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Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 8967 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Zahnstein ist eine wertvolle Ressource für die Rekonstruktion der Ernährungsgewohnheiten und des oralen Mikrobioms früherer Populationen. Im Jahr 2020 wurden die sterblichen Überreste von Herzog Alessandro Farnese und seiner Frau Maria D'Aviz exhumiert, um neue Erkenntnisse über die Todesursachen zu gewinnen. Ziel dieser Studie war es, das Zahnstein-Metabolom des Adelspaares durch ungezielte Metabolomik zu untersuchen. Die pulverisierten Proben wurden in einer Wasser-Ameisensäure-Mischung entkalkt, mit Methanol/Acetonitril extrahiert und durch Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie gekoppelt mit hochauflösender Massenspektrometrie (UHPLC-HRMS) unter Verwendung einer Umkehrphasentrennung gefolgt von Elektrospray-Ionisation analysiert Vollständiger Scan im Positiv- und Negativionenmodus. Es wurde ein High-Definition-Hybrid-Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometer Synapt-G2-Si von Waters verwendet. Signifikante Merkmale wurden dann mithilfe des MSE-Erfassungsmodus identifiziert und Informationen über die genaue Masse der Vorläufer- und Fragmentionen innerhalb desselben Laufs aufgezeichnet. Dieser Ansatz ermöglichte zusammen mit der Datenvorverarbeitung und der multivariaten statistischen Analyse die Identifizierung von Verbindungen, die zwischen den untersuchten Proben unterscheiden können. Es wurden mehr als 200 Metaboliten identifiziert, wobei Fettsäuren, Alkohole, Aldehyde, Phosphatidylcholine, Phosphatidylglycerine, Ceramide und Phosphatidylserine die am häufigsten vorkommenden Klassen sind. Außerdem wurden Metaboliten aus Nahrungsmitteln, Bakterien und Pilzen bestimmt, die Aufschluss über die Gewohnheiten und den Mundgesundheitszustand des Paares geben.

Zahnstein ist ein mineralisierter mikrobieller Plaque, der sich an der Zahnoberfläche ansammelt1. Das Mineral wird aus der Taschenflüssigkeit abgelagert, entsteht aber letztendlich durch Ausfällung von Kalziumsalzen im Speichel. Aus diesem Grund ist die Konzentration des Zahnsteins an den Stellen, die den Ausführungsgängen der Speicheldrüsen am nächsten liegen, höher2. Da Zahnstein hauptsächlich aus anorganischen Bestandteilen besteht, darunter Hydroxylapatit, Fluorapatit, Octacalciumphosphat und Whitlockit3, ist er in archäologischen Proben gut erhalten und kann Biomoleküle (z. B. DNA, Proteine ​​und Lipide) enthalten, die mit der oralen Mikrobiota, dem Wirt, assoziiert sind. und Mikrodebris exogenen Ursprungs4,5,6,7. Daher war Zahnstein in den letzten zwei Jahrzehnten eine wichtige Ressource zur Untersuchung des Gesundheitszustands, des Lebensstils und der Ernährung früherer Bevölkerungsgruppen. Optische Mikroskopie8, Rasterelektronenmikroskopie, auch gekoppelt mit energiedispersiver Röntgenspektroskopie9,10, Pyrolyse-Gaschromatographie-Massenspektrometrie11 und Multi-Omics-Techniken einschließlich Proteomik, Genomik und Metabolomik12,13 erwiesen sich als wertvolle Techniken zur Charakterisierung von darin eingeschlossenen exogenen Trümmern Zahnstein, der Informationen über die Gewohnheiten und die Gesundheit früher lebender Personen liefert. Um einen umfassenden Fingerabdruck der untersuchten Proben liefern zu können, sind auf Massenspektrometrie basierende Omics-Strategien aufgrund ihrer Empfindlichkeit, ihres hohen Durchsatzes und ihrer Unterscheidungskraft besonders vielversprechend. Einer der wichtigsten Vorteile dieser Techniken liegt darin, dass sie nicht zielgerichtet sind und somit Informationen über eine Vielzahl von Biomolekülen liefern und die Identifizierung von Biomarkern ermöglichen.

In Kombination mit der Verwendung von Bioinformatik und rechnerischen Ansätzen spielt die Metabolomik eine Schlüsselrolle beim Verständnis des Metaboloms und bei der Identifizierung von Metaboliten, die in biologischen Proben vorhanden sind14,15,16. Verschiedene Analyseplattformen, darunter hochauflösende Massenspektrometrie (HRMS), gekoppelt mit Gas- und Flüssigkeitschromatographie (GC-HRMS, GCxGC-HRMS und LC-HRMS) und Kernspinresonanz (NMR), können eingesetzt werden, um eine umfassende Abdeckung zu erreichen Metabolom. Aufgrund der im Vergleich zur NMR verbesserten Spezifität, Empfindlichkeit und Verfügbarkeit großer Spektraldatenbanken wird HRMS häufig für die Metabolomik-Profilierung verschiedener Bioflüssigkeiten, Gewebe und anderer biologischer Proben eingesetzt17,18,19. Insbesondere Analysestrategien, die eine Online-Kopplung orthogonaler UHPLC-Trennungen mit HRMS beinhalten, stellen die besten Werkzeuge zur Erweiterung der Metabolitenabdeckung20 dar, da UHPLC zu den effizientesten Trenntechniken21 zählt und ihre Kombination mit HRMS die Identifizierung eines breiten Spektrums von Metaboliten22 ermöglicht.

Kürzlich untersuchten Velsko und Co-Autoren das Zahnstein-Metabolom sowohl in modernen als auch in antiken Proben mithilfe gezielter und ungezielter MS-basierter Ansätze23. Insbesondere der Einsatz von UHPLC in Verbindung mit hochauflösender Tandem-Massenspektrometrie (UHPLC-HRMS/MS) und GC-HRMS ermöglichte die Identifizierung von Metaboliten, die zu verschiedenen chemischen Klassen gehören, hauptsächlich Lipide und Aminosäuren, zusammen mit mehreren xenobiotischen Verbindungen. Bereitstellung von Einblicken in die Mikrobiomaktivität, Stoffwechselprozesse und Abbaumuster.

In der vorliegenden Studie wurde UHPLC-HRMS unter Verwendung eines Hybrid-Quadrupol-Time-of-Flight-Massenspektrometers Synapt-G2-Si High-Definition (HD)MS QTOF von Waters eingesetzt, um das Metabolom des Zahnsteins von Herzog Alessandro Farnese und seiner Frau Maria zu untersuchen D'Aviz, der im 16. Jahrhundert das Herzogtum Parma und Piacenza regierte. Alessandro Farnese (1545–1592), ein wichtiges Mitglied des Hofes Philipps II. von Spanien, gehörte zu den einflussreichsten militärischen und politischen Führern des 16. Jahrhunderts und errang zahlreiche Siege, insbesondere in Flandern, wo er 15 Jahre lang Gouverneur war. Der durch seinen Erfolg geweckte Neid ließ den Verdacht aufkommen, dass sein Tod durch eine Vergiftung verursacht werden könnte. Um diesen Zweifel auszuräumen, wurden im Jahr 2020 die sterblichen Überreste von Alessandro Farnese und seiner Frau aus der Krypta der Basilika Santa Maria della Steccata in Parma (Italien) exhumiert. Nach dem Öffnen des Bleikastens mit den Überresten wurden die Zähne einer morphologischen Analyse unterzogen. Das Hauptmerkmal des Gebisses von Alessandro Farnese war starker Verschleiß, während die Zähne von Maria D'Aviz durch das Vorhandensein von Karies und parodontalen Erkrankungen gekennzeichnet waren24. Diese Erkenntnisse könnten mit dem unterschiedlichen Lebensstil des Adelspaares zusammenhängen: Herzog Farnese verbrachte den größten Teil seines Erwachsenenlebens auf Schlachtfeldern in ganz Europa und seine Frau pflegte die Gewohnheiten des portugiesischen Hofes in der Stadt Parma. In diesem Zusammenhang haben wir die Fähigkeit des UHPLC-HRMS im Scan-MSE-Modus getestet, um die Unterschiede im Metabolomikprofil des Zahnsteins des Herzogs und seiner Frau zu untersuchen, mit dem Endziel, neue Erkenntnisse über die Todesursachen von Alessandro Farnese zu gewinnen. sowie über die Gewohnheiten, den Gesundheitszustand und die Ernährung des Adelspaares.

Mithilfe einer HRMS-Analyse konnten die im Zahnstein des Adelspaars vorhandenen Metaboliten äußerst zuverlässig identifiziert werden. Die Fähigkeiten des Waters Synapt G2-Si HD-Massenspektrometers für die komplexe Matrixprofilierung wurden durch den Betrieb im MSE-Modus ausgenutzt: Die Verwendung einer alternativen Scanning-Erfassung von Niedrig- und Hochenergieprofilen liefert Informationen über Vorläufer- und Fragmentionen in einem einzigen Ausführung mit einem im Vergleich zu anderen datenunabhängigen Analysetechniken überlegenen Arbeitszyklus.

Aufgrund der geringen verfügbaren Probenmenge wurden die am besten geeigneten experimentellen Bedingungen sowohl für die Extraktion als auch für die Analyse vorab anhand moderner Zahnsteinproben ermittelt, indem sowohl im PI- als auch im NI-Modus gearbeitet wurde. Die Auswirkungen sowohl des Verhältnisses zwischen der wässrigen und organischen Phase für das Extraktionsverfahren als auch des Injektionsvolumens wurden untersucht: Ein Verhältnis von 1:3 wurde verwendet, um die Proteinausfällung zu induzieren und eine starke Verdünnung der extrahierten Metaboliten zu vermeiden, während 8 µL injiziert wurden Erhalten Sie ausreichende Signalintensitäten, um Messungen durchzuführen (Abb. 1). Auch hinsichtlich der Fläche ausgewählter chromatographischer Peaks wurde eine gute Wiederholbarkeit erzielt, wobei die relativen Standardabweichungen für den PI- bzw. NI-Modus stets unter 5 bzw. 7 % lagen.

UHPLC-HRMS-Chromatogramme im PI-Modus von Zahnsteinproben von: oben) Maria D'Aviz und unten) Herzog Alessandro Farnese. Säule: Atlantis Premier BEH C18 AX 1,7 μm (2,1 × 100 mm); mobile Phase: (A) Wasser + 0,1 % (v/v) Ameisensäure und (B) Acetonitril + 0,1 % (v/v) Ameisensäure; Injektionsvolumen: 8 µL.

Die hohe Anzahl von durch HRMS generierten Merkmalen ist einer der anspruchsvollsten Aspekte der ungezielten Metabolomik: In diesem Zusammenhang müssen sowohl Filterungs- als auch Datenreduktionsstrategien angewendet werden, um die signifikanten m/z-Werte für ihre anschließende Identifizierung auf der Grundlage der gemessenen Genauigkeit auszuwählen Masse sowohl der Vorläufer- als auch der Fragmentionen.

In der Zahnsteinprobe von Herzog Alessandro Farnese wurden im PI- bzw. NI-Modus insgesamt 5918 bzw. 5689 Merkmale extrahiert, während in der Probe seiner Frau Maria D'Aviz 5525 bzw. 4728 Merkmale aufgezeichnet wurden. Um die Merkmale hervorzuheben, die für die Differenzierung zwischen den Stichproben des Adelspaares verantwortlich sind, wurden für die anschließende Verarbeitung nur diejenigen verwendet, die eine gruppeninterne Variabilität von maximal 10 % aufwiesen. Zur Korrektur des Rauschpegels in den Chromatogrammen von Zahnsteinproben wurde außerdem eine minimale dreifache Änderung im Vergleich zu den Extraktions-Blindproben angewendet. Schließlich wurde ein Wert von 0,8 als Referenzwert für die statistische Leistungsanalyse festgelegt, um echte Effekte im analysierten Datensatz zu erkennen. Durch die Anwendung der oben genannten Filter wurden insgesamt 4859 Merkmale erhalten.

Die multivariate statistische Analyse wurde mithilfe der Hauptkomponentenanalyse (PCA) durchgeführt, wobei 99 % der Gesamtvarianz durch die ersten 6 PCs erklärt wurden. Wie in Abb. 2 dargestellt, wurde entlang PC1 eine gute Trennung zwischen den Zahnsteinproben von Herzog Alessandro Farnese und seiner Frau erreicht, die mehr als 87 % der Gesamtvarianz ausmachte. Eine weitere Reduzierung der Anzahl der Merkmale (4227) wurde dadurch erreicht, dass nur die Variablen dem Identifizierungsprozess unterzogen wurden, deren absoluter Wert im Belastungsdiagramm auf PC1 höher als 0,8 war (Abb. 2c).

PCA: (a) Ladediagramm und (b) Bewertungsdiagramm aller Merkmale; (c) Hervorhebung der Features mit |loading |> 0,8.

Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass für Aufklärungszwecke keine A-priori-Informationen verfügbar waren, wurde die Identifizierung der Verbindungen unter Berücksichtigung aller Informationen durchgeführt, die aus genauen Massenmessungen, Fragmentierungsstudien, der Analyse des Isotopenmusters, dem Bibliotheksabgleich und dem Score-Fit stammen.

Insgesamt wurden 217 Metaboliten verschiedener Klassen identifiziert (Tabelle S1). Sphingolipide, Glycerophospholipide und Fettacyle waren mit 132 Verbindungen die am häufigsten vorkommenden chemischen Klassen. Das Vorhandensein einer hohen Anzahl an Lipiden ist nicht überraschend: In einer früheren Studie zum modernen und alten Metabolom von Zahnstein haben Velsko et al. betonten den Einfluss der Wasserlöslichkeit auf die Konservierung von Verbindungen und gingen davon aus, dass Verbindungen, die sich durch eine hohe Wasserlöslichkeit auszeichnen, leichter abgebaut werden könnten23. Basierend auf diesen Erkenntnissen kann die unpolare Natur von Lipiden deren Erhaltung im Laufe der Zeit begünstigen. Darüber hinaus war die Anwesenheit gesättigter Fettsäuren fast doppelt so hoch wie die ungesättigter: Laut Rogoz et al.12 kann dieses Verhalten auf die verringerte oxidative Stabilität ungesättigter Verbindungen zurückgeführt werden, was zu einem leichteren Abbau führt. Elf Aminosäuren wurden nachgewiesen: Auch diese Verbindungen könnten sich im Laufe der Zeit verändern; Beispielsweise kann das Vorhandensein von Tyramin mit der Decarboxylierung von Tyrosin infolge von Fermentations- oder bakteriellen Zersetzungsprozessen zusammenhängen. Tyramin wurde hauptsächlich im Zahnstein des Herzogs Alessandro Farnese nachgewiesen. Wenn man bedenkt, dass der Herzog den größten Teil seines Lebens auf den Schlachtfeldern in Nordeuropa verbrachte, könnte das Vorhandensein von Tyramin mit dem Verzehr von haltbaren Lebensmitteln wie gewürztem Käse, getrocknetem oder geräuchertem Hering, Wildbret, Wurstwaren und fermentierten Getränken in Zusammenhang stehen25.

Unter den Verbindungen, die möglicherweise auf die Essgewohnheiten des Herzogs zurückzuführen sind, könnten Cucurbitin und Catechin 5-O-beta-d-glucopyranosid-4'-Me mit dem Verzehr typischer Lebensmittel, die auf den Tischen Nordeuropas stehen, wie Cucurbitaceae und Rhabarber, in Zusammenhang stehen26. 27. Im Gegensatz dazu können 3-Hydroxy-3-methyloxindol, Imidazolessigsäureribosid, 2-(Methylamino)-1-phenylethanol und Arginylhydroxyprolin mit den Essgewohnheiten von Maria D'Aviz in Zusammenhang gebracht werden: Laut Human Metabolome DataBase und Food DataBase (FooDB) zufolge könnten diese Verbindungen als potenzielle Biomarker für den Verzehr von Entenvögeln, Hühnern und Hausschweinen angesehen werden, und es ist bekannt, dass Maria D'Aviz Geflügel als Hauptzutat mehrerer in ihrem berühmten Kochbuch beschriebener Rezepte verwendete28.

Unter den Metaboliten, die häufig in Gewürzen und Tee vorkommen, waren Salicylaldehyd, DAG (32:4), Capsiamid, Estragol, Phenylpyridine und Eugenolchinonmethid (EQM) einige der Verbindungen, die hauptsächlich im Zahnstein von Maria D'Aviz nachgewiesen wurden. Der Verzehr dieser Lebensmittel ist nicht überraschend: Maria D'Aviz war Mitglied des portugiesischen Hofes, und die Gewürze, die im Kochbuch der Adligen häufig zitiert werden, konnten problemlos von den beiden Azoren, der wichtigsten Kolonie von, importiert werden das portugiesische Reich und Asien29.

Salicylate sind in Kräutern, Gewürzen und Tee enthalten30 und es ist bekannt, dass Extrakte von Pflanzen, die reich an Salicylaten sind, aufgrund ihrer entzündungshemmenden und fiebersenkenden Wirkung bereits in der Antike zur Behandlung verschiedener menschlicher Krankheiten eingesetzt wurden31.

Das Vorhandensein von EQM, einem Oxidationsderivat von Eugenol32,33, kann nicht nur durch die Berücksichtigung der Nahrungsaufnahme von Gewürzen wie Nelken, Muskatnuss und Zimt34 erklärt werden, sondern auch durch die entzündungshemmenden und schmerzstillenden Wirkungen von Heilmitteln auf Eugenolbasis35 zur Behandlung von Zahnschmerzen, einer Pathologie, von der Maria D'Aviz betroffen ist. Das Vorhandensein von EQM könnte jedoch auch auf die Verwendung von Essenzen zur Einbalsamierung zurückgeführt werden, eine Praxis, die im 16. Jahrhundert von den Adligen praktiziert wurde36,37. In ähnlicher Weise konnte das Vorhandensein anderer Metaboliten aus Früchten und Zitrusfrüchten wie Hesperidin, Neohesperidin, Narirutin, Naringin-Chalcon, Dihydroxycitracridon I und Amphibin H, die im Zahnstein des Adelspaares beobachtet wurden, unter Berücksichtigung sowohl der Nahrungsaufnahme als auch erklärt werden ihre Verwendung als Parfüme und Essenzen bei der Einbalsamierungspraxis.

Bezüglich des oralen Mikrobioms lassen sich einige der nachgewiesenen Verbindungen auch dem Stoffwechsel von Pilzen und Bakterien zuordnen. Ein interessantes Ergebnis hängt mit dem Vorhandensein des TMC-34-Metaboliten zusammen, der aus Actinomyces stammt, die an der Entwicklung von Parodontitis beteiligt sind38,39,40. Dieser Metabolit kam hauptsächlich im Zahnstein von Maria D'Aviz vor, und es ist bekannt, dass die adlige Frau an Karies und parodontalen Erkrankungen litt24.

Zusätzliche Metaboliten wie die Glycerophospholipide PIM1 (37:3), LPIM4 (18:2) und LPIM4 (19:2), die mit dem Bakterium Mycobacterium tuberculosis verwandt sind, wurden ebenfalls identifiziert41. Nach seinem Tod ergab die Autopsie von Herzog Alessandro Farnese das Vorliegen von Lungenerkrankungen42, was durch die Ergebnisse der Exhumierung im Jahr 202043 weiter bestätigt wurde, was auf eine Lungenentzündung schließen lässt, eine weit verbreitete Krankheit im 15. und 16. Jahrhundert44,45.

Hervorzuheben ist auch das Vorhandensein verschiedener Metaboliten von Saccharomyces cerevisiae, nämlich C16-Phytosphingosin, C20-Phytosphingosin, MIPC 42:0;O3, MIPC 40:0;O2, PI-Cer(d46:0)46, die miteinander in Zusammenhang stehen können zu Brotback- und Fermentationsprozessen im Zusammenhang mit der Weinherstellung und dem Brauen47,48. Schließlich das Vorhandensein anderer Metaboliten wie Penipacid B (2-[[N-(2-methoxy-2-methylpropyl)-C-methylcarbonimidoyl]amino]benzoesäure), Versixanthon E, Asperversin G oder 2,4,6,8 -Tetramethyl-3,4-dihydroxydec-8(9)-enolid, das aus den Pilzen Penicillium paneum, Aspergillus versicolor und Botrytis cinerea stammt, kann mit den Essgewohnheiten des Adelspaares in Zusammenhang gebracht werden. Da diese Schimmelpilze Getreide, Ölsaaten und Nüsse verunreinigen können, sind sie hauptsächlich am Verderben von Brot beteiligt49,50,51. Diese Ergebnisse legen nahe, dass auch die in der Renaissance lebenden Angehörigen der Oberschicht getrocknetes und schlecht konserviertes Brot konsumierten.

Die ungezielte Metabolomik mittels UHPLC in Verbindung mit dem Synapt G2-Si HDMS-System von Waters wurde erfolgreich zur Analyse des Metaboloms des Zahnsteins von Menschen in der Antike eingesetzt. Was die ungezielte Metabolomik von Herzog Alessandro Farnese und seiner Frau Maria D'Aviz betrifft, so ermöglicht die Fähigkeit, die Komponenten solch komplexer Proben effizient zu trennen, kombiniert mit der datenunabhängigen Erfassung durch hochauflösende MSE, die aus den untersuchten Proben erhaltene Information zu maximieren, indem beide niedrig aufgezeichnet werden -Energie- und Hochkollisionsenergieprofile für alle Verbindungen in einem einzigen Lauf. UHPLC-HRMS mit anschließender Hauptkomponentenanalyse wurde erfolgreich zur Differenzierung der Proben des Adelspaares eingesetzt und ermöglichte die Identifizierung von mehr als 200 Metaboliten, die neue Erkenntnisse über die Ernährungsgewohnheiten und den Gesundheitszustand von Herzog Alessandro Farnese und seiner Frau liefern konnten. Aus den Ergebnissen der Metabolomics-Analyse geht hervor, dass die Kombination von LC-HRMS mit PCA eine leistungsstarke Analysetechnik zur Differenzierung von Zahnstein in antiken Proben und zur Identifizierung von Metabolitenmarkern bietet, die eine wesentliche Rolle bei der Probendifferenzierung spielen, so die forensische Analyse der Überreste Das Vorhandensein von Metaboliten im Zusammenhang mit Mycobacterium tuberculosis kann als wertvoller Schritt zur Klärung der Todesursachen des Herzogs angesehen werden, während die Identifizierung von Verbindungen, die aus dem Verzehr von Nahrungsmitteln stammen, die unterschiedlichen Lebensstile des Adelspaares bestätigte.

Wasser, Acetonitril, Methanol und Ameisensäure in LC-MS-Qualität wurden von Honeywell Burdick & Jackson (Charlotte, NC, USA) bezogen. Der Leucin-Enkephalin-Standard wurde aus dem Waters TOF G2-S Sample Kit-1 (Waters, Milford, MA, USA) erhalten.

Historischer Zahnstein wurde aus den Überresten der Herzoge Alessandro Farnese und Maria D'Aviz nach ihrer Exhumierung im Jahr 2020 in der Basilika Santa Maria della Steccata (Parma, Italien) gesammelt. Notar Dr. Marco Micheli in Parma erteilte die Genehmigung für die Exhumierung und die anschließende Analyse. Während der körperlichen Untersuchung der Zähne wurde der Zahnstein des Paares unter Verwendung einer sterilen Kürette gemäß den Protokollen gesammelt, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden, und dann bis zur Analyse in Glasfläschchen aufbewahrt52,53. Gemäß den Richtlinien zur Identifizierung von Fällen, die der Ethikkommission der Region Vasta Emilia Nord (https://www.aou.mo.it/ComitatoEticoAVEN) vorgelegt werden sollen, war keine Genehmigung erforderlich.

Im Rahmen professioneller Mundhygienesitzungen wurden moderne Zahnsteinproben von vier gesunden Spendern entnommen, die zur Beurteilung sowohl der Extraktions- als auch der chromatographischen Bedingungen verwendet wurden. Gemäß den Richtlinien zur Identifizierung von Fällen, die der Ethikkommission der Region Vasta Emilia Nord (https://www.aou.mo.it/ComitatoEticoAVEN) vorgelegt werden sollen, war keine Genehmigung erforderlich. Die Probenentnahme erfolgte gemäß der Deklaration von Helsinki. Von den Spendern wurde eine Einverständniserklärung eingeholt.

Nach der Entnahme wurden sowohl historische als auch moderne Zahnsteinproben bis zur Metabolitenextraktion bei -80 °C eingefroren. Die Probenentkalkung wurde gemäß Velsko et al.23 mit geringfügiger Modifikation durchgeführt: Die Proben (20 mg) wurden vorsichtig in einem Achatmörser pulverisiert, in sterile Glasfläschchen gegeben und mit 100 μl 4 % (v/v) Ameisensäure entkalkt Wasser bei 4 °C für 18 Tage, wobei in regelmäßigen Abständen eine Ultraschallbehandlung durchgeführt wird. Proben, die einer UHPLC-HRMS-Analyse im ESI-Modus unterzogen werden sollten, wurden durch Zugabe von 15 µL einer 5 M Ammoniumhydroxidlösung neutralisiert. Abschließend wurden den Proben 300 µL einer Acetonitril/Methanol-Lösung 1:1 (v:v) zugesetzt, die 30 Minuten lang bei 12.000 × g und 4 °C zentrifugiert wurden. Der Überstand wurde dann gesammelt und der UHPLC-HRMS-Analyse unterzogen. Als Qualitätskontrollprobe wurde eine Probe verwendet, die durch Mischen der Extrakte von Herzog Alessandro Farnese und seiner Frau gewonnen wurde.

Die chromatographische Trennung wurde auf einem binären Acquity UHPLC I-Class-System (Waters) unter Verwendung einer auf 40 °C thermostatisierten Atlantis™ Premier BEH™ C18 AX 1,7 μm (2,1 × 100 mm) Säule (Waters) durchgeführt. Die mobile Phase bestand aus Wasser (Lösungsmittel A) und Acetonitril (Lösungsmittel B), die beide 0,1 % (v/v) Ameisensäure enthielten. Die Flussrate betrug 0,4 ml/min und das Injektionsvolumen betrug 8 μl. Eine mehrstufige lineare Gradientenelution wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Lösungsmittel B wurde 1 Minute lang auf 2 % eingestellt, gefolgt von einem linearen Gradienten auf 60 % innerhalb von 6 Minuten, dann auf 95 % in 1,5 Minuten, der vor der Säule 1,5 Minuten lang aufrechterhalten wurde Wiederherstellung des Gleichgewichts (5 Min.). Die Elution erfolgte innerhalb von 10 Minuten.

HRMS-Analysen wurden auf einem Synapt G2-Si HDMS QTOF-Massenspektrometer (Waters SpA, Mailand, Italien) mit einem Elektrospray-Ionisationsgerät (ESI) Zspray™ (Waters) sowohl im positiven (PI) als auch im negativen (NI) Ionenmodus durchgeführt. Die Massenkorrektur während chromatographischer Läufe wurde unter Verwendung einer Leucin-Enkephalin-Lösung (50 ng/ml in Acetonitril/Wasser, 50:50 (v/v) mit 0,1 % Ameisensäure) als Sperrmasse durch Infusion durch das LockSpray™-System (Waters) durchgeführt ) im Abstand von 15 s. Die Experimente wurden im Auflösungsmodus (20000 FWHM) durchgeführt. Die Betriebsparameter waren wie folgt: Kapillarspannung, 0,80 und 0,50 kV in ESI+ bzw. ESI−; Kegelspannung, 50 V; Quellentemperatur, 150 °C; Quellenoffset 80 V; Desolvatisierungstemperatur: 600 °C; Kegelgas, 50 l/h; Desolvatisierungsgas, 1000 l/h; Verneblerdruck 6,5 bar. Die Spektren wurden im datenunabhängigen MSE-Erfassungsmodus erfasst, indem 5 V als Kollisionsenergie für das Niedrigenergieprofil angelegt wurden und eine Kollisionsenergierampe von 25 auf 45 V für das Hochenergieprofil verwendet wurde.

Die UHPLC-HRMS-Daten wurden mit der Software MassLynx (v4.2) (Waters) in *.raw-Dateien aufgezeichnet.

Die Datenanalyse wurde durch Verarbeitung der Rohdaten in der Progenesis QI-Software (Waters, Milford, MA, USA) durchgeführt. Die Software ermöglicht die Datenvisualisierungsanalyse, die Erstellung von 2D-Karten und die Analyse von Chromatogrammen und Spektren. Das Programm bietet automatische Ausrichtung von Signalen, Peak-Peaking, Entfaltung und Normalisierung54,55. Die folgenden Addukte wurden berücksichtigt: [M+H]+, [M+Na]+, [M+K]+, [M+NH4]+, [M+H2O+H]+, [M−H2O+H] +, [M+2H]2+, [M+2Na]2+, [M+2Na−H]+, [2M+H]+, [2M+Na]+, [M+H+Na]2+ in PI und [M−H]−, [M+H2O−H]−, [M−H2O−H]−, [M+HCOO]−, [2M−H]−, [M+Na−2H] −, [M+K−2H]− in NI.

Die Daten wurden gefiltert, indem eine maximale gruppeninterne Variabilität von 10 %, ein Leistungsanalysewert > 0,8 und eine minimale fache Änderung von 3 im Vergleich zum Methodenleerwert festgelegt wurden.

PCA wurde durchgeführt, um den Datensatz zu untersuchen und die Merkmale zu erhalten, mit denen Proben von Herzog Alessandro Farnese und Maria D'Aviz unterschieden werden können. Die Identifizierung der Verbindungen erfolgte durch Vergleich der Spektren mit denen, die in verschiedenen ChemSpider-Onlinebibliotheken gespeichert sind, nämlich HMDB, FooDB, E. coli Metabolome Database, Yeast Metabolome Database, LipidMAPS, NPAtlas und KEGG Database, unter Verwendung einer Massenfehlertoleranz von 5 ppm für Vorläuferionen und 10 ppm für Fragmentionen.

Die LIPID MAPS® Glycerophospholipid-Abkürzungen (PC, PE usw.) werden hier zur Bezeichnung der identifizierten Analyten verwendet.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Die Kosten für die für diese experimentelle Untersuchung verwendete Progenesis QI-Software wurden vom Ministerium für Universität und Forschung (Ministerialdekret Nr. 737 vom 25.06.2021) unterstützt und von der Universität Parma im Rahmen des „Scientific Instrumentation Upgrade Program“ kofinanziert 2022". Diese Arbeit profitierte von der Ausstattung und dem Rahmenwerk der COMP-HUB-Initiative, die vom Programm „Departments of Excellence“ des italienischen Ministeriums für Bildung, Universität und Forschung (MIUR, 2018–2022) finanziert wird.

Abteilung für Chemie, Biowissenschaften und ökologische Nachhaltigkeit, Universität Parma, Parco Area Delle Scienze 17/A, 43124, Parma, Italien

Nicolo' Riboni, Federica Bianchi, Monica Mattarozzi und Maria Careri

Abteilung für Medizin und Chirurgie, Universitätszentrum für Zahnmedizin, Universität Parma, Via Gramsci 14, 43126, Parma, Italien

Marianna Peracchia & Marco Meleti

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Konzeptualisierung: FB, NR, M.Ma.; Untersuchung: NR, FB, M.Ma., MP, M.Me.; Methodik: NR, FB, M.Ma., MC; Schreiben – Originalentwurf: NR, FB; Schreiben – Rezension und Bearbeitung: NR, FB, M.Ma., MP, M.Me., MC

Korrespondenz mit Nicolo' Riboni oder Federica Bianchi.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Riboni, N., Bianchi, F., Mattarozzi, M. et al. Ultrahochleistungs-Flüssigkeitschromatographie und hochauflösende Massenspektrometrie zur metabolomischen Analyse von Zahnstein von Duke Alessandro Farnese und Maria D'Aviz. Sci Rep 13, 8967 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36177-2

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Eingegangen: 18. Dezember 2022

Angenommen: 30. Mai 2023

Veröffentlicht: 02. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36177-2

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