abb. 4a zu sehen ist, vermittelt MGS4_V8 die Internalisierung von Saporin in H1299-Zellen. Im Gegensatz dazu gelangt Saporin, das an das Kontrollpeptid MGS4_V6 konjugiert ist, nicht in die Zellen, was zeigt, dass das funktionelle Targeting-Peptid seine intrazelluläre Abgabe erleichtern muss.

a H1299-Zellen wurden 1 Stunde lang mit biotinyliertem MGS4_V8, konjugiert an Streptavidin-Saporin, inkubiert, dann gewaschen, fixiert und mit einem Anti-Saporin-Antikörper (rot), WGA-AF488 (grün) und DAPI (blau) gegengefärbt. MGS4_V8 transportiert Saporin erfolgreich in Krebszellen, während das Kontrollpeptid MGS4_V6 dies nicht kann. b MGS4_V8- und MGS4_V9-Saporin-Konjugate wurden seriell verdünnt und 6 Stunden lang mit H1299- und H2009-Zellen inkubiert. Anschließend wurden die MGS4-Saporin-Konjugate entfernt und das vollständige Wachstumsmedium in die Vertiefungen zurückgeführt. Nach 72 Stunden wurde die Lebensfähigkeit gemessen. Die IC50-Werte finden Sie im Einschub. Einzelmessungen werden angezeigt. Der Mittelwert wird als „X“ angezeigt. Fehlerbalken in Schwarz stellen Standardfehlermessungen dar. Die nichtlineare Regressionsanalyse ist im Zusatzmaterial enthalten. c Zeitverlauf der Kolokalisierung wie zuvor, Vergleich des MGS4_V8-Streptavidin-Qdot-Handels mit dem MGS4_V8-Saporin-Handel. Pixel werden basierend auf der Intensität im roten Kanal (x-Achse) und im grünen Kanal (y-Achse) dargestellt. Kasten 1 stellt die Population von Saporinen oder Qdots dar, die nicht mit dem Lysosom kolokalisiert sind. Umgekehrt stellt Kasten 2 eine lysosomale Färbung dar, die nicht mit Qdots oder einem Saporinsignal verbunden ist. Box 3 enthält kolokalisierte Pixel, die fälschlicherweise gelb gefärbt sind und Saporin oder Qdots darstellen, die im lysosomalen Kompartiment kolokalisiert sind. Eine Subpopulation von Saporin enthaltenden Vesikeln unterscheidet sich weiterhin von Lysosomen (Kasten 1). Der Maßstabsbalken in allen Bildern entspricht 10 µm.

Die Fähigkeit des MGS4_V8-Saporin-Konjugats, den Zelltod auszulösen, wurde bestimmt. MGS4_V8-Saporin tötet H1299-Zellen mit einem IC50 von 9,4 nM. H2009-Zellen sind mit einem IC50 von 23 nM etwas resistenter (Abb. 4b). Dimeres MGS4_V9-Saporin hat einen IC50 von 7,2 nM bzw. 40 nM auf H1299- bzw. H2009-Zellen. Weder MGS4_V8 allein noch an Streptavidin ohne Saporin konjugiertes MGS4_V9 zeigten selbst bis zu Konzentrationen von 200 nM eine Toxizität (ergänzende Abbildung 4a). Darüber hinaus erreicht die Behandlung mit dem inaktiven MGS4_V6, das mit Saporin komplexiert ist, bei 200 nM keinen Zelltod von 50 % in H1299- und H2009-Zellen. Normale HBEC-Kontrollzellen erreichen weder mit MGS4_V8 noch mit MGS4_V6 eine Zelllebensfähigkeit von 50 % (ergänzende Abbildung 4b). Obwohl MGS4_V9 für beide Zelltypen einen niedrigeren EC50-Wert aufweist, verbessert die Dimerisierung weder den IC50-Wert noch die Wirksamkeit des Saporin-Konjugats, was die Wahl des Monomerpeptids als Transportmittel bestätigt.

Die Saporin-Färbung (Abb. 4) ähnelt auffallend der vorherigen MGS4-Färbung (Abb. 3c): punktförmig und perinukleär. Um jedoch den Zelltod auszulösen, muss das internalisierte Saporin Zugang zu den Ribosomen im Zytoplasma erhalten. Die Ergebnisse zur Zelllebensfähigkeit legen nahe, dass zumindest ein Teil des Saporins das Zytoplasma erreicht. Dies ist wahrscheinlich auf das durch Saporin vermittelte endosomale Entweichen vor dem Transport zu den Lysosomen zurückzuführen. Um den endosomalen Austritt zu beobachten, wurde ein Zeitverlauf durchgeführt, um die Kolokalisierung von Saporin mit Lysosomen zu beurteilen. Biotinyliertes MGS4_V8 wurde an Streptavidin-Qdot605 oder Streptavidin-Saporin konjugiert und das Konjugat mit H1299-Zellen 30 Minuten, 1 Stunde, 1 Stunde mit einem 3-stündigen Chase oder 1 Stunde mit einem 23-stündigen Chase inkubiert. Sowohl Saporin als auch Qdots verkehren im Laufe der Zeit zu Lysosomen (gelb) und reichern sich dort an (Abb. 4c). Es gibt jedoch eine diskrete Population von mit Saporin beladenen Vesikeln (rot), die dem Transport zum Lysosom entgehen und in der Qdot-Probe nicht beobachtet werden. Dies ist besonders deutlich nach 1 Stunde zu erkennen. Diese nicht kolokalisierenden, Saporin enthaltenden Vesikel werden durch den Mander-Koeffizienten deutlich; Saporin zeigt im Vergleich zu Qdots nach 1 Stunde (0,334 vs. 0,549) und 24 Stunden (0,657 vs. 0,758) eine geringere Kolokalisation (Tabelle 3). Diese Daten deuten darauf hin, dass ein Teil des Saporins aus dem lysosomalen Transport in das Zytosol entweicht, um die Zellen abzutöten. Da die Aktivität von Saporin katalytisch ist, reicht ein Bruchteil für eine wirksame Abtötung aus.

Die Verwendung von MGS4 als Transportmittel hängt von seiner Fähigkeit ab, einen Tumor in einem Tier anzugreifen. MGS4_V8 und MGS4_V6 (Kontrolle) wurden direkt an Alexa Fluor 750 konjugiert. Jedes Konjugat wurde intravenös in immungeschwächte Mäuse mit subkutanen H2009-Tumoren injiziert, und die Akkumulation des Peptids wurde durch Nahinfrarotbildgebung gemessen (Abb. 5a). Das Homing des MGS4_V8-Tumors wird nach 12 Stunden beobachtet und 85 % dieses Signals werden nach 24 Stunden aufrechterhalten. Das MGS4_V8-Signal bleibt nach 48 und 72 Stunden bestehen, was auf eine anhaltende Retention des Farbstoffs im Tumor hinweist. Zu jedem Zeitpunkt weist MGS4_V8 im Vergleich zum Kontrollpeptid ein 25- bis 40-fach erhöhtes Signal auf. Im Vergleich dazu gibt es keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen dem Signal von MGS4_V6 und den unbehandelten Tumoren (Hintergrund). Ex vivo nach 72 Stunden abgebildete Tumoren zeigten ein ähnliches Muster. Die Tumoren wurden in Paraformaldehyd fixiert, gefolgt von einer Bildgebung des gesamten Tumors auf einem LI-COR® Odyssey (Abb. 5b). Es besteht ein deutlicher visueller Unterschied zwischen Tumoren, die aus mit MGS4_V8 behandelten Mäusen isoliert wurden, im Vergleich zu denen, die mit der MGS4_V6-Kontrolle behandelt wurden oder unbehandelt waren. Die Quantifizierung der Fluoreszenz führt zu einem 240-fach höheren Signal in den mit MGS4_V8 behandelten Tumoren im Vergleich zur MGS4_V6-Gruppe. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, als bei Mäusen subkutane H1299-Tumoren etabliert wurden (ergänzende Abbildung 5). Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass MGS4_V8 über die erforderliche Spezifität, Affinität und Stabilität verfügt, um in vivo auf einen Tumor abzuzielen. Die Beibehaltung des Signals nach 72 Stunden lässt darauf schließen, dass MGS4_V8 in Krebszellen innerhalb des Tumors internalisiert wird und der NIR-Farbstoff eingeschlossen bleibt.

einem H2009-Tumor tragenden Nacktmäusen (N = 4) wurde MGS4_V8 oder MGS4_V6, konjugiert mit dem NIR-Farbstoff Alexa Fluor 750, intravenös injiziert. 12, 24, 48 und 72 Stunden nach der Injektion wurden die Mäuse anästhesiert und auf einem IVIS® (Perkin Elmer) abgebildet ), um die gesamte Strahlungseffizienz in jedem Tumor zu messen. MGS4_V8 akkumuliert im Tumor 25–39-fach besser als das Kontrollpeptid MGS4_V6. Die MGS4_V6-Akkumulation unterscheidet sich statistisch gesehen nicht von unbehandelten Tumoren. Die Ex-vivo-NIR-Bildgebung der Tumoren am Ende des Experiments spiegelt die bei lebenden Tieren beobachteten Daten wider. Whisker stellen Min- bis Max-Werte dar, das 25. bis 75. Perzentil werden durch das Kästchen dargestellt, die Linie zeigt den Median, das +-Symbol stellt den Mittelwert dar und einzelne Daten werden als Punkt angezeigt. Daten für einzelne Tiere sind in der Ergänzungstabelle 8 enthalten. b Herausgeschnittene Tumore aus dem vorherigen Experiment wurden in PBS + 4 % Formaldehyd fixiert und dann erneut zusammen auf einem LI-COR® Odyssey abgebildet. Für jeden Tumor wurden willkürliche Fluoreszenzeinheiten (AFU) bestimmt und der Durchschnitt und die SEM werden unter dem Bild angezeigt. Die mittlere Fluoreszenzintensität ist für das MGS4_V8-Alexa Fluor 750-Konjugat 240-fach höher als für das MGS4_V6-Kontrollkonjugat. c Saporin wurde entweder an zielgerichtetes MGS4_V8 oder nicht zielgerichtetes MGS4_V6 konjugiert und 7,5 µg des Konjugats wurden intravenös in Mäuse mit subkutanen Tumoren injiziert. Den Tieren wurde 2,5 Wochen lang zweimal pro Woche eine Dosis verabreicht (angezeigt durch Pfeile). Die Tumoren wurden jeden zweiten Tag gemessen. MGS4_V8-Saporin verlangsamt deutlich das Tumorwachstum, während nicht gezielt eingesetztes Saporin im Vergleich zu unbehandelten Tieren keine Wirkung zeigt. Fehlerbalken stellen SEM dar, *p-Wert < 0,05, **p-Wert < 0,01, ***p-Wert < 0,001, ****p-Wert < 0,0001 (Zwei-Wege-ANOVA). d Die Tumorgröße (mm3) wird für einzelne Tiere an den Tagen 0, 6, 12 und 18 angezeigt. Der Mittelwert wird durch die horizontale Linie dargestellt und die Fehlerbalken stellen den Standardfehler dar. Es gibt an keinem Tag einen statistischen Unterschied zwischen MGS4_V6-Saporin und unbehandeltem. An den Tagen 12 und 18 unterscheidet sich MGS4_V8-Saporin statistisch von unbehandeltem (p-Werte 0,0099 bzw. 0,0029) und MGS4_V6-Saporin (p-Werte 0,0069 bzw. 0,0009).

Um die Wirksamkeit in einem Tiermodell nachzuweisen, wurden weiblichen Nacktmäusen H2009-Tumoren subkutan in die Flanken implantiert. Als die H2009-Tumore ~100 mm3 erreichten, wurden den Mäusen 7,5 µg MGS4_V8-Saporin oder 7,5 µg acetyliertes MGS4_V6-Saporin (Kontrollpeptid) über die Schwanzvene injiziert, 2x/Woche für insgesamt 5 Injektionen. Auf MGS4_V8 ausgerichtetes Saporin verlangsamte das Tumorwachstum im Vergleich zum Kontrollpeptid signifikant (Abb. 5c, d). Obwohl der Tumor im Laufe der Behandlung nicht eliminiert wird, blieb das Tumorvolumen in den ersten 10 Tagen der Behandlung unverändert. Im Vergleich dazu hatten Tumore, die mit dem nicht zielgerichteten Saporin behandelt wurden, ihre Größe um das Dreifache erhöht. Am 18. Tag waren die mit MGS4_V8-gerichtetem Saporin behandelten Tumoren halb so groß wie die Tumoren in beiden Kontrollgruppen. Die nicht zielgerichtete Saporin-Kontrollbehandlung, MGS4_V6-Saporin, unterscheidet sich nicht von den unbehandelten Tumoren, was die Notwendigkeit von MGS4_V8 für die Abgabe des Saporins unterstreicht.

Tumor-Targeting-Liganden sind Schlüsselkomponenten in Medikamentenverabreichungssystemen gegen Krebs. Obwohl monoklonale Antikörper die fortschrittlichsten klinisch verfügbaren Targeting-Wirkstoffe sind, erweisen sich Peptide als praktikable Alternative19,20,21. Im Vergleich zu Antikörpern haben Peptide eine schnellere Entwicklungszeit und geringere Produktionskosten, da sie leicht synthetisiert werden können, was eine schnelle, iterative Optimierung ihrer Stabilität, Affinität, Spezifität, Löslichkeit und Hydrophobie ermöglicht. Außerdem sind Peptide kleiner, was eine tiefere Penetration bei der Behandlung solider Tumoren ermöglicht22. Die meisten Targeting-Peptide konzentrierten sich auf natürlich vorkommende Peptidliganden oder verwandte Analoga, die an bei Krebs hochregulierte Rezeptoren binden, z. B. Bombesin, Luteinisierendes Hormon-Releasing-Hormon und das Tripeptid RGD. 177Lu-Dotatat, ein radioaktiv markiertes Somatostatin-Derivat, erhielt Anfang 2018 die beschleunigte Zulassung der FDA und ist das erste zugelassene Peptid-Wirkstoff-Konjugat23. ANG1005, ein an Paclitaxel konjugiertes LDL-Rezeptor-verwandtes Protein 1-Zielpeptid, befindet sich in klinischen Studien zur Behandlung von Hirnmetastasen24 und TH1902, ein Docetaxel-Konjugat an ein Sortilin-bindendes Peptid, ist kürzlich in klinische Phase-I-Studien eingetreten25.

Biopanning von Phagen-präsentierten Peptidbibliotheken ermöglicht eine schnelle Auswahl von Peptiden, die sowohl binden als auch die Internalisierung spezifisch in Krebszellen initiieren11. Die Fähigkeit zum Screening auf Internalisierung ist für Anwendungen zur Arzneimittelverabreichung von entscheidender Bedeutung, da die meisten Chemotherapeutika intrazelluläre Ziele haben; Liganden und/oder Rezeptoren, die nicht internalisieren oder eine langsame zelluläre Aufnahme aufweisen, sind wahrscheinlich keine guten Kandidaten. Dieser Ansatz ist robust und hat zur Identifizierung zahlreicher Peptid-Targeting-Wirkstoffe mit hoher Zellspezifität geführt10. Der Auswahlprozess ist unvoreingenommen und erfordert keine Kenntnis des Zelloberflächenrepertoires. Obwohl der zelluläre Rezeptor für MGS4 unbekannt bleibt, kann die Peptidbindung als Ersatzbiomarker dienen, ohne dass ihr zelluläres Ziel bekannt ist. Derzeit laufen Studien zur Identifizierung des zellulären Rezeptors und zur Bestimmung seiner Expressionsniveaus in normalen Geweben.

Die ersten Treffer dieser Selektionen sind Leitverbindungen, die als Fusionen mit dem pIII-Hüllprotein auf filamentösen Phagen ausgewählt werden. Hier haben wir die minimale Bindungsdomäne von MGS4 identifiziert und sie chemisch optimiert, um Affinität und Stabilität zu verbessern. Peptide werden im Vergleich zu Antikörperkandidaten aufgrund ihrer begrenzten Serumstabilität und schwächeren Affinitäten oft als schlechte Targeting-Mittel bezeichnet. Wir zeigen jedoch, dass ein monomeres Peptid eine geringe nanomolare Affinität zu seinen Zielzellen aufweist, vergleichbar mit Antikörpern, aber nur 1/100 der Größe. Die Modifikation beider Enden stabilisiert das Peptid im Serum. Wichtig ist, dass MGS4_V8 eine schnelle Internalisierung in die Zelle auslöst. Dies steht im Gegensatz zu vielen therapeutischen Antikörpern, die gegen Rezeptoren entwickelt wurden, die langsame Internalisierungsraten aufweisen26,27. Überraschenderweise internalisiert die Monomerversion im gleichen Ausmaß wie die dimeren und tetrameren Peptide und transportiert sie zum gleichen subzellulären Ort. Abhängig vom Zelltyp werden 40.000–100.000 Peptidmoleküle pro Zelle in 1 Stunde internalisiert und erreichen eine intrazelluläre Konzentration von 40–100 nM28. Weitere kinetische Studien sind im Gange, um festzustellen, ob die intrazelluläre Konzentration des Peptids mit der Zeit zunimmt. Bemerkenswert ist, dass eine Reihe von Liganden mit unterschiedlichen Affinitäten für ein tumorspezifisches Ziel und unterschiedlichen Internalisierungsraten wertvoll sein könnten, um die Affinitätsbarriere zu überwinden14. Dieses Phänomen behindert manchmal das Eindringen in einen Tumor, da der Ligand schnell von den ersten Tumorzellen, auf die er trifft, abgesondert wird.

MGS4_V8 kann so modifiziert werden, dass es eine Vielzahl von Ladungen in Zellen transportiert, ohne seine Zellbindungs- oder Spezifitätseigenschaften zu verändern. Dies wird in dieser Studie deutlich, da MGS4 Proteine ​​(Streptavidin, Saporin), Farbstoffe und Quantenpunkte lieferte. Ein ideales Therapeutikum zur gezielten Verabreichung sollte mehrere Hauptmerkmale aufweisen. Erstens sollte das Therapeutikum zellundurchlässig sein, außer wenn es an einen Trägerstoff konjugiert ist, wodurch die möglichen Nebenwirkungen außerhalb des Ziels begrenzt werden, wenn es vorzeitig von seinem Träger freigesetzt wird. Zweitens sollte es bei niedrigen Dosen wirksam sein, da die rezeptorvermittelte Aufnahme wahrscheinlich keine intrazellulären Konzentrationen erreicht, die mit zellpermeablen niedermolekularen Therapeutika erreichbar sind. Drittens muss es intrazellulären Vesikeln entkommen, um sein Ziel zu erreichen. Saporin erfüllt alle diese Kriterien. Es handelt sich um ein Typ-1-RIP ohne nativen Tropismus für Säugetierzellen und ist ohne Transportvehikel nicht in der Lage, die Zellmembran zu durchdringen. Als rRNA-N-Glycosidase-Enzym inaktiviert Saporin katalytisch die große ribosomale Untereinheit und erfordert keine stöchiometrischen Mengen, um sein Ziel zu inaktivieren. Diese Aktivität stört die Proteinsynthese in ruhenden und sich aktiv teilenden Zellen. Saporin kann intrazelluläre Vesikel verlassen und das Zytoplasma und andere subzelluläre Organellen erreichen29. Schließlich wurden zusätzliche Wirkmechanismen für Saporin unabhängig von seiner N-Glycosidase-Aktivität identifiziert, die seine potenzielle Zytotoxizität erhöhen30,31,32,33. Die Konjugation von Saporin mit einem zellspezifischen Targeting-Wirkstoff, der die Internalisierung auslöst, eröffnet sein therapeutisches Potenzial.

Die Kopplung von biotinyliertem MGS4_V8 an ein Saporin-Streptavidin-Konjugat führt zu einem zytotoxischen Wirkstoff. Aufgrund der katalytischen Natur von Saporin ist der IC50-Wert für die Peptidbindung und -internalisierung niedriger als der EC50-Wert. Ein potenzielles Problem ist der mögliche Einschluss und Abbau von Saporin im Lysosom. Die Endozytose des MGS4_V8-Peptids führt zu einer lysosomalen Akkumulation, die mit der Zeit zunimmt. Nach 30 Minuten ist markiertes MGS4_V8 nicht mit dem Lysosom kolokalisiert, sondern in punktförmigen Vesikeln zu sehen, bei denen es sich wahrscheinlich um endosomale Kompartimente handelt. Nach einer Stunde sind 70 % des Peptids im Lysosom lokalisiert. Dennoch zeigt das MGS4_V8-Saporin-Konjugat Zellzytotoxizität, was wahrscheinlich darauf zurückzuführen ist, dass ein Teil des Saporins dem lysosomalen Handel entgeht. Unsere Mikroskopiedaten deuten darauf hin, dass es eine diskrete Subpopulation MGS4_V8-Saporin gibt, die nicht mit dem Lysosom kolokalisiert ist, was mit der Fähigkeit von Saporin zum endosomalen Entweichen übereinstimmt. Diese Population ist wahrscheinlich klein, da keine diffuse Zytoplasmafärbung beobachtet wird, aber stark genug, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu beeinträchtigen. Ansätze zur weiteren Erleichterung des endosomalen/lysosomalen Entweichens von Saporin könnten die Wirksamkeit von MGS4-Saporin-Konjugaten verbessern34,35,36. Wichtig ist, dass MGS4_V8 Potenzial als Peptid-Wirkstoff-Konjugat hat, bei dem der lysosomale Handel mit Arzneimittelkonjugaten die Verwendung von säurelabilen oder durch Cathepsin spaltbaren Linkern zur Freisetzung des Arzneimittels ermöglicht21.

Saporin-Konjugate haben als nützliche biologische Hilfsmittel gedient, haben aber auch Potenzial als klinische Therapeutika16,17,18. Saporin wurde an unterschiedliche Targeting-Einheiten konjugiert, von denen die meisten auf Antikörpern basieren37. Wir zeigen, dass MGS4_V8-Saporin in einem Mausmodell eine Antitumorwirksamkeit aufweist. Die Verwendung des nicht zielgerichteten MGS4_V6-Peptids führt zu keiner Verringerung der Tumorgröße im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Obwohl noch kein vollständiges Pharmakokinetik- und Toxizitätsprofil erstellt wurde, wurde keine grobe Toxizität beobachtet. Es sind umfassende Bioverteilungsstudien und Toxikologiestudien erforderlich, um Nebenwirkungen außerhalb des Ziels anzugehen. Darüber hinaus sind Verbesserungen am MGS-Saporin-Linker erforderlich. Diese Daten zeigen jedoch, dass MGS4_V8 bei intravenöser Verabreichung aktives Saporin an einen Tumor eines Tieres abgeben kann, und unterstützen die weitere Erforschung in präklinischen Modellen.

Zwei klinische Studien der Phasen I/II mit Immun-Saporin-Konjugaten wurden abgeschlossen. Das erste verwendete Maus-Anti-CD30-Antikörper-Saporin-Konjugat zur Behandlung von refraktärem Hodgkin-Lymphom38. Trotz vielversprechender klinischer Reaktionen entwickelten die Patienten eine Immunantwort sowohl gegen den Antikörper als auch gegen das Toxin. Als dosislimitierende Toxizität wurde das Vasculature-Leak-Syndrom (VLS) beobachtet. Ein zweiter Versuch mit einem bispezifischen Antikörper gegen CD22 und Saporin zeigte weniger Nebenwirkungen, darunter eine Verringerung des VLS und keine Anti-Saporin-Immunantwort39. Beide Versuche wurden mit Mausantikörpern der frühen Generation durchgeführt. Während es in letzter Zeit keine klinischen Studien mit Saporin-Konjugaten zur Krebsbehandlung gab, erwies sich Saporin in Verbindung mit Substanz P zur Schmerzbehandlung in einer klinischen Phase-I-Studie (NCT02036281) als sicher und wurde erfolgreich zur Schmerzbehandlung bei Hunden mit Knochenkrebs eingesetzt40.

Eine wachsende Zahl gezielter Wirkstoffe gegen Krebsbiomarker hat das Interesse an Immuntoxinen erhöht41,42,43,44,45,46,47. Die Entwicklung von Toxinen zur Entfernung immunogener Epitope und der VLS-Aktivität schreitet weiter voran48,49,50,51. Zusätzlich zu Saporin wurden die pflanzlichen RIP-Toxine Gelonin, Ricin und das antivirale Protein der Kermesbeere in Immuntoxinen eingesetzt52, einschließlich des Abschlusses einer Phase-I-Studie mit einem Anti-CD33-Gelonin-Immunkonjugat zur Behandlung refraktärer myeloischer Malignome53. Darüber hinaus wurden Toxine aus bakteriellen Quellen wie Pseudomonas-Exotoxin A und Diphtherietoxin als therapeutische Einheiten für Immuntoxine verwendet54,55,56,57. Ontak, ein Interleukin-2-Diphtherietoxin-Fusionsprotein, wurde von der FDA für die Behandlung des kutanen T-Zell-Lymphoms zugelassen, wurde jedoch aufgrund von Produktionsproblemen inzwischen eingestellt. Tagraxofusp ist ein gegen IL-3 gerichtetes Diphtherietoxin, das 2018 für die klinische Verwendung zur Behandlung von Blasten-plasmozytoiden dendritischen Zellneoplasmen zugelassen wurde58. Lumoxiti, ein CD22-PE38-Konjugat, erhielt 2018 die FDA-Zulassung für rezidivierende oder refraktäre Haarzellenleukämie59. In der Phase-III-Studie wurde bei 30 % der Patienten ein dauerhaftes vollständiges Ansprechen erreicht.

Zusammenfassend haben wir ein hochaffines, krebsspezifisches Peptid entwickelt, das in vitro und in vivo aktive Proteintoxine an NSCLC-Zellen abgeben kann. Dieses Peptid kann als Antikörperersatz in herkömmlichen ADCs dienen und so Kosten und Produktionszeit reduzieren. Die Fähigkeit, Ladung chemisch definiert zu konjugieren, ist ein Vorteil gegenüber ADC. Da das parentale MGS4-Peptid mehrere Krebszelltypen über NSCLC hinaus bindet, gehen wir davon aus, dass MGS4_V8 bei anderen Krebsarten einen erweiterten Nutzen finden wird. MGS4-Peptidvarianten können entweder durch Gentechnik oder chemische Konjugation in eine Vielzahl unterschiedlicher Proteintoxine eingebaut werden, was ihren Wert steigert.

NovaPEG Rink Amidharz und FMOC-Glu(biotinyl-PEG)-OH wurden von NovaBiochem® (Millipore Sigma, Billerica, MA) bezogen. 2-(6-Chlor-1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorphosphat (HCTU), N,N-Dimethylmethanamid, N-Methylmorpholin, 2,2,2-Trifluoressigsäure und Alle FMOC-Aminosäuren wurden von Gyros Protein Technologies (Tucson, AZ) gekauft. FMOC-NH-(PEG)11-COOH (C42H65NO16) wurde von Polypure (Oslo, Norwegen) bezogen. Triisopropylsilan und 1,2-Ethandithiol wurden von Sigma Aldrich (Livermore, CA) bezogen. Piperidin wurde von Alfa Aesar (Tewksbury, MA) und Acetonitril, Dichlormethan und Diethylether von VWR (Radnor, PA) bezogen.

Die folgenden GFP-markierten Konstrukte wurden verwendet: Plasmamembranmarkierung Src-myrisylated-GFP, pmyr GFP (Addgene-Plasmid Nr. 50528) war ein Geschenk von Kenneth Yamada. Golgi-Markierung Beta-1,4-Galactosyltransferase 1-GFP, PA-GFP (Addgen-Plasmid Nr. 57164), Lysosomen-Markierung Lamp-1-GFP, Emerald-Lysosom-20 (Addgen-Plasmid Nr. 56476). ER-Markierung SigPep-eGFP-KDEL, mEGFP-endoplasmatisches Retikulum (Addgen-Plasmid Nr. 56455), Mitochondrien-Markierung der mitochondrialen Importrezeptor-Untereinheit Translokase der äußeren Membran 20 kDa-Untereinheit-GFP, mEmerald-TOMM20-N-10 (Addgen-Plasmid Nr. 54282), Kern Label SV40 NLS-GFP, mEmerald-Nucleus 7 (Addgene-Plasmid # 54206) und Zytoplasma-Label Argonaut 3 Isoform A-GFP, mEmerald-EIF2C3-C18 (Addgene-Plasmid # 54078) waren Geschenke von Michael Davidson. Golgi-Markierung Tyrosylprotein-Sulfotransferase 2, TPST2-EGFP war ein Geschenk von David Stephens (Addgene-Plasmid Nr. 66618). Die Selektionen wurden in G418 oder durch Grenzverdünnung durchgeführt.

Die Peptidsynthese, -spaltung, -reinigung und -multimerisierung wurde wie zuvor veröffentlicht durch Festphasensynthese durchgeführt60. Multimere Peptide wurden auf einem Lysin- (Dimer) oder Trilysin- (Tetramer) Kern synthetisiert. Die Peptidstrukturen (ergänzende Abbildung 1) werden in ergänzenden Materialien bereitgestellt. Die Peptidmassen wurden durch MALDI/TOF-Massenspektrometrie bestätigt und waren durch analytische HPLC zu >95 % rein.

Die Zelllinien wurden von John Minna und Adi Gazdar (UT Southwestern Medical Center) bereitgestellt oder von ATCC® gekauft und in RPMI, ergänzt mit Glutamin + 5 % fötalem Rinderserum (Gemini Bio-Products, Sacramento, CA), gehalten. Die Zellen wurden monatlich genotypisiert (Bio-synthesize, Lewisville, TX), um ihre Identifizierung zu bestätigen und auf eine Mycoplasma-Infektion untersucht.

Biotinyliertes Peptid wurde 30 Minuten lang an Streptavidin-R-Phycoerythrin oder Streptavidin-Alexa Fluor 647 (Molverhältnis 1:1) konjugiert. Die offenen Bindungsstellen auf Streptavidin wurden mit RPMI 1640 gequencht und auf die angegebene Konzentration verdünnt. Tumorzellen wurden bis zu einer Konfluenz von 90 % in einer Platte mit 12 Vertiefungen gezüchtet und dann mit 500 µl Peptid-Farbstoff-Konjugat bei 37 °C inkubiert. Nach 1 Stunde wurde das Peptid entfernt und die Zellen wurden 3x mit PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4) und 2x mit 0,1 M HCl-Glycin pH2,2 in 0,9 % gewaschen. NaCl und 1x PBS-Spülung. Die Zellen wurden durch Trypsinisierung entfernt. Die Durchflusszytometrie wurde auf einem BD FACSCelesta durchgeführt und die Daten wurden mit der Flowing-Software analysiert. Die Zellen wurden basierend auf der Vorwärts- und Seitwärtsstreuung so eingegrenzt, dass nur lebensfähige Zellen einbezogen wurden, und es wurden mindestens 10.000 Ereignisse gezählt. Es wurde eine Region ermittelt, die <5 % der Zellen in der Negativkontrolle enthielt, und die relative Peptidaufnahme anhand der mittleren Fluoreszenzintensität dieser Population ermittelt11. Für die absolute Peptidaufnahme pro Zelle wurde eine Standardkurve mit Quantum™ Alexa Fluor 647-Mikrosphären (Bangs Laboratory, Fishers, IN) erstellt. Eine repräsentative lineare Regression, die die Korrelation von Moleküläquivalenten löslicher Fluorophore (MESF) mit der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) zeigt, ist in der ergänzenden Abbildung 6 dargestellt. Die Zellen wurden basierend auf der Vorwärts- und Seitenstreuung so erfasst, dass nur lebensfähige Zellen und mindestens 10.000 enthalten waren Ereignisse wurden gezählt. Der MFI wurde bei der Peakhöhe mit 50 % bestimmt. Die pro Zelle internalisierten Moleküle wurden anhand der Standardkurve bestimmt, die MESF mit MFI in Beziehung setzt, und durch die Anzahl Farbstoffmoleküle/MGS-Konjugat dividiert. Ein Beispiel ist in der ergänzenden Abbildung 7 dargestellt. GraphPad Prism® wurde für die nichtlineare Regressionskurvenanpassung zur Berechnung eines EC50 verwendet. Parameter und statistische Analysen werden bereitgestellt (Ergänzungstabellen 2–6). Die Experimente wurden mindestens dreimal wiederholt.

Plasmide mit organellenspezifischen Markern, die mit GFP markiert waren, wurden von Addgene (Cambridge, MA) gekauft und in H1299-Zellen elektroporiert. GFP-markierte Tumorzellen wurden auf 8-Well-Kammerobjektträgern ausplattiert. Biotinyliertes Peptid wurde 30 Minuten lang bei RT an Streptavidin-Alexa Fluor 555 (1:1) konjugiert und mit RPMI gequencht und dann bei 50 nM in die Vertiefungen gegeben. Nach einer Stunde Inkubation wurden die Zellen wie beschrieben gewaschen. Die Zellen wurden in 2 % Formaldehyd fixiert. Es wurde EverBrite™ (Biotium, Freemont, CA) Eindeckmedium mit DAPI verwendet. Wenn angezeigt, wurde die Zelloberfläche mit Weizenkeimagglutin (WGA) gegengefärbt, das mit Alexa Fluor 488 markiert war. Die Mikroskopie wurde auf einem Zeiss LSM 700 mit einem Pln Apo 63x/1,4-Öl-DIC-III-Objektiv durchgeführt. Die Bilder wurden mit der Zen-Software verarbeitet.

Der Zeitverlauf für die lysosomale Akkumulation wurde durch Bildgebung zu angegebenen Zeitpunkten unter Verwendung von biotinyliertem Peptid, konjugiert mit Streptavidin-Alexa Fluor 555, Streptavidin-Qdot605 oder Streptavidin-Saporin, durchgeführt. Saporin wurde unter Verwendung des polyklonalen Anti-Saporin-Kaninchen-Antikörpers AB-41AP (1:100-Verdünnung) (Advanced Targeting Systems Bio, San Diego, CA) nachgewiesen. Es wurden Schwellenwerte für Ch1 festgelegt, das das Peptid im roten Kanal darstellt (75), und für Ch2, das das Lysosom im grünen Kanal darstellt (55). Jedes Pixel einer einzelnen Schicht wurde hinsichtlich des Überschreitens des Schwellenwerts in Rot (Kasten 1), Grün (Kasten 2) oder beiden (Kasten 3) für die Kolokalisierung bewertet. Mander-Koeffizienten werden für jede Schicht berechnet, wobei 0 keine Kolokalisierung angibt und 1 eine vollständige Kolokalisierung bedeutet.

Biotinyliertes Peptid wurde in einem Molverhältnis von 1:1 an Streptavidin-Saporin (Advanced Targeting Systems Bio, San Diego, CA) konjugiert. Steigende Dosen des Peptid-Wirkstoff-Konjugats in dreifacher Ausfertigung wurden 6 Stunden lang bei 37 °C auf den Zellen inkubiert. Das Medikament wurde entfernt und durch vollständiges Wachstumsmedium ersetzt. Nach 72 Stunden wurde die Lebensfähigkeit der Zellen mit CellTiter-GLO® (Promega, Madison, WI) gemessen. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde auf unbehandelte Zellen normalisiert. IC50-Werte wurden mit GraphPad Prism® unter Verwendung von Log (Agonist) vs. Antwort-Variablen-Steigung (vier Parameter) berechnet. Daten aus einzelnen Experimenten sowie die Parameter und statistischen Analysen finden Sie im Zusatzmaterial. Für jede Variante und Zelllinie wurden mindestens vier biologische Replikate durchgeführt.

Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee von SRI International genehmigt (Animal Welfare Assurance Number A3025-01, Protokoll 14008). H2009-Zellen (106) oder H1299-Zellen (106) wurden subkutan in die Flanke weiblicher Nu/Nu-Mäuse implantiert (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Als die Tumore 100 mm3 erreichten, wurden In-vivo-Experimente eingeleitet. Zur Bildgebung wurden die angegebenen Peptide direkt an den Nahinfrarotfarbstoff Alexa Fluor 750 konjugiert (ergänzende Abbildung 1). Es wurden vier Tiere pro Gruppe verwendet. Peptide wurden in einer Gesamtdosis von 15 µg/Maus in die seitliche Schwanzvene injiziert und in 100 µL verabreicht. Zu festgelegten Zeiten wurden die Tiere betäubt und auf einem IVIS® (Perkin Elmer) abgebildet. Um den Tumor herum wurden interessierende Bereiche gezeichnet und die Gesamtstrahlungseffizienz gemessen. Für therapeutische Experimente haben wir uns für das H2009-Tumormodell entschieden, da es eine höhere Tumoraufnahmerate und eine gleichmäßigere Wachstumsrate aufweist als das H1299-Modell. Biotinyliertes MGS4_V8 (N = 9) oder MGS4_V6 (N = 8) wurden an Streptavidin-Saporin konjugiert und über eine Schwanzveneninjektion (7,5 µg/100 µl) 2x/Woche für 2,5 Wochen für insgesamt 5 Behandlungen verabreicht. Als Kontrolle dienten unbehandelte Tiere (N = 8). Die Tumorgröße wurde jeden zweiten Tag mit einem Messschieber gemessen und das Volumen wurde als (π/6)(l*w)3/2 berechnet. Die statistische Analyse wurde auf GraphPad Prism® durchgeführt.

Für alle EC50-Bestimmungen wurde jede Peptidvariante an der angegebenen Zelllinie mit mindestens 3 biologischen Replikaten getestet und einzeln mittels Durchflusszytometrie analysiert. Der Standardfehler der einzelnen Konzentrationen wird in den Abbildungen durch Fehlerbalken angezeigt. Für Experimente, bei denen die absolute Anzahl der internalisierten Moleküle bei verschiedenen Konzentrationen gemessen wurde, wurde EC50 mit GraphPad Prism® mithilfe einer nichtlinearen Regressionskurvenanpassung für Log (Agonist) vs. Antwort-Variablen-Steigung (vier Parameter) bestimmt. Für die Verkürzungsexperimente wurde EC50 mithilfe einer ortsspezifischen Bindung bestimmt. In ähnlicher Weise wurden die IC50-Werte mit GraphPad Prism® unter Verwendung von Log (Agonist) vs. Antwort-Variablen-Steigung (vier Parameter) berechnet. Für jede Variante und Zelllinie wurden mindestens vier biologische Replikate durchgeführt. Daten für einzelne Experimente sind in ergänzenden Dateien enthalten. Parameter und statistische Analysen finden Sie in den Ergänzungstabellen 2–7.

Für therapeutische In-vivo-Experimente wurden Tiergruppengrößen von N = 9 für MGS4_V8, N = 8 für MGS4_V6 und N = 8 für unbehandelte Tiere verwendet. Die Tumoren wurden von einem unabhängigen Forscher ohne Kenntnis der Behandlungsgruppen gemessen. SEM werden in den Abbildungen als Fehlerbalken dargestellt. Für die Tumorbildgebung wurden 4 Tiere pro Gruppe verwendet und Fehlerbalken stellen Standardfehlermessungen dar. Für alle In-vivo-Experimente sind Daten für einzelne Mäuse in der Ergänzungstabelle 9 enthalten. Die statistische Signifikanz wurde durch Zwei-Wege-ANOVA unter Verwendung des Mehrfachvergleichstests von Tukey bestimmt. P-Werte < 0,05 gelten als signifikant und werden in den Abbildungen wie folgt dargestellt: *p-Wert < 0,05, **p-Wert < 0,01, ***p-Wert < 0,001, ****p-Wert < 0,0001.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

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Wir danken Emily Miller für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health [IRO1CA164447-01] und internen Forschungs- und Entwicklungsmitteln von SRI International unterstützt.

SRI International, Abteilung Biowissenschaften, 140 Research Drive, Harrisonburg, VA, 22802, USA

Curtis A. Allred, Claire Gormley, Indu Venugopal, Shunzi Li, Michael J. McGuire und Kathlynn C. Brown

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Konzept und Design der Studie wurden von CAAMJM und KCB durchgeführt. Die Datenerfassung wurde von CAA, CG und IV durchgeführt. Die Peptidsynthese und -charakterisierung wurde von SL durchgeführt. Die Analyse und Interpretation der Daten wurde von CAA, CG, IV, MJM und KCB Drafting durchgeführt Die Erstellung des Manuskripts erfolgte durch CAA und KCB. Die Finanzierung erfolgte durch KCB

Korrespondenz mit Kathlynn C. Brown.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Manish Charan, Andrea Bolognesi und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Marina Holz und Karli Montague-Cardoso.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Allred, CA, Gormley, C., Venugopal, I. et al. Tumorspezifische intrazelluläre Abgabe: peptidgesteuerter Transport eines katalytischen Toxins. Commun Biol 6, 60 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04385-7

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Eingegangen: 01. Juni 2021

Angenommen: 20. Dezember 2022

Veröffentlicht: 17. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04385-7

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